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Developmental Biology

マウス腸神経系の開発を可視化するために免疫染色

doi: 10.3791/52716 Published: April 29, 2015

Introduction

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運動、栄養吸収、およびローカルの血流を制御する機能腸管神経系(ENS)は、生命1に不可欠です。 ENSは、それらはニューロンおよびグリア細胞を含む神経節に分化腸を移動し、コロニー形成、増殖、神経堤細胞(NCC)によって形成されます。ヒルシュスプルング病(HSCR、男性でのオンラインメンデル遺伝)、1 4,000で出生の発生率とmultigeneic先天性障害は、破壊されたENSの形成を研究するためのプロトタイプの病気と考えることができます。 HSCRでは、NCCはに移動し、遠位後腸2の変数の長さを植民地化することができません。また、他の一般的な胃腸(GI)は、肛門直腸奇形、腸atresias、および運動障害などの小児集団における発達障害は、基本的なENS機能の障害と関連しており、おそらく微妙な、過小評価、解剖学的変化とで機能的変化と関連していますENS 3-6。そのため、私たちはENS形成の発達決定要因を理解することを可能にする技術は、病因および小児消化管障害の治療の可能性に光を当てることができます。

移行と植民地化の後、NCCは、それらの神経伝達物質の表現型に特異的なマーカーでニューロンに分化します。コリン作動性ニューロンは、腸溶性ニューロン7の約60%を含み、かつコリンアセチルトランスフェラーゼ(チャット)、興奮性神経伝達物質アセチルコリンのための合成酵素を染色することによって検出することができます。歴史的には、コリン作動性ニューロンを可視化する試みは、中枢神経系に対して向けられた抗体の抗原特異性(CNS)は、末梢神経系(PNS)のChAT 8-10に対してチャット異なるによって混乱しました。しかし、胎盤のChATに対する抗体は、両方の中央と周辺のChAT 11-13を認識し、我々は最近、visuaを可能にする技術が記載されています高感度のENSのコリン作動性ニューロンのlization以前の開発でチャットレポーター線14で達成されたよりも。

ここでは、ニューロンにおけるENSの神経伝達物質の発現を可視化するマウス胚GI管の、固定および免疫染色を解剖するための手法を提示します。これらの研究のために、我々は、 チャット-Creマウスを利用しているR26Rと交配:floxSTOP:チャットのCreを生成するためにtdTomato動物、R26R:floxSTOP:tdTomatoマウス (原稿全体のChAT-CreをtdTomatoと定義されます)。これらの動物は、その後のChAT発現14を検出する蛍光レポーターの両方を発現するマウスを得るために、ホモ接合のChAT-GFPレポーターマウスと交配させました。これら二つのレポーター動物は、C57BL / 6Jバックグラウンド上にあり、(ジャクソン·ラボラトリーズ、バーハーバー、ME)は、市販されています。

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Protocol

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ウィスコンシン大学の動物実験委員会は、すべての手順を承認しました。

ソリューションの調製

  1. 解剖緩衝液およびリンス液として1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用します。
  2. ボトルにスクロースおよび場所の30グラムを計量することにより、30%スクロースを準備します。 1×PBS 99 mlを加え、1mlの10%アジ化ナトリウムを追加します。ショ糖の全てが溶解するまで十分に混合します。 4℃で保存、必要になるまで。
  3. 1×PBS、3%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%トリトンX-100を混合して溶液を遮断準備。完全に混合し、必要になるまで冷蔵庫で保管してください。
  4. 1×PBS中にPFAの適切な量を秤量することによって1×PBS中の8%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製し、それが完全に溶解するまで65℃でインキュベートします。 -20℃の冷凍庫で25ミリリットルの分量を保存が必要になるまで。使用日の1×PBS中の4%PFAに希釈します。

2.胚とガット解剖イオン

  1. 制度動物実験委員会によると、タイミング妊娠マウスを安楽死させるし、PBS 1X氷冷を含む60ミリメートルペトリ皿に子宮を転送プロトコルを承認しました。
  2. 鋭いハサミを使用して、解剖顕微鏡下で、胚を露出させるオープン子宮壁をカット。子宮から胚を除去し、PBS 1X氷冷を含むクリーンな60ミリメートルペトリ皿に置きます。
  3. 氷冷1×PBS中で断頭により各胚を安楽死させます。あなたは、蛍光タンパク質を含むトランスジェニックマウスを使用している場合は、蛍光照明の下で、正のトランスジェニック胚を識別します。
  4. 解剖顕微鏡を使用して、各胚から胃腸管を解剖。微細鉗子の使用、左側が上向きにされ、右側には、ペトリ皿の底に反するような胚を方向付けます。内臓を露出させるために胚から上半身の壁を削除します。背側体壁と内臓の間に微細な鉗子を挿入します。クロム胚から内臓を除去するために、はさみ状の切断動作で互いに対して鉗子をOSS。
  5. さらに離れて周囲の器官から胃腸管をサブ解剖した後、氷冷1×PBSを含む1.5 mlマイクロチューブに各GI管を配置します。

GI地帯の3固定

  1. 氷冷1×PBSで各GI管を3回すすぎ、次いで4%PFAと交換してください。 1.5時間室温でロッキングプラットフォーム上で1.5mlの微小管における消化管を修正しました。 RTで消化管を5分間3回すすぎ、その後、ロッキングプラットフォーム上で1時間。この段階で、必要になるまで、0.1%アジ化ナトリウムを含有する1×PBS中30%スクロースに4℃でGIトラクトを格納します。
    注:別の方法として、組織の完全性に影響することなく、1年まで、30%スクロース中の胚を格納します。 30%スクロース中のサンプルの保管は、免疫染色のために、またはクライオsectioniのため10月にいずれかのサンプルの後の処理を可能にしますNG。あるいは、以下に詳述免疫染色プロトコルを進めます。

4.免疫染色プロトコル

  1. サンプルは30%スクロース中で保存されている場合は、ロッキングプラットフォーム上で、それらを1×PBSで20分間3回洗浄します。
  2. RTで1時間のためのロッキングプラットフォーム上でブロッキング溶液中に消化管を配置します。
  3. ブロッキング溶液を除去し、ロッキングプラットフォーム上で4℃でRTまたはO / Nで4時間のいずれかのためのブロッキング溶液中で希釈した一次抗体の適切な量の消化管をインキュベートします。 (患者から得られた血清)ヒト抗胡抗体1000希釈、1:ニワトリ抗緑色蛍光タンパク質(GFP)抗体1000希釈および1:ヤギ抗ChATの抗体の100倍希釈1を使用してください。
    注:私たちは、患者から局所的に得られたヒト抗胡抗体を利用したが、抗胡抗体は、例えば、市販されており、マウス抗胡、(1での使用:500希釈)。
  4. 1×PBS中の消化管をすすぎます3回5分間、その後、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間。
  5. 4℃でのRTまたはO / Nで4時間のいずれかのためのロッキングプラットフォーム上のブロッキング溶液中で1:500に希釈した二次抗体を用いて1×PBSを交換してください。このようなDylight、ロバ抗ニワトリCy2とし、ロバ抗ヤギCy5のようなロバ抗ヒトアミン反応性染料を使用してください。ロバ抗マウスアミン反応性染料405:500希釈のマウス抗胡抗体を用いた場合は、1を使用します。
    注:内因性GFPとtdTomato発現および発達年齢とともに増加して免疫染色を明確にする強さ。我々は、一般的に使用される抗体の量を低減し、また、組織の効率的な染色を確実にするために、染色溶液の150μlを、0.2 mlチューブ中に個別に胚勇気を免疫染色します。
  6. 1×PBS中の消化管に5分間、3回洗浄し、その後、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間。
  7. スライドガラス上にDAPIで蛍光封入剤を数滴を置きます。 GI TRAを浸します蛍光マウンティング培地中にCTと組織の上に直接カバーガラスを追加します。媒体-Gを取り付ける蛍光は半永久的なシールを提供する水溶性の化合物です。
    注:このようなベクタシールドなどを使用し、蛍光封入フェージングおよび抗体の光退色防止媒体を装着するベースグリセロールです。これらの製品はいずれも、組織は4℃で長期間保存することを可能にします。
  8. 共焦点顕微鏡を用いて蛍光体のそれぞれの画像をキャプチャします。 表3に示す蛍光団および使用するフィルタの励起波長を使用してください。
  9. 画像をキャプチャするために使用される共焦点の種類に応じて、適切なソフトウェアを使用して、コンピュータ支援画像解析を実行します。

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Representative Results

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我々は以前のChAT発現14を検出GFPおよびtdTomato蛍光レポーターの両方を発現するマウスの生成を記載しています。簡単に説明すると、 チャットCreマウス、R26Rと交配させた:floxSTOP:チャットのCreを生成するためにtdTomato動物; R26R:floxSTOP:(チャット-CreをtdTomatoと呼ばれる)tdTomatoマウスを。これらの動物は、その後、ホモ接合のChAT-GFPレポーターマウスと交配させました。胚を単離し、組織が ​​固定される前に切開し、 表1に記載抗体を用いて、上記のように免疫染色した。遠位小腸(SI)および近位結腸E11、E13.5およびE16.5で解析しました。

E11では、胡陽性ニューロンは、遠位SI内に存在しているが、NCCはまだ近位結腸( 図1)に達していません。この時点で、胡陽性ニューロンの大部分は、チャット免疫反応性ならびにGFP陽性を示しています。興味深いことに、この時点で、式exprのChAT-CreをtdTomato構築物のessionは検出できません。 E13.5では、胡陽性ニューロンの大部分は、チャット-IRおよびチャット-GFP陽性、チャット-CreをtdTomato陽性ニューロンの数が少ない見られているの両方です。 E16.5によるのChAT-CreをtdTomato陽性ニューロンの数が増加するが、ChATの-IRニューロンの数のごく一部であり続けています。

図1
遠位SI(ラベル「SI」)および近位結腸におけるE11で胚11日目に遠位小腸および結腸におけるコリン作動性ニューロンの図1.代表的な画像は 、胡陽性ニューロン(青)(「同時」と表示されました)この段階でSI内でのみ存在しています。ほとんどの胡陽性ニューロンは、チャット-IR(白)と共免疫染色およびチャット-GFP(緑色)しています。しかし、この時点で、これらのニューロンのいずれチャット-CreをtdTomato陽性(赤)ではありません。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
胚日目に図遠位小腸におけるコリン作動性ニューロンの2代表画像とコロンは、13.5と16.5。イメージは、コリン作動性E13.5で遠位小腸におけるニューロン(上のパネル)およびE16.5(下のパネル)を示します。 E13.5で胡陽性ニューロンの大部分は、チャット-IRおよびチャット-GFP陽性(上のパネル)でした。これらの共発現のChAT-CreをtdTomatoの数が少ないです。 E16.5によって、より多くののChAT-CreをtdTomatoニューロンが新生神経節(下のパネル)で発見されました。スケールバー=100μmである。 このFIGURの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいE。

一次抗体
抗原免疫原希釈サプライヤーと詳細
胡(ヒト神経タンパク質) 胡タンパク質 1:1,000 ヒト患者からの血清(ウィスコンシン州マディソン)
GFP(緑色蛍光タンパク質) GFPタンパク質、IgYの画分 1:1,000 鳥類研究所株式会社(タイガード、OR)、ニワトリポリクローナル、GFP-1020
チャット(コリンアセチルトランスフェラーゼ) ヒト胎盤酵素 1:100 ミリポア(ビレリカ、MA)、ヤギポリクローナル、AB144P
二次抗体
フルオロフォア希釈サプライヤーと詳細
ロバ抗ヒト Dylight 405 1:500 ジャクソン·イムノリサーチ·ラボラトリーズ(ウェストグローブ、PA)、709-475-149
ロバ抗ニワトリ CY2 1:500 ジャクソン·イムノリサーチ·ラボラトリーズ(ウェストグローブ、PA)、703-225-155
ロバ抗ヤギ Cy5で 1:500 ジャクソン·イムノリサーチ·ラボラトリーズ(ウェストグローブ、PA)、705-175-147

表1.そのサプライヤーと一緒に研究に使用される一次および二次抗体の詳細。本研究で用いた一次および二次抗体、および利用の希釈。

一次抗体
抗原希釈サプライヤー二次抗体
SOX10 午前1時50分サンタクルーズバイオテクノロジー、ダラステキサス州ロバ抗ヤギ
P75 1:250 Promega社、ウィスコンシン州マディソンロバ抗ウサギ
PGP9.5 1:1,000 アブカム、ケンブリッジ、マサチューセッツロバ抗ウサギ
BFABP 1:500 ミリポア、ビレリカ、MA ロバ抗ウサギ
S-100 1:500 DAKO、カーピンテリア、カリフォルニア州ロバ抗ウサギ
GFAP 1:500 DAKO、カーピンテリア、カリフォルニア州ロバ抗ウサギ
のnNOS 1:500〜1,000 Emson、英国ケンブリッジロバ抗ヒツジ
VIP(血管活性腸管ポリペプチド) 1:500 エプスタイン·ポールセン、ウィスコンシン州マディソンロバ抗ウサギ
サブスタンスP 1:200-400 DiaSorin、StillwateR、MN ロバ抗ヒツジ
二次抗体
希釈サプライヤーと詳細フルオロフォア
ロバ抗ヒト 1:500〜1,000 ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ、ウエストグローブ、PA Dylight 488
ロバ抗ヒト 1:1,000 ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ、ウエストグローブ、PA のCy3
ロバ抗ウサギ 1:500 ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ、ウエストグローブ、PA Dylight 488
ロバ抗ウサギ 1:500 ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ、ウエストグローブ、PA のCy3
ロバ抗ヒツジ 1:500 ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ、ウエストグローブ、PA CY2 ロバ抗ヒツジ 1:1,500 ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ、ウエストグローブ、PA のCy3
ロバ抗ヤギ 1:500 ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ、ウエストグローブ、PA のCy3

ENSの開発を研究する上での使用の表2その他の一次および二次抗体。我々は以前にENS開発の我々の研究で採用している一次および二次抗体。

励起発光
レーザー線フルオロフォアの種類光電子増倍管フィルタオプション
408 nmのアレクサフルオロ405、カスケードブルー、クマリン30、DAPI、ヘキスト、パシフィックブルー、ほとんどの量子ドット 1 BP 425から475 nmの
488 nmのグリーンアレクサフルオロ488、ATTO 488、カルセイン、Cy2と、eGFPを、FITC、オレゴングリーン、YO-PRO-1 2 BP 500〜550 nmの
561 nmのレッドアレクサフルオロ546、555、568、594、Cy3の、DiIで、DsRedを、mCherryを、フィコエリトリン(PE)、ヨウ化プロピジウム(PI)、RFP、TAMRA、tdTomato、TRITC 3 BP 570から620 nmの
638 nmの遠赤アレクサフルオロ633および647、アロ(APC)、Cy5で、TO-PRO-3 4 BP 663から738 nmの

表3.共焦点イメージング励起波長、蛍光団およびフィルタ。励起波長、検出可能な蛍光団、および用いられるフィルタが提示されています。この情報は、多色免疫蛍光のために二次抗体の組合せを選択する際に使用することができます。

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Discussion

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私たちの研究室等はHSCR腸内の欠陥があっても神経節の小腸5,15,16に、無神経節結腸に限らず、近位に延長されていないことを示しています。これらの変化はENS神経密度と神経伝達物質表現型の変化を含み、HSCRを有する患者において観察された運動障害を説明することができます。私たちは、ENS形成の決定要因を理解するための努力で上記の技術を利用しています。具体的には、これらの技術は、神経型一酸化窒素合成酵素(のnNOS)ニューロン、血管作動性腸管ポリペプチドニューロン(VIP)、ならびにコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChATの)ニューロン( 2)5 可視化するために使用されてきました。この技術の重要な利点は、免疫染色のために、または埋め込み、凍結切片のいずれかのために、後の処理のために、30%スクロース中のサンプルを保存する機能です。

腸のNCCの定着が進ん波面fとして発生しますE14.5にロムE9.5。ニューロンを識別するフー、免疫染色では、上述したように、コンピュータ支援画像解析と結合され、ニューロンの密度の定量的比較を可能にします。神経細胞密度の減少は、だけでなく、腸の運動障害13の他のモデルでは、HSCR 5の神経節の腸の一部が発見されました。 Hand2の条件欠失を有するマウスは、異なる神経伝達物質と同様に減少し、ニューロン数を発現する神経細胞の割合の変化を示しています。さらに、ノギンまたはPTENの過剰発現を有する動物は、彼らの腸6,17に沿って神経細胞密度を増加させた実証します。

ENSのニューロン間の神経伝達物質表現型のバランスがしっかりと管腔内容物の移動、血流の調節および栄養吸収のために腸の壁の協調収縮を生じ、調節されます。 NCCは、ニューロンのアイデンティティを獲得すると、時間の狭い窓の前には存在します神経伝達物質の表現型14にコミットします。我々は最近、免疫染色は、E10.5でのChAT神経伝達物質の表現型、遺伝的レポーターモデル( 例えば、チャットのCreやチャット-GFP)14で観察されたよりも前の胚の段階を識別することが示されています。さらに、免疫反応性ニューロンは開発の初期段階で、チャットニューロンはENSのさらなる神経分化を調節する役割を持っている可能性があることを示唆する結果(すべてのENSニューロンの割合など)の成人レベルに達するチャット。

一酸化窒素合成酵素(NOS)がENSに見られる主要な神経伝達物質の緩和であり、比例HSCR 5に腸に沿ってENSニューロンにおいて増加します。さらに、血管作動性腸管ペプチド(VIP)の変化は、また、筋弛緩を媒介し、腸壁に沿って血流の調節に関与する神経伝達物質は、HSCRモデル5に見出されます。これらのデータは、その理解するためにどのようにコンプを示唆していますENSのonentsがその機能を調節する、異なる神経伝達物質の系統的な検査が行われるべきです。ここに提示した技術は、容易に適切な抗体を使用してこのタイプの分析を可能にするように適合させることができます。

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Acknowledgments

この作品はアメリカの小児外科協会財団賞(AG)と健康K08DK098271(AG)の国立研究所メートがサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium azide Fisher BP9221
Bovine serum albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

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References

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マウス腸神経系の開発を可視化するために免疫染色
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Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).More

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