Introduction
Et fungerende Ente Nervous System (ENS), som kontrollerer motilitet, næringsopptak, og lokal blodstrøm, er avgjørende for livet 1. ENS er dannet av neural crest celler (NCC) som sprer, vandrer og koloniserer tarmen, hvor de differensieres til ganglia inneholder nevroner og gliaceller. Hirschsprung sykdom (HSCR, Online Mendels arvelover i Man), en multigeneic medfødt lidelse med en forekomst på 1 av 4000 levendefødte, kan betraktes som det prototypiske sykdom for å studere forstyrret ENS formasjon. I HSCR, NCC klarer å migrere til og kolonisere variable lengder av distal hindgut to. I tillegg er andre vanlige gastrointestinal (GI) utviklingsmessige defekter i den pediatriske populasjonen, for eksempel anorektal misdannelser, tarm atresias og motilitetslidelser forbundet med forstyrrelser i grunnleggende ENS funksjoner, og er sannsynligvis forbundet med subtile, underappreciated, anatomiske endringer og funksjonelle endringer iENS 3-6. Derfor kan teknikker som tillater oss å forstå utviklings determinants av ENS dannelse belyse patogenesen og potensiell behandling av pediatriske GI veislidelser.
Etter migrasjon og kolonisering, skiller NCC i nevroner med markører spesifikke for deres neurotransmitter fenotype. Kolinerge neuroner utgjør ca 60% av enteriske neuroner 7, og kan bli detektert ved farging for cholin acetyltransferase (ChAT), å syntetisere enzymet for eksitatorisk neurotransmitter acetylkolin. Historisk forsøker å visualisere kolinerge nevroner ble forvirret av ulike antigen spesifisitet av antistoffer rettet mot sentralnervesystemet (CNS) Chat versus perifere nervesystemet (PNS) Chat 8-10. Men antistoffer rettet mot morkake ChAT gjenkjenne både sentrale og perifere ChAT 11-13, og vi har nylig beskrevet teknikker som gjør det mulig for visualization av ENS kolinerge nevroner med høy følsomhet tidligere i utviklingen enn det som har blitt oppnådd med ChAT reporter linjer 14.
Her presenterer vi en teknikk for å dissekere, fikse og farging av mus embryonale mage-tarmkanalen til å visualisere ENS neurotransmitter uttrykk i nevroner. For disse studiene, har vi benyttet ChAT-Cre mus parret med R26R: floxSTOP: tdTomato dyr å produsere chat-Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato mus (definert som ChAT-Cre tdTomato hele manuskriptet). Disse dyrene ble så parret med homozygot chat-GFP reporter mus, for å få mus som uttrykker både fluorescerende reportere som gjenkjenner ChAT uttrykk 14. Disse to reporter dyr er på en C57BL / 6J bakgrunnen og er kommersielt tilgjengelig (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
The University of Wisconsin Animal Care og bruk komité godkjente alle prosedyrer.
1. Utarbeidelse av Solutions
- Bruk 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) som disseksjon buffer og skylleløsning.
- Forbered 30% sukrose ved å veie 30 g sukrose og sted i en flaske. Legg 99 ml 1x PBS og tilsett 1 ml 10% natriumazid. Bland grundig til all sukrosen oppløses. Oppbevar ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Forbered blokkeringsløsning ved å blande 1 x PBS, 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% Triton-X-100. Bland godt og oppbevar i kjøleskap inntil nødvendig.
- Forbered 8% paraformaldehyd (PFA) oppløsning i 1 x PBS ved å veie den passende mengde av PFA i 1 x PBS, og deretter inkubert ved 65 ° C inntil det er helt oppløst. Oppbevares i 25 ml porsjoner i -20 ° C fryser inntil nødvendig. Fortynn til 4% PFA i 1 x PBS på bruksdagen.
2. Embryo og Gut dissekereion
- I samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité godkjente protokoller, avlive timet gravid mus og overføre livmoren til en 60 mm petriskål med iskald 1x PBS.
- Under en disseksjon mikroskopet med skarp saks, klippe livmorveggen åpen for å avdekke embryoer. Fjern embryoene fra livmor og sted inn i en ren 60 mm petriskål med iskald 1x PBS.
- Avlive hver embryo ved halshogging i iskaldt 1x PBS. Hvis du bruker transgene mus som inneholder fluorescerende proteiner under fluorescens belysning, identifisere positive transgene embryoer.
- Dissekere mage-tarmkanalen fra hver embryo ved hjelp av et mikroskop disseksjon. Bruke fin pinsett, orientere embryoet slik at venstre side vender opp og høyre side er mot bunnen av petriskål. Fjerne overkroppen veggen fra embryo for å eksponere de indre organer. Sett fin pinsett mellom den dorsale kroppsveggen og de indre organer. CrOss tangen mot hverandre på en sakslignende skjærevirkning for å fjerne de indre organer fra embryo.
- Videre under dissekere mage-tarmkanalen bort fra de omkringliggende organer og deretter plassere hver mage-tarmkanalen i en 1,5 ml mikro tube inneholder iskald 1x PBS.
3. Fiksering av GI Traktater
- Skyll hver mage-tarmkanalen tre ganger med iskald 1x PBS og deretter erstatte med 4% PFA. Fest GI traktater i 1,5 ml mikrosentrifugerør på en gynge plattform ved RT i 1,5 time. Skyll GI traktene 3 ganger i 5 min ved romtemperatur og deretter i 1 time på vippeplattformen. På dette stadium, lagre GI traktene ved 4 ° C i 30% sukrose i 1 x PBS inneholdende 0,1% natriumazid inntil nødvendig.
MERK: Du kan også lagre embryoene i 30% sukrose i inntil ett år uten noen effekt på integriteten til vev. Lagring av prøvene i 30% sukrose tillater senere behandling av prøvene enten for farging eller i oktober for kryo-sectioning. Alternativt fortsette med farging protokollen beskrevet nedenfor.
4. Farging Protocol
- Hvis prøvene har vært lagret i 30% sukrose, skyll dem tre ganger for 20 min i 1x PBS på en gynge plattform.
- Plasser GI traktene i blokkering løsning på en gynge plattform i 1 time ved RT.
- Fjern blokkeringsløsning og inkuber GI traktene med den passende mengde av primære antistoff fortynnet i blokkeringsløsning for enten 4 timer ved romtemperatur eller O / N ved 4 ° C på en gyngende plattform. Bruk 1: 1000 fortynning av humant anti-Hu-antistoff (serum erholdt fra pasient), 1: 1000 fortynning av anti-kylling grønt fluorescerende protein (GFP) antistoff og 1: 100 fortynning av geite-anti-ChAT-antistoff.
MERK: Vi bruker et humant anti-Hu-antistoff som ble oppnådd direkte fra en pasient, men anti-Hu-antistoffer er kommersielt tilgjengelige, for eksempel, muse-anti-Hu, (bruk på 1: 500 fortynning). - Skyll GI traktene i 1x PBSTre ganger i 5 minutter og deretter i 1 time ved romtemperatur på en gyngende plattform.
- Sett på 1 x PBS med sekundære antistoff fortynnet 1: 500 i blokkeringsløsning på en gyngende plattform for enten 4 timer ved romtemperatur eller O / N ved 4 ° C. Bruk esel anti-human amin-reaktive fargestoff som Dylight, esel anti-kylling Cy2 og esel anti-geit Cy5. Hvis du bruker mus anti-Hu antistoff deretter bruke en 1: 500 fortynning av esel anti-mus amin-reaktive dye 405.
MERK: Intensiteten av endogen GFP og tdTomato uttrykk og klarhet i farging øker med utviklings alder. Vi vanligvis immunfarging av embryonale tarmene individuelt i 0,2 ml rør med 150 ul av fargeløsning for å redusere volumet av antistoffet som brukes, og også for å sikre effektiv farging av vev. - Skyll GI traktene i 1 x PBS tre ganger i 5 minutter og deretter i 1 time ved romtemperatur på en gyngende plattform.
- Legg noen dråper av fluorescens monteringsmedium med DAPI på et glass lysbilde. Fordype GI tract inn i fluorescens monteringsmedium og legge til et dekkglass direkte på toppen av vevet. Fluorescensen montering medium -G er en vannløselig forbindelse som gir en semi-permanent forsegling.
Merk: Bruk fluorescens monteringsmedium såsom Vectashield som er en glycerol basert monteringsmedium som forhindrer falming og fotobleking av antistoffer. Begge disse produkter gjør vev til å lagres i lange tidsrom ved 4 ° C. - Ta bilder av hver av fluorophore bruker en konfokal mikroskop. Bruk eksitasjonsbølgelengdene for fluoroforene og filtre ansatt presentert i tabell 3.
- Dataassistert bildeanalyse utføre ved hjelp av egnet programvare, avhengig av hvilken type konfokale brukes til å ta bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere beskrevet den generasjonen av mus som uttrykker både GFP og tdTomato fluorescerende reportere som gjenkjenner ChAT uttrykk 14. Kort fortalt ble chat-Cre mus parret med R26R: floxSTOP: tdTomato dyr å produsere chat-Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato mus (kalt ChAT-Cre tdTomato). Disse dyrene ble så parret med homozygot chat-GFP reporter mus. Embryoer ble isolert og vev ble dissekert før den blir fast og immunofarget som ovenfor, med antistoffene som er oppført i tabell 1. Den distale tynntarm (SI) og proksimal kolon ble analysert ved E11, E13.5 og E16.5
På E11, Hu-positive neuroner er til stede i den distale SI, men NCC har ennå ikke nådd den proksimale kolon (figur 1). På dette tidspunkt, de fleste av Hu-positive neuroner demonstrere ChAT immunoreaktivitet samt GFP positivitet. Interessant, på dette tidspunkt, expression av chat-Cre tdTomato konstruksjon er ikke synlig. Ved E13.5, de fleste av Hu-positive nevroner er både ChAT-IR og chat-GFP positive, og et lite antall ChAT-Grobunn tdTomato-positive nevroner blir sett. Antallet ChAT-Grobunn tdTomato-positive nevroner øker med E16.5, men fortsetter å være en liten brøkdel av antall ChAT-IR nevroner.
Figur 1. Representative Bilder av kolinerge nevroner i Distal tynntarm og tykktarm på embryonale dag 11. Ved E11, i distal SI (merket "SI") og proksimale colon (merket "Co"), Hu-positive nevroner (blå) er bare til stede i SI på dette stadiet. De fleste Hu-positive nevroner er co-immunostained med chat-IR (hvit) og chat-GFP (grønt). Men på dette tidspunktet, ingen av disse nevronene er ChAT-Cre tdTomato positive (rød). Scalebar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative Bilder av kolinerge nevroner i Distal tynntarm og tykktarm på embryonale Days 13.5 og 16.5. Bildet viser kolinerge nevroner i distal tynntarm på E13.5 (øvre paneler) og E16.5 (nedre paneler). På E13.5 flertallet av Hu-positive nevroner var ChAT-IR og chat-GFP positive (øverste panelene). Et lite antall av disse co-uttrykt ChAT-Cre tdTomato. Av E16.5 ble flere ChAT-Cre tdTomato nevroner funnet i gryende ganglia (nedre paneler). Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figure.
| Primære Antistoffer | |||
| Antigen | Immunogenet | Fortynning | Leverandør & Detaljer |
| Hu (human neuronal protein) | Hu protein | 1: 1000 | Serum fra menneskelig pasient (Madison, WI) |
| GFP (grønt fluorescerende protein) | GFP protein, IgY brøkdel | 1: 1000 | Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), Chicken polyclonal, GFP-1020 |
| Chat (Kolin acetyltransferase) | Menneskelige placenta enzym | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), geitepolyklonalt, AB144P |
| Sekundære Antistoffer | |||
| Navn | Fluorophore | Fortynning | Leverandør & Detaljer |
| Donkey anti-human Dylight 405 | 1: 500 | Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149 | |
| Donkey anti-Chicken | Cy2 | 1: 500 | Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155 |
| Donkey anti-Goat | Cy5 | 1: 500 | Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147 |
Tabell 1. Detaljer om primære og sekundære antistoffer som brukes i studien. De primære og sekundære antistoffer som brukes i denne studien, sammen med sin leverandør og fortynninger utnyttet.
| Primære Antistoffer | |||||||
| Antigen | Fortynning | Leverandør | Sekundært antistoff | ||||
| Sox10 | 01:50 | Santa Cruz Bioteknologi, Dallas, TX | Donkey anti-Goat | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, Madison WI | Donkey anti-Rabbit | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam, Cambridge, MA | Donkey anti-Rabbit | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | Donkey anti-Rabbit | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Donkey anti-Rabbit | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Donkey anti-Rabbit | ||||
| nNOS | 1: 500-1000 | Emson, Cambridge, UK | Donkey anti-Sheep | ||||
| VIP (vasoaktivt Tarm polypeptid) | 1: 500 | Epstein & Paulsen, Madison, WI | Donkey anti-Rabbit | ||||
| Substans P | 1: 200-400 | DiaSorin, Stillwater, MN | Donkey anti-Sheep | ||||
| Sekundære Antistoffer | |||||||
| Navn | Fortynning | Leverandør & Detaljer | Fluorophore | ||||
| Donkey anti-human | 1: 500-1000 | Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA | Dylight 488 | ||||
| Donkey anti-human | 1: 1000 | Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Donkey anti-Rabbit | 1: 500 | Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA | Dylight 488 | ||||
| Donkey anti-Rabbit | 1: 500 | Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Donkey anti-Sheep | 1: 500 | Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA | Cy2 | Donkey anti-Sheep | 1: 1500 | Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 |
| Donkey anti-Goat | 1: 500 | Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
Tabell 2. Tilleggs primære og sekundære antistoffer for bruk i å studere ENS utvikling. De primære og sekundære antistoffer som vi tidligere har benyttet i våre studier av ENS utvikling.
| Eksitasjon | Utslipps | |||
| Laser Linje | Fluorophore Type | Eksempler | Fotomultiplikatorrør | Filteralternativer |
| 408 nm | Blå | Alexa Fluor 405, Cascade Blå, kumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, de fleste kvanteprikker | 1 | BP 425-475 nm |
| 488 nm | Grønn | Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, EGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1 | 2 | BP 500-550 nm |
| 561 nm | Rød | Alexa Fluor 546, 555, 568, og 594, Cy3, DII, DsRed, mCherry, Phycoerythrin (PE), Propidium Jod (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | BP 570-620 nm |
| 638 nm | Far Red | Alexa Fluor 633 og 647, allofykocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 nm |
Tabell 3. Confocal bildebehandling eksitasjonsbølgelengdene, fluoroforer og filtre. Er de eksitasjonsbølgelengdene, påvisbare fluoroforer og filtre ansatt presentert. Denne informasjonen kan brukes til å velge kombinasjoner av sekundære antistoffer for flerfarget immunofluoresence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt laboratorium og andre har vist at intestinale mangler i HSCR ikke er begrenset til aganglionic tykktarmen, men utvidet proksimalt, selv inn i det ganglionated tynntarmen 5,15,16. Disse endringene omfatter endringer i ENS neuronal tetthet og nevrotransmitter fenotype, og kan utgjøre dysmotility som har blitt observert hos pasienter med HSCR. Vi har utnyttet de ovennevnte teknikker i arbeidet med å forstå de faktorer som bestemmer ENS formasjon. Nærmere bestemt har disse teknikker blitt anvendt for å visualisere nevronale nitrogenoksid syntase (nNOS) neuroner, vasoaktivt intestinalt polypeptid nevroner (VIP), så vel som cholin acetyltransferase (ChAT) nevroner (Tabell 2) 5. En viktig fordel med denne teknikken er evnen til å lagre prøver i 30% sukrose for senere behandling, enten for farging eller for innstøping og cryosectioning.
NCC kolonisering av tarmen oppstår som en fremrykkende bølgefront from E9.5 å E14.5. Immunofarging med Hu, som identifiserer neuroner, slik som beskrevet ovenfor, kombinert med datamaskinassistert bildeanalyse, tillater kvantitative sammenligninger av neuronal tetthet. Reduksjoner i neuronal tettheten er funnet deler av ganglionated tarm av HSCR 5, samt i andre modeller av tarm dysmotility 13. Mus med en betinget sletting av Hand2 viser endringer i andelen av nerveceller som uttrykker ulike nevrotransmittere samt reduserte nevronale tall. I tillegg dyr med over-uttrykk for Noggin eller PTEN demonstrere økt nevronale tetthet langs deres tarm 6,17.
Balansen av neurotransmitter fenotyper blant neuroner fra ENS er strengt regulert, noe som resulterer i koordinert kontraksjon av tarmveggen for bevegelse av luminal innhold, regulering av blodstrømmen og næringsopptak. Når NCC skaffe en neuronal identitet, er det et kort tidsrom førbinde seg til en nevrotransmitter fenotype 14. Vi har nylig vist at immunofarging identifiserer en prat neurotransmitter fenotype ved E10.5, en tidligere fosterstadiet enn observert med genetiske reporter modeller (f.eks, chat-Cre eller chat-GFP) 14. I tillegg Chat immunreaktive nevroner nå voksne nivåer (som andel av alle ENS nevroner) tidlig i utviklingen, et resultat som tyder på at chat nevroner kan ha en rolle i å regulere ytterligere neuronal differensiering i ENS.
Nitrogenoksid syntase (NOS) er den primære avslapning neurotransmitter funnet i ENS, og er proporsjonalt økt i ENS neuroner langs tarmen i HSCR 5. I tillegg, endringer i vasoaktivt intestinalt peptid (VIP), en nevrotransmitter som også deltar i å mediere muskelavslapning og regulere blodstrømmen langs tarmveggen, blir funnet i HSCR modeller 5. Disse dataene antyder at for å forstå hvordan komponents av ENS regulere dens funksjon, bør en systematisk undersøkelse av ulike nevrotransmittere foretas. Teknikkene er presentert her, kan lett tilpasses for å tillate denne typen analyse ved bruk av de aktuelle antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet stipulert American Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) og National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
