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Developmental Biology

Immunostaining para Visualize Murino desenvolvimento do sistema nervoso entérico

doi: 10.3791/52716 Published: April 29, 2015

Introduction

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Um funcionamento do sistema nervoso entérico (ENS), que controla a motilidade, a absorção de nutrientes e fluxo sanguíneo local, é essencial para a vida 1. O SNE é formado por células da crista neural (NCC) que proliferam, migram e colonizar o intestino, onde se diferenciam em gânglios contendo neurónios e células gliais. Doença de Hirschsprung (HSCR, on-line Mendelian Inheritance in Man), uma desordem congênita multigeneic com uma incidência de 1 em 4.000 nascidos vivos, pode ser considerada a doença prototípica para estudar a formação ENS interrompido. Em HSCR, NCC não conseguem migrar para colonizar e comprimentos variáveis ​​do intestino posterior distal 2. Além disso, outro gastrointestinal comum (GI) defeitos de desenvolvimento na população pediátrica, como malformações anorretais, atresias intestinais e distúrbios de motilidade são associados a distúrbios nas funções básicas ENS, e estão provavelmente associados à subtis, subvalorizado, alterações anatômicas e alterações funcionaiso 3-6 ENS. Portanto, as técnicas que nos permitem entender os determinantes do desenvolvimento da formação ENS pode lançar luz sobre a patogênese e potencial tratamento de distúrbios do trato GI pediátricos.

Na sequência de migração e colonização, NCC diferencia em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo neurotransmissor. Os neurónios colinérgicos representam cerca de 60% ​​de neurónios entéricos 7, e pode ser detectado por coloração para colina acetiltransferase (ChAT), a enzima de síntese para a acetilcolina neurotransmissor excitatório. Historicamente, as tentativas para visualizar os neurónios colinérgicos foram confundidos pela diferindo a especificidade do antigénio dos anticorpos dirigidos contra o sistema nervoso central (SNC) contra a ChAT sistema nervoso periférico (SNP) ChAT 8-10. No entanto, os anticorpos dirigidos contra placentária ChAT reconhecer tanto ChAT central e periférica 11-13, e temos técnicas recentemente descritos que permitem a visuazação da ENS neurônios colinérgicos com alta sensibilidade anteriormente no desenvolvimento do que foi alcançado com linhas de chat repórter 14.

Aqui, nós apresentamos uma técnica para dissecar, fixação e imunomarcação do murino tracto GI embrionário para visualizar ENS expressão de neurotransmissores nos neurônios. Para estes estudos, nós utilizamos ratos chat-Cre acasalaram com R26R: animais tdTomato para produzir chat-Cre; R26R:: floxSTOP ratos tdTomato (definidos como chat-Cre tdTomato em todo o manuscrito): floxSTOP. Estes animais foram depois acasalados com ratinhos repórter ChAT-GFP homozigóticos, para obter ratinhos que expressam ambos os repórteres fluorescentes que detectam expressão ChAT em ​​14. Esses dois animais repórter estão em um fundo C57BL / 6J e estão comercialmente disponíveis (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

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Protocol

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A Universidade de Wisconsin Animal Care e do Comitê Use aprovado todos os procedimentos.

1. Preparação de Soluções

  1. Use fosfato 1x solução salina tamponada (PBS) como tampão de dissecção e uma solução de enxaguamento.
  2. Prepare a 30% de sacarose por pesagem de 30 g de sacarose e em lugar de uma garrafa. Adicionar 99 ml de PBS 1x e adicionar azida de sódio a 1 ml de 10%. Misturar bem até que toda a sacarose é dissolvido. Armazenar a 4 ° C até serem necessárias.
  3. Preparar a solução de bloqueio através da mistura de 1x PBS, 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de Triton-X-100. Misture bem e guarde na geladeira até ser necessário.
  4. Preparar solução a 8% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x por pesagem da quantidade apropriada de PFA em PBS 1x e, em seguida, incuba-se a 65 ° C até que esteja completamente dissolvido. Armazenar em alíquotas de 25 ml no congelador a -20 ° C até ser necessário. Diluir a 4% de PFA em PBS 1x no dia da utilização.

2. Embryo e Gut Dissectíon

  1. De acordo com o Animal Care Institucional e Comitê de Uso protocolos aprovados, eutanásia rato grávida cronometrado e transferir o útero em um 60 milímetros placa de Petri contendo gelada 1x PBS.
  2. Sob um microscópio de dissecção com uma tesoura afiada, cortar a parede uterina aberto para expor os embriões. Remova os embriões do útero e lugar em um ambiente limpo 60 milímetros placa de Petri contendo gelada 1x PBS.
  3. Euthanize cada embrião por decapitação em 1x PBS gelado. Se você estiver usando ratinhos transgénicos que contenham proteínas fluorescentes, sob iluminação fluorescente, identificar os embriões transgênicos positivos.
  4. Dissecar o tracto GI de cada embrião utilizando um microscópio de dissecção. Usando fórceps finos, orientar o embrião de tal modo que o lado esquerdo está virado para cima e o lado direito é contra o fundo da placa de Petri. Remover a parede superior do corpo do embrião para expor os órgãos internos. Inserir uma pinça fina entre a parede do corpo dorsal e os órgãos internos. CrOss fórceps uns contra os outros em uma acção de corte do tipo tesoura para remover os órgãos internos do embrião.
  5. Outras sub-dissecar o tracto GI para cima dos órgãos circundantes e, em seguida, colocar cada tracto GI para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo gelada PBS 1x.

3. Fixação de GI Tracts

  1. Lavar cada trato GI 3 vezes com 1x PBS gelado e depois substituir com PFA 4%. Fixar os tractos gastrointestinais nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sobre uma plataforma de agitação à TA durante 1,5 h. Lavar os tractos gastrointestinais 3 vezes durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida durante 1 h na plataforma de agitação. Nesta fase, armazenar os trato gastrointestinal, a 4 ° C em 30% de sacarose em 1x PBS contendo azida de sódio a 0,1% até ser necessário.
    NOTA: Como alternativa, armazenar os embriões em 30% de sacarose até um ano, sem qualquer efeito sobre a integridade dos tecidos. Armazenamento das amostras em 30% de sacarose permite o processamento posterior das amostras ou para immunostaining ou em outubro para crio-sectioning. Como alternativa, prosseguir com o protocolo immunostaining detalhado abaixo.

4. Protocolo Immunostaining

  1. Se as amostras foram armazenadas em 30% de sacarose, enxaguar três vezes durante 20 minutos em 1x PBS numa plataforma oscilante.
  2. Colocar os tractos gastrointestinais em solução numa plataforma oscilante durante 1 h à TA bloqueio.
  3. Remover a solução de bloqueio e incubar os tratos GI, com a quantidade adequada de anticorpos primários diluídos em solução, quer por 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C numa plataforma oscilante bloqueio. Use 1: 1000 de diluição de anticorpo anti-Hu humana (soro obtido a partir do paciente), 1: 1000 de diluição de frango anticorpo anti-proteína verde fluorescente (GFP) e diluição 1: 100 de anticorpo de cabra anti-ChAT.
    NOTA: Nós utilizamos um anticorpo anti-Hu humano que foi obtido localmente a partir de um paciente, no entanto, os anticorpos anti-Hu estão disponíveis comercialmente, por exemplo, de ratinho anti-Hu, (utilização a diluição 1: 500).
  4. Lavar as trato gastrointestinal em 1x PBS3 vezes durante 5 min e depois durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
  5. Substituir o 1x PBS com anticorpos secundários diluídos 1: 500 em solução numa plataforma oscilante ou 4 horas para o bloqueio à TA ou O / N a 4 ° C. Use corante amino-reactivo anti-humana de burro como DyLight, burro Cy2 anti-frango e de burro anti-cabra Cy5. Se o rato utilizando anticorpo anti-Hu, em seguida, usar uma diluição de 1: burro anti-rato de amina de corante reactivo 405 500.
    NOTA: A intensidade da GFP e expressão endógena tdTomato e a clareza de imunocoloração aumento com a idade de desenvolvimento. Nós normalmente imunocoloração tripas embrionárias individualmente em tubos de 0,2 ml com 150 ul de solução de coloração, a fim de reduzir o volume de anticorpo utilizado e também para assegurar a coloração eficaz do tecido.
  6. Lavar os tractos gastrointestinais em 1X PBS 3 vezes durante 5 min e depois durante 1 h à TA em plataforma oscilante.
  7. Coloque algumas gotas de fluorescência meio de montagem com DAPI numa lâmina de vidro. Mergulhe os tra GICT para o meio de montagem de fluorescência e adicionar uma tampa de vidro directamente em cima do tecido. A fluorescência média de montagem -G é um composto solúvel em água que proporciona uma vedação semi-permanente.
    NOTA: Use meio de montagem de fluorescência, como Vectashield que é uma base de glicerol meio que evita o desbotamento e fotodegradação de anticorpos de montagem. Ambos os produtos permitem tecidos para ser armazenado por longos períodos de tempo, a 4 ° C.
  8. Captar imagens de cada um fluoróforo utilizando um microscópio confocal. Use comprimentos de onda de excitação de fluoróforos e filtros empregues apresentados na Tabela 3.
  9. Executar análise de imagem assistida por computador, utilizando software apropriado, dependendo do tipo de confocal usado para capturar imagens.

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Representative Results

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Descrevemos previamente a geração de ratinhos que expressam GFP e ambos tdTomato repórteres fluorescentes que detectam expressão ChAT em ​​14. Resumidamente, os ratos chat-Cre foram acasalados com R26R: floxSTOP: animais tdTomato para produzir chat-Cre; R26R: ratos tdTomato (chamados chat-Cre tdTomato): floxSTOP. Estes animais foram depois acasalados com ratinhos repórter ChAT-GFP homozigóticos. Os embriões foram isolados e os tecidos foram dissecados, antes de ser fixo e imunocoradas como acima, com os anticorpos listados na Tabela 1. O intestino delgado distai (SI) e cólon proximal foram analisadas em E11, E13.5 e E16.5

No E11, neurônios Hu-positivos estão presentes dentro do SI distal, mas NCC ainda não atingiram o cólon proximal (Figura 1). Neste ponto de tempo, a maioria dos neurónios Hu-positivos demonstrar a imunorreactividade da ChAT como a GFP positividade. É interessante notar, neste ponto do tempo, exprESSÃO do tdTomato construção chat-Cre não é detectável. Por E13.5, a maioria dos neurônios Hu-positivos são são vistos tanto ChAT-IR e chat-GFP positivas, e um pequeno número de chat-Cre neurônios tdTomato-positivos. O número de chat-Cre neurônios tdTomato-positivos aumenta em E16.5, mas continua a ser uma pequena fração do número de neurónios ChAT-IR.

Figura 1
Figura 1. As imagens representativas de Cholinergic Os neurônios no Distal intestino delgado e cólon em Embryonic Dia 11. No E11, no distal SI (identificado como "SI") e cólon proximal (identificado como "Co"), os neurônios Hu-positivos (azul) só estão presentes dentro do SI nesta fase. A maioria dos neurônios Hu-positivos são co-imunocoradas com ChAT-IR (branco) e chat-GFP (verde). No entanto, nesta altura, nenhum destes neurónios ChAT-Cre são tdTomato positivo (vermelho). Escalabar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Imagens representativas de Cholinergic Os neurônios no Distal intestino delgado e cólon em embrionárias Dias 13,5 e 16,5. A imagem mostra neurônios colinérgicos no intestino delgado distal na E13.5 (painéis superiores) e E16.5 (painéis inferiores). No E13.5 a maioria dos neurônios Hu-positivos eram ChAT-IR e chat-GFP (painéis superiores) positivos. Um pequeno número destes co-expressa chat-Cre tdTomato. Por E16.5, mais neurônios chat-Cre tdTomato foram encontrados em gânglios nascente (painéis inferiores). Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figure.

Anticorpos Primários
Antígeno Immunogen Diluição Fornecedor e detalhes
Hu (proteína neuronal humano) Proteína Hu 1: 1000 O soro do paciente humano (Madison, WI)
GFP (proteína fluorescente verde) Proteína GFP, fracção IgY 1: 1000 Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), Frango policlonal, GFP-1020
Bate-Papo (colina acetiltransferase) Enzima de placenta humana 1: 100 Millipore (Billerica, MA), cabra policlonal, AB144P
Os anticorpos secundários
Nome Fluororo Diluição Fornecedor e detalhes
Burro anti-humano DyLight 405 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149
Donkey anti-galinha Cy2 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155
Anti-cabra Donkey Cy5 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147

Tabela 1. Dados de anticorpos primários e secundários utilizados no estudo. Os anticorpos primários e secundários utilizados neste estudo, juntamente com os seus fornecedores e as diluições utilizadas.

Anticorpos Primários
Antígeno Diluição Fornecedor Anticorpo secundário
SOX10 01:50 Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX Anti-cabra Donkey
p75 1: 250 Promega, Madison, WI Burro anti-coelho
PGP9.5 1: 1000 Abcam, Cambridge, MA Burro anti-coelho
BFABP 1: 500 Millipore, Billerica, MA Burro anti-coelho
S-100 1: 500 DAKO, Carpinteria, CA Burro anti-coelho
GFAP 1: 500 DAKO, Carpinteria, CA Burro anti-coelho
nNOS 1: 500-1.000 Emson, Cambridge, Reino Unido Donkey anti-Carneiro
VIP (Intestinal Vasoativo Polypeptide) 1: 500 Epstein e Paulsen, Madison, WI Burro anti-coelho
Substância P 1: 200-400 DiaSorin, Stillwater, MN Donkey anti-Carneiro
Os anticorpos secundários
Nome Diluição Fornecedor e detalhes Fluororo
Burro anti-humano 1: 500-1.000 Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA DyLight 488
Burro anti-humano 1: 1000 Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA Cy3
Burro anti-coelho 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA DyLight 488
Burro anti-coelho 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA Cy3
Donkey anti-Carneiro 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA Cy2 Donkey anti-Carneiro 1: 1500 Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA Cy3
Anti-cabra Donkey 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA Cy3

Tabela 2. Anticorpos adicionais primárias e secundárias de utilização no estudo do desenvolvimento Ens. Os anticorpos primários e secundários que tenham anteriormente empregues nos nossos estudos de desenvolvimento Ens.

Excitação Emissão
Linha Laser Tipo fluororo Exemplos Fotomultiplicador Tubo Opções de filtro
408 nm Azul Alexa Fluor 405, Cascade azuis, a cumarina 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, a maioria dos pontos quânticos 1 BP 425-475 nm
488 nm Verde Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Verde, YO-PRO-1 2 BP 500-550 nm
561 nm Vermelho Alexa Fluor 546, 555, 568, e 594, Cy3, DII, DsRed, mCherry, Ficoeritrina (PE), o iodo de propídio (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC 3 BP 570-620 nm
638 nm Far Red Alexa Fluor 633 e 647, aloficocianina (APC), Cy5, TO-PRO-3 4 BP 663-738 nm

Tabela 3. comprimentos de onda de excitação de imagem confocal, fluoróforos e filtros. Os comprimentos de onda de excitação, fluoróforos detectáveis, e os filtros utilizados são apresentados. Esta informação pode ser utilizada na escolha de combinações de anticorpos secundários para multicolor imunofluorescência.

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Discussion

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O nosso laboratório e outros mostraram que defeitos intestinais em HSCR não são restritas para o cólon proximal alargada aganglionic mas, mesmo para o intestino delgado ganglionados 5,15,16. Estas alterações incluem modificações nas ENS densidade neuronal e fenótipo neurotransmissor e podem ser responsáveis ​​pela dismotilidade que tem sido observada em pacientes com HSCR. Nós utilizamos as técnicas acima em nossos esforços para entender os determinantes da formação ENS. Especificamente, estas técnicas têm sido empregues para visualizar sintase do óxido nítrico (nNOS) neurónios neuronais, vasoactivos neurónios de polipéptido intestinal (VIP), bem como de acetiltransferase de colina (ChAT) neurónios (Tabela 2) 5. Uma das principais vantagens desta técnica é a capacidade de armazenar amostras em 30% de sacarose para processamento posterior, quer para immunostaining ou para a incorporação e cryosectioning.

NCC colonização do intestino ocorre como uma frente de onda avança from E9.5 para E14.5. A imunocoloração com Hu, que identifica os neurónios, tal como descrito acima, juntamente com a análise de imagem assistida por computador, permite comparações quantitativas da densidade neuronal. As reduções na densidade neuronal são encontradas porções do intestino ganglionados de HSCR 5, bem como em outros modelos de dismotilidade intestinal 13. Ratos com uma deleção condicional de HAND2 demonstrar mudanças nas proporções de neurônios que expressam neurotransmissores diferentes, bem como os números neuronais reduzidos. Além disso, os animais com a sobre-expressão de Noggin PTEN ou demonstram um aumento da densidade neuronal ao longo do seu intestino 6,17.

O saldo de fenótipos de neurotransmissores entre os neurônios da ENS é rigidamente controlado, resultando em contração coordenada da parede do intestino para a circulação de conteúdos luminais, regulação do fluxo sanguíneo e absorção de nutrientes. Uma vez NCC adquirir uma identidade neuronal, existe uma estreita janela de tempo antes decomprometendo-se a um fenótipo neurotransmissor 14. Temos demonstrado recentemente que immunostaining identifica um neurotransmissor fenótipo bate-papo na E10.5, um estágio embrionário mais cedo do que observado com modelos repórter genéticas (por exemplo, bate-papo ou chat-Cre-GFP) 14. Além disso, chat neurônios imunorreativos atingir níveis adultos (como proporção de todos os neurônios ENS) no início do desenvolvimento, um resultado que sugere que os neurônios bate-papo podem ter um papel na regulação maior diferenciação neuronal no ENS.

Óxido nítrico sintase (NOS) é o neurotransmissor relaxamento primária encontrada na ENS, e que é proporcionalmente aumentada nos neurônios ENS ao longo do intestino em HSCR 5. Além disso, alterações na peptídeo intestinal vasoactivo (VIP), um neurotransmissor que também participa na mediação da relaxação do músculo e a regulação do fluxo de sangue ao longo da parede do intestino, são encontrados em modelos HSCR 5. Estes dados sugerem que, a fim de entender como o components da ENS regular a sua função, um exame sistemático dos neurotransmissores diferentes devem ser realizadas. As técnicas aqui apresentadas pode ser facilmente adaptado para permitir que este tipo de análise através da utilização de anticorpos apropriados.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado bythe Academia Americana de Pediatria Cirúrgica Award Foundation (AG) e os Institutos Nacionais de Saúde K08DK098271 (AG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium azide Fisher BP9221
Bovine serum albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

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References

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Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).More

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).

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