Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Immunofärgning att Visualisera Murin enteriska nervsystemet Utveckling

doi: 10.3791/52716 Published: April 29, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En fungerande enteriska nervsystemet (ENS), som kontrollerar motilitet, absorptionen av näringsämnen, och lokalt blodflöde, är nödvändigt för liv 1. Den ENS bildas av neurallist celler (NCC) som förökar sig, migrera och kolonisera tarmen, där de differentiera till ganglier innehåller neuroner och gliaceller. Hirschsprungs sjukdom (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), en multigeneic medfödd sjukdom med en incidens på 1 på 4.000 levande födda, kan anses vara prototypiska sjukdomen för att studera störs ENS bildning. I HSCR NCC inte att migrera till och kolonisera varierande längder av den distala hindgut 2. Dessutom är andra vanliga gastrointestinal (GI) utvecklings defekter i den pediatriska populationen, såsom anorektala missbildningar, tarm atresias och motilitetsstörningar i samband med störningar i grundläggande ENS funktioner, och sannolikt i samband med subtila, underappreciated, anatomiska förändringar och funktionella förändringar iENS 3-6. Därför kan tekniker som gör det möjligt för oss att förstå utvecklings faktorerna för ENS bildning belysa patogenesen och potentiell behandling av pediatriska GI vägssjukdomar.

Efter migration och kolonisation, skiljer NCC till nervceller med markörer som är specifika för deras signalsubstans fenotyp. Kolinerga neuroner utgör cirka 60% av enter neuroner 7, och kan detekteras genom färgning för kolinacetyltransferas (chatt), den syntetiserande enzym för den excitatoriska neurotransmittorn acetylkolin. Historiskt, försök att visualisera kolinerga neuron förvirrad av olika antigen specificitet antikroppar riktade mot centrala nervsystemet (CNS) ChAT kontra perifera nervsystemet (PNS) ChAT 8-10. Men antikroppar riktade mot placental ChAT erkänna både centrala och perifera ChAT 11-13, och vi har nyligen beskrivit tekniker som gör det möjligt för videoanläggningsering av ENS kolinerga neuron med hög känslighet tidigare i utvecklingen än vad som uppnåtts med chatt reporter linjer 14.

Här presenterar vi en teknik för att dissekera, fastställande och immunfärgning av mus embryonala mag-tarmkanalen för att visualisera ENS signalsubstans uttryck i nervceller. För dessa studier har vi använt ChAT-Cre möss parat sig med R26R: floxSTOP: tdTomato djur att producera ChAT-Cre, R26R: floxSTOP: tdTomato möss (definierade som chatt-Cre tdTomato hela manuskriptet). Dessa djur sedan parades med homozygota ChAT-GFP reporter möss, för att erhålla möss som uttrycker både fluorescerande reportrar att upptäcka ChAT uttryck 14. Dessa två reporter djur är på en C57BL / 6J bakgrund, och är kommersiellt tillgängliga (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

University of Wisconsin Djurvård och användning kommittén godkände alla förfaranden.

1. Beredning av lösningar

  1. Använd 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som dissektion buffert och sköljning lösning.
  2. Förbered 30% sackaros genom att väga 30 g sackaros och plats i en flaska. Lägg 99 ml 1x PBS och tillsätt 1 ml 10% natriumazid. Blanda omsorgsfullt tills allt av sackarosen har lösts upp. Förvaras vid 4 ° C tills de behövdes.
  3. Bered Blockeringslösning genom att blanda 1 x PBS, 3% bovint serumalbumin (BSA) och 0,1% Triton-X-100. Blanda väl och förvara i kylskåp fram till användning.
  4. Förbered 8% paraformaldehyd (PFA) lösning i 1 x PBS genom att väga den lämpliga mängden av PFA i 1 x PBS och därefter inkubera vid 65 ° C tills det är helt upplöst. Förvaras i 25 ml alikvoter i -20 ° C frys tills de behövdes. Späd till 4% PFA i 1 x PBS på användningsdagen.

2. Embryo och Gut Dissekerajon

  1. I enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén godkända protokoll, avliva tids gravid mus och överföra livmodern i en 60 mm petriskål med iskall 1x PBS.
  2. Enligt en dissektion mikroskop med vassa saxar, skär livmoderväggen öppen för att exponera embryon. Ta bort embryon från livmodern och plats i en ren 60 mm petriskål med iskall 1x PBS.
  3. Euthanize varje embryo genom halshuggning i iskall 1x PBS. Om du använder transgena möss innehållande fluorescerande proteiner under fluorescensbelysning, identifiera de positiva transgena embryon.
  4. Dissekera GI-kanalen från varje embryo med användning av ett dissektionsmikroskop. Med fin pincett, orientera embryot så att den vänstra sidan är vänd uppåt och den högra sidan är mot botten av petriskålen. Ta bort överkroppen väggen från embryot för att exponera de inre organen. Sätt fin pincett mellan rygg kroppen väggen och de inre organen. CrOSS tången mot varandra i en saxliknande skärverkan för att ta bort de inre organen från embryot.
  5. Ytterligare under dissekera mag-tarmkanalen från de omgivande organ och sedan placera varje mag-tarmkanalen i en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande iskall 1x PBS.

3. Fixering av GI Tracts

  1. Skölj varje mag-tarmkanalen 3 gånger med iskall 1x PBS och sedan ersätta med 4% PFA. Fäst GI skrifter i 1,5 ml mikrocentrifugrör på en gungande plattform vid rumstemperatur under 1,5 timmar. Skölj GI skrifter 3 gånger under 5 min vid RT och sedan under en timme på skakplattform. I detta skede, lagra GI skrifter vid 4 ° C i 30% sackaros i 1 x PBS innehållande 0,1% natriumazid tills det behövs.
    OBS: Alternativt, lagra embryon i 30% sackaros under upp till ett år utan någon effekt på integriteten hos vävnaderna. Lagring av prover i 30% sackaros möjliggör senare behandling av proverna antingen för immun eller i oktober för Cryo-sectioning. Alternativt, gå vidare med immun protokollet beskrivs nedan.

4. Immunfärgning protokoll

  1. Om proverna har lagrats i 30% sackaros, skölj dem tre gånger under 20 min i 1 x PBS på en gungande plattform.
  2. Placera GI skrifter i blockerande lösningen på en gungande plattform under 1 h vid RT.
  3. Avlägsna den blockerande lösningen och inkubera GI skrifter med den lämpliga mängden av primära antikroppar utspädda i blockeringslösning för antingen 4 timmar vid rumstemperatur eller O / N vid 4 ° C på en vaggande plattform. Använd 1: 1000 utspädning av human anti-Hu antikropp (serum erhållet från patienten), 1: 1000 utspädning av kyckling anti-grönt fluorescerande protein (GFP) antikropp och 1: 100 utspädning av get-anti-ChAT antikropp.
    OBS: Vi använder en human anti-Hu-antikropp som erhölls lokalt från en patient, men anti-Hu-antikroppar är kommersiellt tillgängliga, till exempel mus-anti-Hu, (använd på ett: 500 utspädning).
  4. Skölj GI skrifter i 1x PBS3 gånger för 5 min och därefter under 1 h vid RT på en gungande plattform.
  5. Ersätt 1x PBS med sekundära antikroppar utspädda 1: 500 i blockeringslösning på en gungande plattform för antingen 4 timmar vid rumstemperatur eller O / N vid 4 ° C. Använd åsna anti-human aminreaktiva färgämne, såsom Dylight, åsna anti-kyckling Cy2 och åsna anti-get Cy5. Om du använder musen anti-Hu antikropp sedan använda en 1: 500 utspädning av åsna anti-mus amin reaktivt färgämne 405.
    OBS: Intensiteten av den endogena GFP och tdTomato uttryck och tydligheten i immunfärgning ökning med utvecklingsålder. Vi immunostain typiskt embryonala tarmar individuellt i 0,2 ml rör med 150 pl färglösningen i syfte att minska mängden antikropp som användes och även att säkerställa effektiv färgning av vävnaden.
  6. Skölj GI skrifter i 1x PBS tre gånger under 5 min och därefter under 1 h vid RT på en gungande plattform.
  7. Placera några droppar fluorescens monteringsmedium med DAPI på en glasskiva. Sänk GI tract i fluorescensen monteringsmedium och lägga ett täckglas direkt ovanpå vävnaden. Fluorescensen monteringsmedium -G är en vattenlöslig förening som tillhandahåller en halvpermanent tätning.
    OBS: Använd fluorescens monteringsmedium som Vectashield som är en glycerolbaserat monteringsmedel som förhindrar blekning och fotoblekning av antikroppar. Båda dessa produkter gör det möjligt vävnader som skall lagras under långa tidsperioder vid 4 ° C.
  8. Ta bilder av var och en av fluoroforen med en konfokalmikroskop. Använd excitationsvåglängder för fluoroforer och filter som används som presenteras i tabell 3.
  9. Utför datorstödd bildanalys med hjälp av lämplig mjukvara, beroende på vilken typ av konfokala används för att ta bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har tidigare beskrivit generation av möss som uttrycker både GFP och tdTomato fluorescerande reportrar att upptäcka ChAT uttryck 14. I korthet var chat-Cre möss parat sig med R26R: floxSTOP: tdTomato djur för att producera ChAT-Cre, R26R: floxSTOP: tdTomato möss (kallas ChAT-Cre tdTomato). Dessa djur sedan parades med homozygota ChAT-GFP reporter möss. Embryon isolerades och vävnaderna dissekerades innan de fasta och immunofärgades såsom ovan, med de antikroppar som förtecknas i tabell 1. Den distala tunntarmen (SI) och proximala kolon analyserades vid E11, E13.5 och E16.5

På E11, Hu-positiva neuroner förekommer inom den distala SI, men NCC har ännu inte nått den proximala kolon (Figur 1). Vid denna tidpunkt, majoriteten av Hu-positiva neuroner visar ChAT immunoreaktivitet samt GFP-positivitet. Intressant, vid denna tidpunkt, expression av chatten-Cre tdTomato konstruktionen är inte upptäckas. Genom E13.5, majoriteten av Hu-positiva neuroner är både ChAT-IR och chat-GFP positiv, och ett litet antal ChAT-Cre tdTomato-positiva neuroner ses. Antalet ChAT-Cre tdTomato-positiva neuroner ökar med E16.5, men fortsätter att vara en bråkdel av antalet ChAT-IR nervceller.

Figur 1
Figur 1. Representativa bilder av kolinerga neuroner i Distal tunntarmen och kolon på embryonala dag 11. Vid E11, i den distala SI (märkt "SI") och proximala kolon (märkt "Co"), Hu-positiva neuroner (blå) är endast närvarande i SI i detta skede. De flesta Hu-positiva neuroner co-immun med chatt-IR (vit) och chat-GFP (grön). Men vid denna tidpunkt, ingen av dessa nervceller är ChAT-Cre tdTomato positiv (röd). Skalabar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Representativa bilder av kolinerga neuroner i Distal tunntarmen och kolon på embryonala dagar 13.5 och 16.5. Bilden visar kolinerga neuron i distala tunntarmen på E13.5 (övre paneler) och E16.5 (lägre paneler). På E13.5 majoriteten av Hu-positiva neuroner var ChAT-IR och chat-GFP-positiva (övre paneler). Ett litet antal av dessa samuttryckt ChAT-Cre tdTomato. Genom E16.5 har fler chatt Cre tdTomato neuroner som finns i begynnande ganglierna (lägre paneler). Skala bar = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna figure.

Primära antikroppar
Antigen Immunogen Utspädning Leverantör & Detaljer
Hu (Human neuronal protein) Hu-protein 1: 1000 Serum från humanpatient (Madison, WI)
GFP (grönt fluorescerande protein) GFP-proteinet, IgY fraktion 1: 1000 Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), kyckling polyklonal, GFP-1020
Chat (kolinacetyltransferas) Humant placenta-enzym 1: 100 Millipore (Billerica, MA), get polyklonala, AB144P
Sekundära antikroppar
Namn Fluorofor Utspädning Leverantör & Detaljer
Åsne-anti-human Dylight 405 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149
Åsne-anti-kyckling Cy2 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155
Åsna anti-get Cy5 1: 500 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147

Tabell 1. Uppgifter om primära och sekundära antikroppar som används i studien. De primära och sekundära antikroppar som används i denna studie, tillsammans med sin leverantör och späd utnyttjas.

Primära antikroppar
Antigen Utspädning Leverantör Sekundär antikropp
Sox10 01:50 Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX Åsna anti-get
p75 1: 250 Promega, Madison WI Åsne-anti-kanin
PGP9.5 1: 1000 Abcam, Cambridge, MA Åsne-anti-kanin
BFABP 1: 500 Millipore, Billerica, MA Åsne-anti-kanin
S-100 1: 500 DAKO, Carpinteria, Kalifornien Åsne-anti-kanin
GFAP 1: 500 DAKO, Carpinteria, Kalifornien Åsne-anti-kanin
nNOS 1: 500-1000 Emson, Cambridge, Storbritannien Åsna anti-får
VIP (Vasoaktiv Intestinal Polypeptid) 1: 500 Epstein & Paulsen, Madison, WI Åsne-anti-kanin
Substans P 1: 200-400 DiaSorin, Stillwater, MN Åsna anti-får
Sekundära antikroppar
Namn Utspädning Leverantör & Detaljer Fluorofor
Åsne-anti-human 1: 500-1000 Jackson ImmunoResearch laboratorier, West Grove, PA Dylight 488
Åsne-anti-human 1: 1000 Jackson ImmunoResearch laboratorier, West Grove, PA Cy3
Åsne-anti-kanin 1: 500 Jackson ImmunoResearch laboratorier, West Grove, PA Dylight 488
Åsne-anti-kanin 1: 500 Jackson ImmunoResearch laboratorier, West Grove, PA Cy3
Åsna anti-får 1: 500 Jackson ImmunoResearch laboratorier, West Grove, PA Cy2 Åsna anti-får 1: 1500 Jackson ImmunoResearch laboratorier, West Grove, PA Cy3
Åsna anti-get 1: 500 Jackson ImmunoResearch laboratorier, West Grove, PA Cy3

Tabell 2. Ytterligare primära och sekundära antikroppar för användning i studier ENS utveckling. De primära och sekundära antikroppar som vi tidigare har använt i våra studier av ENS utveckling.

Excitering Emission
Laserlinje Fluorofor Typ Exempel Fotomultiplikatorrör Filteralternativ
408 nm Blå Alexa Fluor 405, Cascade Blue, kumarin 30 DAPI, Hoechst, Pacific Blue, de flesta kvantprickar 1 BP 425-475 nm
488 nm Grön Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, EGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1 2 BP 500-550 nm
561 nm Röd Alexa Fluor 546, 555, 568, och 594, Cy3, Dil, DsRed, mCherry, fykoerytrin (PE), Propidium Jod (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC 3 BP 570-620 nm
638 nm Far Röd Alexa Fluor 633 och 647, allofykocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3 4 BP 663-738 nm

Tabell 3. Konfokala avbildningsexciteringsvåglängder, fluoroforer och filter. De exciteringsvåglängder, detekterbara fluoroforer, och filter som används presenteras. Denna information kan användas vid val kombinationer av sekundära antikroppar för multi immunofluoresence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vårt laboratorium och andra har visat att tarm defekter i HSCR inte är begränsade till den aganglionic kolon men förlängdes proximalt, även i ganglionated tunntarmen 5,15,16. Dessa förändringar innefattar förändringar i ENS neuronal densitet och signalsubstans fenotyp och kan redogöra för dysmotilitet som har observerats hos patienter med HSCR. Vi har använt ovanstående tekniker i vår strävan att förstå faktorerna för ENS bildning. Specifikt har dessa tekniker använts för att visualisera neuronala kväveoxid syntas (nNOS) neuroner, vasoaktiva intestinala polypeptid neuroner (VIP), samt kolinacetyltransferas (ChAT) neuroner (Tabell 2) 5. En viktig fördel med denna teknik är förmågan att lagra prover i 30% sackaros för senare bearbetning, antingen för immunofärgning eller för inbäddning och cryosectioning.

NCC kolonisering av tarmen uppträder som en framåt vågfront from E9.5 till E14.5. Immunofärgning med Hu, som identifierar neuroner, såsom beskrivits ovan, i kombination med datorstödd bildanalys, möjliggör kvantitativa jämförelser av neuronal densitet. Minskningar i neuronal densitet finns delar av ganglionated tarm HSCR 5, liksom i andra modeller av tarm dysmotilitet 13. Möss med en villkorad strykningen av Hand2 visar förändringar i proportionerna av nervceller som uttrycker olika signalsubstanser samt minskade neuronala siffror. Dessutom, djur med överuttryck av noggin eller PTEN uppvisar ökad neuronal densitet längs deras tarm 6,17.

Återstoden av signalsubstans fenotyper bland neuroner i ILE är hårt reglerad, vilket resulterar i en samordnad kontraktion av tarmväggen för förflyttning av luminala innehåll, reglering av blodflödet och absorptionen av näringsämnen. När NCC förvärva en neuronal identitet, det finns ett smalt fönster av tid innanbinda dig till en signalsubstans fenotyp 14. Vi har nyligen visat att immun identifierar en chatt signalsubstans fenotyp vid E10.5, tidigare fosterstadiet än vad som observerats med genetiska reporter modeller (t.ex. chat-Cre eller chat-GFP) 14. Dessutom, chatt immunoreaktiva neuroner når vuxna nivåer (som andel av alla ENS neuroner) tidigt i utvecklingen, ett resultat som tyder på att ChAT nervceller kan ha en roll i regleringen av ytterligare neuronal differentiering i ENS.

Kväveoxidsyntas (NOS) är den primära avkoppling signalsubstans finns i ENS, och proportionellt ökat i ENS neuroner längs tarmen i HSCR 5. Dessutom förändringar i vasoaktiv intestinal peptid (VIP), en signalsubstans som också deltar i förmedling av muskelrelaxation och reglering av blodflödet längs tarmväggen, finns i HSCR modeller 5. Dessa data tyder på att, för att förstå hur components av ENS reglerar dess funktion, bör en systematisk genomgång av de olika signalsubstanser göras. De tekniker som presenteras här kan lätt anpassas för att möjliggöra denna typ av analys genom användning av lämpliga antikroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes bythe amerikanska Pediatric kirurgiska Association Foundation Award (AG) och National Institutes of Health K08DK098271 (AG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium azide Fisher BP9221
Bovine serum albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33, (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45, (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184, (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20, (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141, (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334, (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15, (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46, (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17, (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46, (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251, (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138, (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26, (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24, (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32, (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119, (12), 3586-3596 (2009).
Immunofärgning att Visualisera Murin enteriska nervsystemet Utveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).More

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter