Summary
Denne protokollen beskriver anvendelsen av høyfrekvent ultralyd (HFUS) for avbildning mus cervikale lymfeknuter. Denne teknikken optimaliserer visualisering og kvantifisering av cervical lymfeknute morfologi, volum og blodstrøm. Bildestyrt biopsi av livmor lymfeknuter og foredling av lymfevevet for histologisk evaluering er også demonstrert.
Abstract
Høyfrekvent ultralyd (HFUS) er mye brukt som en ikke-invasiv metode for å avbilde interne anatomiske strukturer i eksperimentelle dyresystemer små. HFUS har evnen til å gjenkjenne strukturer så lite som 30 mikrometer, en eiendom som har blitt brukt for å visualisere overfladiske lymfeknuter hos gnagere i lysstyrke (B) modus. Ved å kombinere strømmen Doppler med B-modus muliggjør avbildning for å måle blodsirkulasjonsstrømmen i lymfeknuter og andre organer. Mens HFUS har vært benyttet for lymfeknuteavbildning i en rekke musemodellsystemer, har et detaljert protokoll beskriver HFUS avbildning og karakterisering av de cervikale lymfeknuter hos mus ikke blitt rapportert. Her viser vi at HFUS kan tilpasses til å detektere og karakterisere cervikale lymfeknuter hos mus. Kombinert B-modus og strøm doppleravbildning kan brukes til å detektere en økning i blodstrømmen i immunologisk forstørrede cervikale noder. Vi beskriver også bruk av B-mode bildebehandling for å gjennomføre tynn nål biopsi av cervical lymfe nodes for å hente lymfevevet for histologisk analyse. Endelig er programvareassistert trinnene beskrevet til å beregne endringer i lymfeknute volum og å visualisere endringer i lymfeknute morfologi følgende bilde gjenoppbygging. Evnen til å visuelt overvåke endringer i cervical lymfeknute biologi over tid gir en enkel og kraftfull teknikk for ikke-invasiv overvåking av cervikale lymfeknute endringer i prekliniske musemodeller av munnhulen sykdom.
Introduction
Lymfedrenasje av interstitiell vev væske er den viktigste metoden for formidling for smittsomme mikroorganismer og kreft som oppstår i muntlig og maxillofacial regionen 1,2. Klinisk evaluering av cervikale lymfeknuter er en vanlig praksis anvendes diagnostisk for å bestemme tilstedeværelsen eller progresjon av sykdommer som kommer i munnhulen. Dette understreker viktigheten av å samle cervical lymfeknuter som verdifulle anatomiske områder for oral sykdom diagnose tre. Flere spesialiserte bildebehandling metoder er klinisk benyttes for å identifisere syke cervical lymfeknuter. Disse inkluderer positronemisjonstomografi (PET), computertomografi (CT) og magnetisk resonansavbildning (MR). Mens svært verdifulle, disse metodene alle krever omfattende pasient forberedelse, høyt spesialisert utstyr og / eller kjemisk infusjon i sirkulasjon for å aktivere eller forbedre bildeprosessen.
Sonografiske imaging (ultralyd, USA) er en vanlig brukt teknikk som brukes for å imalder cervical lymfeknuter presenterer med lymfadenopati skyldes infeksjon eller metastaserende engasjement 4-6. USA er ofte kombinert med PET-CT og MR for å gi et helhetlig bilde av pasienten lymfeknute status, bidrar til å bestemme svulst staging og nødvendighet for kirurgisk fjerning 7. Den ikke-invasiv har også iboende fordeler fremfor andre bildediagnostikk, inkludert brukervennlighet, lave kostnader, minimal ubehag for pasienten og forberedelse. Den overfladiske underhudsfett plasseringen av de fleste livmorhals lymfeknuter tillater USA å veilede minimalt invasive tynn nål aspirasjon biopsi med økt presisjon, bedre diagnostisk nøyaktighet 8.
Kommersiell høyfrekvent (HF) US gir detaljert oppløsning på interne anatomiske strukturer til 30 mikrometer 9. Ved hjelp av transdusere som strekker 22-70 MHz, og HFUS blitt lett applisert på en rekke eksperimentelle systemer gnager for å tillate sanntids avbildning av indre organer in vivo.; HFUS har blitt tilpasset for visualisering av tumordannelse i konvensjonelt lysstyrke (B) modus, så vel som med et antall generelle og spesialiserte kontrastforbedring agents9. Bruke strøm Doppler med HFUS gir muligheten til å overvåke blodgjennomstrømningen i musetumorer, slik at en helhetlig vurdering av angiogent perfusjon i levende mus 10,11. HFUS har blitt brukt til å visualisere syke mus lymfeknuter i hovedlegemet hulrom, noe som viser parallelle nytten av denne teknologien til klinisk praksis. Spesielt provoserende og metastatisk visceral lymfeknute endringer er observert i mus modeller av kreft husing bryst 12,13, bukspyttkjertelen 14, tykktarms 15 og lunge 16 svulster, samt fiber histocytomas 17, og en aldrende mus modell av ervervet hydronefrose 18 . Disse eksemplene stivner verdien av HFUS som et kraftig verktøy for undersøkende tumor-indusert lymfadenopati i et bredt spekter av rodent systemer.
Flere modeller av bakteriell infeksjon 19,20 og hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) 21,22 har blitt utviklet for å studere disse sykdommene i prekliniske setting. I motsetning til mennesker, mus inneholde tre cervical lymfeknuter som kartlegger lymfe fra munnhulen vev (kjeve, submandibular mandibular og overfladisk parotiden 23). Nylig rapporterte vi bruk av HFUS å kartlegge plasseringen og morfologi av disse lymfeknuter, overvåking endringer i lymfeknute volum og blodstrømmen i et karsinogen-indusert musemodell for HNSCC 24. Her gir vi en detaljert protokoll for bruk av HFUS for å identifisere, bildebehandling og analysere cervical lymfeknuter i levende mus. Denne protokollen viser også muligheten for å bruke HFUS å gjennomføre bilde- veiledet fin nål biopsi forstørret mus cervikale lymfeknuter, slik histologisk overvåking av endringer i cervical lymfeknute innhold og patologier enn tIME i samme dyret. Denne protokollen er lett tilpasses for å gi rom for den detaljerte studier av cervikale lymfeknute sykdommer resulterende fra en hvilken som helst invasiv munnhulen sykdom hos mus.
Protocol
Alle dyr prosedyrer demonstrert i denne protokollen er gjennomgått og godkjent av West Virginia University Animal Care og bruk komité i henhold til protokoller 11-0412 og 14-0514 og gjennomført i samsvar med prinsippene og prosedyrene beskrevet i NIH Guide for omsorg og bruk of Animals.
1. Animal Forberedelse
- Bedøve en enkelt mus i en induksjonsskammer under anvendelse av 3% isofluorane blandet med 1,5 l / min 100% oksygen. Fjern dyret fra induksjonskammeret og plasser i en liggende posisjon på bildeplattformen forvarmet til 40 ° C og holdt på mellom 37-42 ° C (figur 2A). Bekreft anestesi ved manglende respons på en tå klype.
- Før musen snuten innenfor nosecone koblet til anestesi system. Påfør anestesi for å opprettholde stabil tilstand sedasjon (1,5% isofluorane blandet med 1,5 l / min 100% oksygen).
- Påfør øye smøremiddel til hvert øye for å unngå tørking lg. Påfør elektrode gel til elektrodene og bruke tape for å feste hvert av de fire poter til den tilsvarende elektrode. Elektrodene vil overføre dyrets EKG til imaging system for å kunne overvåke hjertefrekvens og pusterytme. Smør og sett rektal temperaturføler for kontinuerlig overvåkning av kroppstemperatur. Normal musekroppstemperaturen er 36,9 ° C. 1-2 ° C variasjon er normalt mens under anestesi.
- Bruk riktige fløte for å fjerne pelsen fra halsen på mus. Skyll nakkeregionen med vann-gjennomvåt gasbind for å fjerne hår og overflødig Hårfjerningskrem. Eventuelt bruke ekstra anvendelse av Hårfjerningskrem for å fjerne eventuelle gjenværende kroppshår (figur 2B).
2. Identifisering og Image Acquisition of Mouse Cervical lymfeknuter Bruke HFUS
- For å begynne, bruke et lag med oppvarmet ultralyd gel til halsen området blottet for pels. Bruk liberal bruk av gel for optimal bildekvalitet (Figur 2C). Unngå å innføre luftbobler i gelen under påføring, noe som kan forstyrre ultralydavbildning.
- Juster bilde plattformen 20-30 ° slik at musen er plassert med hodet litt forhøyet. Denne posisjonen bidrar til å sikre optimal pusterytme for musen. Plasser 40 MHz-transduseren tvers i monteringssystemet og forsiktig senkes inntil forsiden av transduseren avsøkningshode er nedsenket i ultralyd-gel (figur 2C).
MERK: Pass på å ikke legge for mye press på musen halsen, da det kan føre til unødig åndenød. I tillegg er det nyttig for avbildning for å ha en buffer for gel mellom transduseren og mus.
B-Mode Imaging og Påvisning av lymfeknuter:
- Bruke datamaskinen som styrer HFUS oppkjøpet programvare, justere lysstyrken (B-) innstillinger til følgende parametere modus: Få 22 dB, dybde 10.00mm, bredde 14,08 mm.
MERK: Disse innstillingene er en veiledende utgangspunkt, og kan kreve liten justering for optimal bildeopptak mellom ulike programmer. Følg vanlige cervical lymfeknuter som ovale hypoechoic strukturer nær hudoverflaten innenfor et området hyperechoic feltet. Utseendet til syke lymfeknuter kan variere mellom modellene. Å systematisk image alle lymfeknuter i halsen regionen bruke følgende fremgangsmåte:- Bruk Y-aksen for å skanne nakken i en kranie til hale måte mot thorax-regionen. Bruk X-aksen for å sentrere bildet.
- Identifisere viktige landemerker: munnhulen, tungemål og skjoldbruskkjertelen (figur 3A, B og C, henholdsvis); vippe bildeplattformen til horisontalt justere den ventrale overflaten av mus halsen, slik at begge sider av halsen vises selv i B-modus bilde. Mengden av vippingen avhenger av fysiologien av hver enkelt mus.
- Finn tungen / munnhulen region (figur 3A) og merk den numeriske plasseringen på Y skala.
- Finn skjoldbruskkjertelen (Figur 3C) og merk den numeriske plasseringen på Y skala.
- Beregn forskjellen mellom de oppnådde verdier i (2.4.1) og (2.4.2) for å bestemme den totale lengde i mm for den avbildede nakkeregionen.
- Bruk Y knotten for å sentrere transduseren på midtpunktet av den fastlagte totale lengde.
- Trykk på "3D". Skriv inn den totale lengden. For 3D trinnstørrelse, bruke 0,076 mm å hente bildet serien stabelen for hele nakkeregionen.
- Når skanningen er fullført, velger høyre eller venstre side av halsen og sentrere svinger på en individuell lymfeknute av interesse, så heve 40 MHz svinger av musen. Fjern 40 MHz svingeren og erstatte med en 50 MHz micro svinger (også i en tverrgående posisjon) for å oppnå høyere oppløsning. Fylle ultralyd gel på musen halsen og senk 50 MHz svinger inn i ultralyd gel.
3D Strøm Doppler Imaging
- Conduct 3D skanner med kraft Doppler å asses volum og vaskularitet av individuelle cervical lymfeknuter som følger:
- Trykk på strømknappen på systemet tastaturet for å skaffe strøm Dopper og juster følgende innstillinger power-modus: PRF 4 KHz, Doppler få 34 dB, 2D gain 30 dB, dybde 5,00 mm, bredde 4,73 mm. MERK: Som før, disse innstillingene er foreslått utgangspunkt og kan bli endret etter behov for optimal bildeopptak i ulike modeller.
- Finn kranie-punktet av lymfeknute av interesse og merk plasseringen på Y skala.
- Finn de mest hale punktet på samme node og noteden på Y skalaen.
- Beregn avstand forskjellen for å bestemme den totale lengde av lymfeknute (se trinn 2.4.3).
- Sentrere transduseren på midtpunktet av den bestemte totale lengde, ved hjelp av Y-skalaen sted.
- Trykk på "3D" og skriv total lymfeknute lengde. Bruk 0,051 mm til trinnstørrelsen.
MERK: På grunn av nærheten av svingeren til brystet regionen, kan 50 MHz svinger resultere i ustødig Doppler bilde på grunn av påvisning av normal luftbevegelse. Dette kan elimineres ved å bruke "respirasjon gating" alternativet tilgjengelig under "Physiological" -kategorien. - Omgi valgt lymfeknute med den gule boksen som angir området som skal analyseres ved makten Doppler og velg "3D scan" for å hente bilder. Løft svingeren ut av musen og flytte den til motsatt side av halsen. Senk svingeren på musen og gjenta trinnene som er beskrevet ovenfor for å image lymfeknuter på denne siden av halsen.
- Lagre bilde sett for nærmere analyse.
3. Livmorhals lymfekjertelbiopsi
- Velg ønsket lymfeknute for biopsi og vedlikeholde HFUS bildebehandling med 50 MHz svinger. Valgte den største synlig cervical lymfeknute på hver side av musen halsen. Lymfeknute utvidelsen indikerer vanligvis en inflammatorisk respons, og derfor slike noder er ideelle kandidater for biopsi.
MERK: Vi har funnet det er svært vanskelig å gjennomføre biopsier på livmor noder som er mindre enn 10 mm 3. - Forbered nålen og sprøyten for biopsi ved å plassere en 1 ml sprøyte med en vedlagt 27 G, 0,5 tommers nål inn sprøyteholderen. Juster nåleholderen for å orientere nålen 90 ° til mus halsen (figur 4A).
- Forbered ved å heve hele muse plattformen til nivået av nålen. Oppnå dette ved å fjerne 3D motoren og bytte til en høyere Platform, eller ved å plassere et solid objekt av passende høyde under gitt kort plattform. Bruk en plast mikrosentrifugerør stativ for dette formål. Hvis det er nødvendig, dreie plattformen 180 ° for å biopsi noder plassert på siden av halsen på motsatt side av nålen apparatet.
- Juster oppkjøps innstillingene ved å velge "Innstillinger", deretter ved å velge "Max & Extended buffer". Utvide synsfeltet til en dybde på 8,00 mm og bredde på 9,73 mm. Slå på nålføring Bruke skjermtaster. Nålen guiden vil forutsi banen av nålen på skjermen og lar brukeren stille opp lymfeknute av interesse på riktig sted for biopsi.
- Sørg for at lymfeknute forblir konstant i lys av sentre lymfeknute i midten eller litt til venstre for midten i skjermen (Figur 4B). For å få hele cine løkke av prosedyren, trykk Pre-trigger på systemet tastaturet før du begynner biopsi.
- Juster nålholderen inntil nålespissen kommer til syne og kontakter huden (Figur 4B). Advance nålen med en fast, fast trykk for å punktere huden. Fortsett å avansere nålen til spissen punkterer også kapselen (Figur 4C), og er synlig i medulla (Figur 4D).
- Når nålen er riktig plassert i noden, dra forsiktig sprøytestempelet tilbake mellom 200-300 mL demarcations å gjennomføre biopsien (Figur 4D og 4E). Legg merke til at biopsimateriale er vanligvis ikke er synlig inne i sprøyten.
- Fjerne nålen fra musen nakken forsiktig. Utvise sprøyte innholdet i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Fjern kanylen fra sprøyten, slik at nålen i røret. Samle 1 ml av biopsi medier (fra en porsjon, separat fra aksje kilde) med samme sprøyte, og deretter feste kanylen til sprøyten mens du holder nålen i the tube.
- Skyll sprøyten og kanylen med biopsi media ved å utvise de biopsimaterialet inn i røret.
MERK: Ikke dra tilbake på stempelet mens nålen er festet på et punkt etter biopsi. Dette reduserer risikoen for å miste biopsimateriale på grunn av den lille prøvestørrelsen.
- Skyll sprøyten og kanylen med biopsi media ved å utvise de biopsimaterialet inn i røret.
- Bekreft lymfeknute innhold ved histologiske midler (figur 4F) og analysere ved flere metoder (histokjemi, flowcytometri, etc.) som passer.
- Når biopsi er fullført, slår du av anestesi og fjern rektal temperaturføler. Fjern overflødig ultralyd gel fra mus med gasbind og fjerne tapen fra hver pote.
- Fjern mus fra bildeplattformen og går tilbake til et bur. Minimal blødning fra biopsi stedet kan forekomme, men dette stopper uten inngripen. Overvåke musen under utvinning før full aktivitet gjenopptas.
4. Image Analysis of Cervical lymfeknuter
- Velg "3D Rekonstruert Image" i øvre venstre hjørne, klikke på "Vis Enkelt Pane" -knappen. Bruk zoom-funksjonen for å forstørre bildet hvis ønskelig. Toggle "skjermformat" for å vise bildet bare i B-mode, som fjerner makt Doppler overlegg fra visningen. Dette gjør det lettere å se kantene av lymfeknute under påfølgende 3-D-analyse. Bla gjennom bildeserien for å finne begynnelsen av lymfeknute.
- For å omskrive lymfeknute, naviger til "3D Settings" -fanen. Velg "volum", deretter "Start" -knappen ved siden av "Parallel".
- Tegn konturene rundt området av interesse innenfor enkeltbilder ved å rulle. Fortsett slik til bilder som omfatter hele lymfeknute er merket. Velg "Finish" for åfullføre analysen.
- Nederst i bildet, vil 3D-volum og% vaskularitet vises automatisk.
MERK: 3D-volum tilsvarer lymfeknute volum, og prosent vaskularitet representerer prosentandel av lymfeknute positiv for blodstrøm ved kraft Doppler. - Toggle "skjermformat" for å vise makt Doppler som et overlegg på B- modus bildet. På overflaten vis å observere en netto riss av volumet området av interesse. Eksportere bildene i Tagged Image File (TIF) format eller 3D-skanner som filmer (.avi) for videre bruk.
Representative Results
Den samlede skjematisk for imaging og biopsi prosedyrer er vist i figur 1. De viktigste trinnene i prosedyren inkluderer riktig forberedelse av musen for bildebehandling, identifisering av cervical lymfeknuter, riktig forberedelse og gjennomføring av nålen biopsi, og analyse av B -mode og Doppler-bilder for å måle volum og mengden av vaskularitet innenfor hver valgt node bruker dataprogrammer.
HFUS avbildning av mus cervikale lymfeknuter trenger å påføre og opprettholde riktig anestesi i løpet av avbildnings periode (figur 2A), så vel som fullstendig fjerning av hår som dekker hele halsområdet (figur 2B). Den liberalt bruk av ultralyd gel til depilated regionen sikrer en klar HFUS signal i løpet av prosedyren (figur 2C).
HFUS avbildning av nakkeregionen er hjulpet av visualisering av livmorhals anatomiske landemerker som produserer karakteristiske sonografiske bilder. Figur3 viser eksempler på de viktigste organer (figur 3A-C), cervikale lymfeknuter i B-modus (figur 3D), og i kraft Doppler-modus (figur 3E).
Sanntids HFUS bildebehandling i bedøvede mus tillater guidet tynn nål biopsi av livmor noder som ligner på det som er gjennomført i klinisk praksis. Plassering av biopsi nål og festet samlesprøyten til den kontrollerende microinjector utstyret er vist i figur 4A. Påfølgende B-mode sonografiske bildene viser ideelle nål plassering før biopsi (4B), nålespissen oppføring i en cervical lymfeknute (Figur 4C), og nål stilling under biopsi (Figur 4D). Close-up bilde viser sprøytespissen i medulla av lymfeknute (figur 4E). Behandlingen av biopsi komponenter ved cytospin avslører rikelig lymfoide celleklynger og tilhørende bindevev, bekrefter vellykket lymfeknutebiopsi (Figur 4F).
Beregnings-baserte analyser av bilder lar HFUS for å bli oppnådd detaljert informasjon angående lymfeknute arkitektur, volum og vaskulær strømmen. Ved hjelp av strøm Doppler modus og 3D volummålinger, prosent vaskularitet (PV) kan beregnes ut fra bildeserien omfatter hele noder (figur 5A). I tillegg gir 3D avbildning for virtuelle lymfeknute rekonstruksjon, avslører generelle lymfeknute topografi (Figur 5B).
Figur 1:. Oversikt skjematisk av trinnene involvert i diagnostisk HFUS livmorhals lymfeknute bildebehandling i mus De viktigste trinnene omfatter 1: Klar mus for HFUS bildebehandling og skaffe 40 og 50 MHz oppløsning av halsområdet inneholder tre muse cervical lymfeknuter . 2: Fine nål bildeveiledet biopsi av livmor lymfeknuter og påfølgende histologisk analyse av biopsied materiale. 3: dataassistert bildeanalyse og 3D-rekonstruksjon av lymfeknute bildene innhentet i B-modus og Doppler for å bestemme de respektive lymfeknute volum og prosent (%) av vaskulær strømning.
Fig. 2: Oversikt over høy oppløsning in vivo mikro-avbildningssystem for cervical lymfeknute vurdering og biopsi (A) HFUS systemet er vist med en bedøvet mus forberedt for cervical lymfeknuteavbildning. Også vist er microinjector (MI) og 3D-motor scenen (3D MS) tilbehør. (B) Nærbilde av en bedøvet mus forberedt på HFUS bildebehandling med håret fjernet i nakkeregionen. (C) Den samme mus med 50 MHz-transduseren på plass på halsen. Legg merke til den ekstra ultralyd gel anvendes for å lette nakkeregionen imaging.
718fig3.jpg "/>
Figur 3: Representant HFUS livmorhals anatomi bilder i B-mode og power Doppler. (A, B) B-mode-bilder i munnhulen, og viser munnhulen (BC) og tungen (T) visualiseres ved avbildning nærmest nesehulen. De tre cervikale lymfeknuter som finnes på hver side av halsen (merket M, underkjevens, SM, submandibulære, SP, overfladisk parotid), vist som en gruppe av hypoechoic strukturer i et enkelt bildeplanet som vist (B). (C) Den skjoldbrusk kjertel (Th) som visualiseres på det øvre thorax-regionen, som vises som et fast stoff, ekkogenisk sommerfugl-formet struktur. (AC) ble visualisert med en 40 MHz transduser; skala bar = 1 mm. (D, E) Representative bilder av normal (D) og forstørrede (E) cervical lymfeknuter med B-mode og power Doppler (rød). Stiplede linjer skissere enkelte lymfeknuter. Scale bar = 0,5 mm.
Figur 4: Livmorhalslymfeknutebiopsi oppsett, bildebehandling og cytospin analyse av biopsimateriale (A) Bilde plattformen viser mikro-injektor og nål plassering nær muse halsen.. Et bredt mikrosentrifugerør stativ (orange blokk) blir brukt til å litt heve plattformen, slik at riktig plassering nål samtidig gir plass for 3D-trinns motor. Denne ordningen minimerer tidsbruk fjerne motor scenen for hver mus. (B - D) Hele nakke HFUS bilder tatt fra en video av en cervical lymfeknute biopsi bruke 50 MHz svinger. (B) HFUS B-mode bilde som viser nålen plassert til siden av halsen før biopsi. Nålespissen er hyperechoic strukturen like under posisjonen til nålen guide (grønn stiplet linje) overlagret under avbildning for å betegne nålen bane. Lymfeknute ligger i sentrum avbildet. Scale bar = 1 mm. (C) Needle inntreden i lymfeknute. (D) biopsi av cervical lymfeknute. (E) er zoomet biopsi av livmorhals lymfeknute. Scale bar = 0,5 mm. (F) Cytospin analyse av representative biopsi lymfe materialet bekrefter vellykket biopsi. Scale bar = 100 mikrometer.
Figur 5:. Computer analyse av 3D livmorhalslymfeknute bilder (A) Representant skjermbilde av en lymfeknute analysert ved hjelp av dataprogrammer. Noden er omskrevet i blått; Analyseresultatene viser 3D Volum og prosent vaskularitet (PV) som angitt. (B) Et overflatevisningsbilde av den samme node etter 3D-analyse. Gjengir hele volumet av lymfeknute basert på målinger gjort i A.
Discussion
Den beskrevne protokollen åpner for visualisering og in situ evaluering av murine cervical lymfeknuter ved hjelp av ikke-invasiv HFUS bildebehandling. Bruken av B-modus og strøm doppleravbildning for å visualisere cervical lymfeknute morfologi, gir volum og lymfeknute blodstrømmen for en eksperimentell analyse av prekliniske musemodell systemer som ligner den som ble anvendt for karakterisering av cervical pasient noder i klinisk praksis. Evnen til å overvåke cervial lymfeknuter via tynn nål biopsi gir også en nyttig teknikk for å påvise immuncelle endringer og tilstedeværelsen av utenlandske celletyper eller bakterier i løpet av munnhulen sykdomsinduserte lymphadenopathies hos mus. Den enkle bruk og lave kostnader forbundet med HFUS muliggjør hurtig screening av livmorhals lymfeknute status i en rekke forskjellige dyremodeller.
Et viktig skritt i denne protokollen er den første vellykkede identifisering av cervical lymfeknuter i HFUS bilder. Vårt anlegg har et utvalg av HFUS transducers som beskrevet, så vi har brukt dem til å få bilder av høyeste kvalitet. Men hvis transduserne vi beskriver ikke er tilgjengelig, er det mulig å tilpasse den avbildning ved hjelp av andre transdusere. For dette formål, justere bildedybde og bredde for å oppnå en tilfredsstillende bilde er alt som kreves. Oppløsning av slike bilder kan variere, men det skal fortsatt være mulig å få bilder av høy kvalitet ved hjelp HFUS. Landemerker avbildning av munnhulen og skjoldbruskkjertelen vil i stor grad hjelpe til å orientere brukeren om at det riktige område hvor lymfeknutene er lokalisert. Den karakteristiske ovale, hypoechoic natur og overfladisk beliggenhet nær hudoverflaten muliggjør rask bekreftende identifisering av cervical lymfeknuter i riktig nakkeregionen. Mens alle tre nodene kan være synlige i et enkelt bildeplan (figur 3B), er typisk én eller to noder er fanget under avbildning. Mindre justeringer av svingeren stillingen kan gjennomføres for å riveer forskjellig avbildning høvler synlig, slik at visualisering av alle noder på en enkelt side av halsen.
Mens vi har funnet den beskrevne teknikken pålitelig for identifisering av cervical lymfeknuter, er det spesifikke begrensninger i bildebehandling og biopsi teknikk. Den overfladiske natur muse cervical lymfeknuter overfører dreven mobilitet når selv lett trykk påføres huden via svingeren på hodet. Dette kan motvirkes ved å anvende langsomt transduseren hodet inn ultralyd gel på mus halsen inntil Landmark bildene blir identifisert. Lymfeknute mobilitet kan også komplisere tynn nål biopsi, spesielt når du bruker transdusere i høyere oppløsning (50 MHz) rekkevidde. Sentrert bilder av lymfeknuter for biopsi er vanligvis skjøvet ut av synsfeltet på grunn av kraften fra biopsinål nødvendig å punktere den overliggende hud og kapsel. Dette kan bøtes på ved off-center plassering av lymfeknute mot retning av nålen oppføring,som gir plass for lymfeknute å bli skjøvet på tvers, men likevel holde seg innenfor synsfeltet ved biopsi. I vår erfaring, lymfeknuter> 10 mm 3 er svært vanskelig å biopsi, og blir ofte presset av nålen i stedet penetrert under nålen avansement. Dermed er biopsi best reservert for forstørrede lymfeknuter hvor størrelsen er> 10 mm 3 for å sikre tilstrekkelig node målstørrelse og stabilitet i den cervikale region. I tillegg kan biopsimateriale ikke inneholder tilstrekkelig antall celler for fremgangsmåter hvor store antall celler er nødvendige (for eksempel strømningscytometri).
HFUS har blitt brukt for å visualisere ortotopisk HNSCC tumorer 25, og har potensial til å overvåke cervical metastaser i mus med tumorer orale 24. I tillegg til ultralyd, har bioluminescens avbildning også blitt brukt til å visualisere ortotopisk oral tumordannelse og cervikal lymfeknutemetastase i levende mus 26,27. Som en AlternAtive tilnærming, har bioluminescens bildebehandling en klar fordel over HFUS i å kunne direkte kvantifisere tumorprogresjon og metastatisk belastning over tid i samme dyret. Mens unektelig nyttig, er bioluminescens avbildning i stand til å måle mange av parametrene visualisert ved HFUS, inkludert lymfeknuter morfologi, node volumer eller blodstrømmen. Bioluminesens bildebehandling krever også spesialiserte mørke boksene for å opprettholde mus under bildebehandling, gjengi denne teknikken uegnet for tilrettelegging for tynn nål biopsi.
Videre krever fremstillingen av tumor-celler som stabilt uttrykker den luciferase-enzymet, slik at denne teknikk skal bare brukes i tilfeller av ortotopiske xenografter med luciferase-transfekterte tumorceller hos immunkompromitterte mus, eller med induserbare vevs-spesifikke transgene systemer som begrenser luciferase-ekspresjon Bioluminescens avbildning i et rom-tid-spesifikk måte til vevet av tumor opprinnelse. I kontrast, kan HFUS være used i forbindelse med Bioluminescens bilder i disse modellene, samt å være i stand til å avbilde cervical lymfeknuter i modeller av kreftfremkallende-indusert muntlige svulster hos mus med komplett immunforsvar 28,29. Mens HFUS kan være mer tilpasningsdyktig til de fleste musemodeller av kreft i munnhulen, den kombinerte informasjon som kan hentes fra Bioluminescens og HFUS bildebehandling i systemer der tumorceller uttrykker luciferase kan gi et mer komplett bilde av cervical spredning til lymfeknuter enn både avbildingsmodalitet alene.
Evnen til å identifisere og registrere mus cervikale lymfeknuter i sanntid tillater denne teknikken som skal brukes i de fleste modeller av oral sykdom som fører til inflammatoriske lymfadenopati hvor dyret kan opprettholdes i en omvendt stilling under kortsiktig anestesi. Påvisning av lymfeknutemetastase eller bakteriell infeksjon og samtidig innvirkning på lymfeknute morfologi i levende dyr presenterer en betydelig fordel i forhold til tradisjonelle metodersom krever lymfeknuter for å bli fjernet fra døde dyr for histologisk bearbeiding. Ved å kombinere HFUS med fin nål biopsi muliggjør en anordning for å drive rutine patologisk analyse av cervikale lymfeknuter, i likhet med hva som er utført i klinikken, og gir en forbedret fremgangsmåte for å overvåke sykdomsprogresjon hos de fleste aktuelle musemodeller av munnhulesykdommer.
Disclosures
Publiseringskostnadene for denne artikkelen er sponset av Visual Sonics.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Dorothy D. Radford Gavefond fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Bruken av West Virginia University Animal Modeller og Imaging Facility (AMIF) og Mikroskopi Imaging Facility (MIF) (støttet av Mary Babb Randolph Cancer Center og NIH tilskudd P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 og S10 RR026378) er takknemlig erkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27 G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
