Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS) zum Abbilden der Maus Lymphknoten. Diese Technik optimiert die Visualisierung und Quantifizierung der zervikalen Lymphknoten-Morphologie, Volumen und Durchblutung. Bild-geführte Biopsie der Lymphknoten und Verarbeitung von Lymphgewebe zur histologischen Auswertung wird auch gezeigt.
Abstract
Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS) wird weithin als eine nicht-invasive Methode zur Abbildung innerer anatomischer Strukturen in Kleintierversuchssystemen eingesetzt. HFUS hat die Fähigkeit, Strukturen so klein wie 30 & mgr; m zu erfassen, eine Eigenschaft, die für die Visualisierung oberflächlicher Lymphknoten bei Nagern in der Helligkeit (B) -Modus verwendet worden ist. Die Kombination von Power-Doppler mit B-Mode-Bildgebung ermöglicht die Messung von Kreislaufdurchblutung in Lymphknoten und anderen Organen. Während HFUS wurde für Lymphknotenbildgebung in einer Reihe von Mausmodellen verwendet, wurde ein detailliertes Protokoll beschreibt HFUS Bildgebung und Charakterisierung der Lymphknoten in Mäusen nicht beobachtet. Hier zeigen wir, dass HFUS angepasst werden, um zu detektieren und zu charakterisieren, Lymphknoten von Mäusen werden. In Verbindung B-Modus und Power-Doppler-Bildgebung kann zur Erhöhung der Blutfluss in immunologisch vergrößerten Halslymphknoten zu erkennen. Wir beschreiben auch die Verwendung von B-Bild, feine Nadelbiopsien der zervikalen Lymphknoten nicht durchführendes zu Lymphgewebe für die histologische Analyse abrufen. Schließlich werden softwaregestützte Schritte beschrieben, um Änderungen in Lymphknotenvolumen zu berechnen und um Änderungen in Lymphknoten Morphologie folgenden Bildrekonstruktion zu visualisieren. Die Fähigkeit, Veränderungen der zervikalen Lymphknoten Biologie über die Zeit visuell zu überwachen stellt eine einfache und leistungsfähige Technik für die nicht-invasive Überwachung der zervikalen Lymphknotenveränderungen in präklinischen Mausmodellen der Mundhöhle Krankheit.
Introduction
Lymphdrainage der interstitiellen Gewebsflüssigkeit ist die wichtigste Methode der Verbreitung von Infektions Mikroorganismen und Krebsarten, die sich in der Mund-Kiefer-Bereich 1,2. Klinische Prüfung von Lymphknoten ist eine gemeinsame diagnostischen Praxis verwendet, um das Vorhandensein oder das Fortschreiten von Krankheiten, die in der Mundhöhle stammen bestimmen. Dies unterstreicht die Bedeutung der Verwertungshalslymphknoten als wertvolle anatomischen Stellen für die orale Krankheitsdiagnose 3. Mehrere spezialisierte Abbildungsmethoden sind klinisch zur Identifizierung erkrankten Lymphknoten genutzt. Dazu gehören die Positronenemissionstomographie (PET), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MR). Während sehr wertvoll, diese Verfahren erfordern alle umfangreiche Vorbereitung des Patienten, hochspezialisierte Ausrüstung und / oder chemischen Infusion in den Kreislauf zu ermöglichen oder verbessern den Bildgebungsprozess.
Sonographische Bildgebung (Ultraschall, US) ist eine häufig angewandte Technik verwendet werden, um im,Alter Lymphknoten präsentiert mit Lymphadenopathie infolge einer Infektion oder metastasierendem Beteiligung 4-6. US wird häufig mit PET-CT und MR-Bildgebung kombiniert werden, um eine umfassende Darstellung des Patienten Lymphknotenstatus liefern und helfen, Tumorstaging und Notwendigkeit für chirurgische Exzision 7 zu bestimmen. Die nicht-invasive Natur der US hat auch inhärente Vorteile gegenüber anderen Bildgebungsmodalitäten, einschließlich Benutzerfreundlichkeit, geringe Kosten, geringe Beschwerden des Patienten und Vorbereitung. Die oberflächliche subkutane Lage der meisten Lymphknoten erlaubt uns, minimal-invasive Feinnadelaspiration Biopsien mit erhöhter Genauigkeit zu führen, die Verbesserung der diagnostischen Genauigkeit 8.
Handelshochfrequenz (HF) US liefert detaillierte Auflösung der internen anatomischen Strukturen bis 30 um 9. Verwendung Wandlern reicht von 22 bis 70 MHz, HFUS wurde leicht auf eine Vielzahl von experimentellen Nagetier Systeme angewendet, um Echtzeit-Abbildung der inneren Organe in vivo zu ermöglichen.; HFUS wurde zur Visualisierung von Tumorbildung bei herkömmlichen Helligkeit (B) -Modus mit einer Reihe von allgemeinen und speziellen Kontrastverstärkung agents9 angepasst sowie. Verwenden von Power-Doppler mit HFUS bietet die Möglichkeit, den Blutfluss innerhalb der Maus Tumoren zu überwachen, so dass eine umfassende Bewertung der angiogenen Perfusion in lebenden Mäusen 10,11. HFUS wurde zur erkrankten Maus Lymphknoten innerhalb des Hauptkörperhöhle zu visualisieren, was zeigt, parallel Nützlichkeit dieser Technologie auf die klinische Praxis. Insbesondere entzündlichen und viszerale Metastasen Lymphknoten Änderungen wurden in Maus-Modellen von Krebs beherbergen Brust 12,13, Bauchspeicheldrüsen 14, colorectal 15 und 16 Lungentumoren sowie Faser histocytomas 17 und einen alten Mausmodell der erworbenen Hydronephrose 18 beobachtet . Diese Beispiele verfestigen den Wert HFUS als leistungsstarkes Ermittlungswerkzeug für die tumorinduzierte Lymphadenopathie in einer Vielzahl von rodent Systeme.
Mehrere Modelle von bakteriellen Infektionen 19,20 und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) 21,22 wurden entwickelt, um diese Krankheiten in der präklinischen Einstellung zu studieren. Im Gegensatz zu Menschen, Mäuse enthalten drei Halslymphknoten, die Lymphe aus Geweben der Mundhöhle (Unterkiefer, Unterkiefer und Kieferspeichel oberflächliche Ohrspeichel 23) zu überblicken. Kürzlich haben wir die Verwendung von HFUS, um den Ort und die Morphologie dieser Lymphknoten abzubilden, Überwachen von Änderungen Lymphknotenvolumens und den Blutfluss in Karzinogen-induzierte Mausmodell HNSCC 24. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung HFUS zur Identifizierung, Bildgebung und Analyse von zervikalen Lymphknoten in lebenden Mäusen. Dieses Protokoll zeigt auch die Machbarkeit der Verwendung HFUS um bildgeführte Feinnadelbiopsie der erweiterten Maushalslymphknoten durchzuführen, so dass die histologische Überwachung von Veränderungen der zervikalen Lymphknoten Inhalt und Pathologien über time in dem gleichen Tier. Dieses Protokoll ist leicht an für die detaillierte Untersuchung der Halslymphknotenerkrankungen resultierende von jeder invasive Mundhöhle Krankheit bei Mäusen zu ermöglichen.
Protocol
Alle tierischen Verfahren in diesem Protokoll nachgewiesen wurden überprüft und von der West Virginia University Animal Care und Verwenden Committee unter Protokolle 11-0412 und 14-0514 genehmigt und in Übereinstimmung mit den Grundsätzen und Verfahren in der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung beschrieben durchgeführt der Tiere.
1. Vorbereitung der Tiere
- Betäuben eine einzige Maus in einer Induktionskammer unter Verwendung von 3% Isofluran mit 1,5 l / min 100% Sauerstoff gemischt. Zu entfernen, das Tier von der Induktionskammer und in eine Rückenlage auf der Abbildungsplattform auf 40ºC vorgewärmt und zwischen 37-42 ° C (2A) gehalten wird. Anästhesie bestätigen das Fehlen einer Reaktion auf eine Zehe Prise.
- Bewegen Sie die Maus Schnauze im Nasenkonus auf die Anästhesie-System angeschlossen. Bewerben Anästhesie zu stationären Sedierung (1,5% Isofluran mit 1,5 l / min 100% Sauerstoff gemischt) zu halten.
- Bewerben Auge Schmiermittel die jedes Auge, um zu verhindern Trockg. Gelten Elektroden-Gels mit den Elektroden und mit Band an jeder der vier Pfoten an der entsprechenden Elektrode zu sichern. Die Elektrodenkontaktstellen wird das Tier EKG zum Abbildungssystem zu übertragen, um die Überwachung der Herzfrequenz und Atemfrequenz zu ermöglichen. Schmieren und legen Sie die rektale Temperatursonde zur kontinuierlichen Überwachung der Körpertemperatur. Normale Maus Körpertemperatur 36,9 ° C. 1-2 ° C Abweichung ist normal, während der Narkose.
- Verwenden Enthaarungscreme, um das Fell aus dem Hals der Maus zu entfernen. Den Halsbereich gründlich mit Wasser getränkten Gaze um Haare und überschüssiges Enthaarungscreme entfernen. Optional können zusätzliche Anwendung Enthaarungscreme, um alle verbleibenden Körperhaare (2B) entfernen.
2. Identifizierung und Image Acquisition of Mouse Halslymphknoten Mit HFUS
- Um zu beginnen, eine Schicht von erwärmt Ultraschall-Gel auf den Nackenbereich frei von Fell. Verwenden liberale Anwendung von Gel für optimale BildQualität (2C). Vermeiden Einführen von Luftblasen in das Gel während der Applikation, die mit Ultraschallbildgebung beeinträchtigen können.
- Stellen Sie die Imaging-Plattform 20-30 °, so dass die Maus mit dem Kopf leicht erhöht positioniert. Diese Position hilft, die optimale Atemfrequenz für die Maus zu gewährleisten. Legen Sie die 40-MHz-Wandler quer in das Montagesystem und vorsichtig absenken, bis die Front des Wandlers Schallkopf ist in der Ultraschall-Gel (2C) eingetaucht.
HINWEIS: Achten Sie darauf, keinen starken Druck auf die Maus Hals, wie es sein könnte unangemessene Atemnot verursachen. Darüber hinaus ist es hilfreich für die Bildgebung, um einen Puffer von Gel zwischen dem Wandler und der Maus haben.
B-Modus-Bildgebung und Nachweis von Lymphknoten:
- Mit dem Computer die Steuerung der HFUS Erfassungssoftware, die Helligkeit (B-) Moduseinstellungen auf die folgenden Parameter: Gain 22 dB, Tiefe 10,00mm, Breite 14,08 mm.
HINWEIS: Diese Einstellungen werden eine vorgeschlagene Ausgangspunkt und kann leichte Anpassung für optimale Bildaufnahme zwischen verschiedenen Anwendungen benötigen. Übliche Halslymphknoten als oval echoarme Strukturen in der Nähe der Hautoberfläche innerhalb eines umgebenden echo Feld. Das Aussehen der erkrankten Lymphknoten können je nach Modell verschieden. Systematisch Bild alle Lymphknoten im Halsbereich die folgenden Schritte aus:- Verwenden Sie die Y-Achse, um den Hals in einem Schädel scannen, um Art und Weise gegenüber der Brustregion kaudal. Verwendung der X-Achse, um das Bild zu zentrieren.
- Identifizieren wichtigen Sehenswürdigkeiten: Mundhöhle, Zunge und Schilddrüse (3A, B und C, jeweils); kippen Sie den Imaging-Plattform horizontal einstellen ventralen Oberfläche der Maus Hals, so dass beide Seiten des Halses auch in B-Mode-Bild der angezeigt. Der Betrag des Kippens hängt von der Physiologie des einzelnen Maus.
- Suchen Sie die Zunge / Mundhöhle Bereich (3A), und notieren Sie die numerische Position auf dem Y-Skala.
- Finde Schilddrüse (3C) und beachten Sie die numerische Position auf dem Y-Skala.
- Berechnen der Differenz zwischen den erhaltenen Werten in (2.4.1) und (2.4.2), die Gesamtlänge in mm für das abgebildete Halsbereich zu bestimmen.
- Verwenden Sie den Y-Knopf, um den Wandler auf der Mitte des ermittelten Gesamtlänge zentrieren.
- Drücken Sie "3D". Geben Sie die Gesamtlänge. Bei 3D-Schrittweite, benutzen 0,076 mm, um das Bild-Serie Stack für die gesamte Halsbereich zu erwerben.
- Nachdem der Scanvorgang abgeschlossen ist, wählen Sie den rechten oder linken Seite des Halses und zentrieren den Wandler auf individueller Lymphknoten von Interesse, heben Sie dann den 40 MHz-Sonde von der Maus. Entfernen Sie den 40-MHz-Schallkopf und ersetzen mit einem 50 MHz microWandler (auch in einer Querlage), um mit höherer Auflösung Bilder zu erhalten. Füllt die Ultraschall-Gel auf der Maus Hals und senken Sie die 50 MHz-Schallkopf in die Ultraschall-Gel.
3D-Power-Doppler-Imaging
- Conduct 3D-Scans mit Power-Doppler zu beurteilen, Volumen und Durchblutung einzelner Lymphknoten wie folgt:
- Drücken Sie die POWER-Taste auf der Tastatur, um Systemleistung Dopper die folgenden Power-Modus-Einstellungen zu erwerben und anpassen: PRF 4 kHz Doppler gewinnen 34 dB, 30 dB Verstärkung 2D, Tiefe 5,00 mm, Breite 4,73 mm. HINWEIS: Nach wie vor sind diese Einstellungen eine vorgeschlagene Startpunkt und kann geändert werden, für die optimale Bildaufnahme in verschiedenen Modellen benötigt werden.
- Suchen Sie die Schädel-Punkt der Lymphknoten in der Nähe, und beachten Sie die Position auf der Y-Skala.
- Suchen Sie die am Schwanzpunkt des gleichen Knoten und MitteilungsDie Lage auf dem Y-Skala.
- Berechnen Sie den Abstand Differenz, um die Gesamtlänge des Lymphknotens festzustellen (siehe Schritt 2.4.3).
- Zentrieren Sie den Wandler auf der Mitte des ermittelten Gesamtlänge, mit der Y-Skala Lage.
- Drücken Sie auf "3D" und geben insgesamt Lymphknoten Länge. Verwenden 0,051 mm für die Schrittweite.
Hinweis: Durch die Nähe des Wandlers zum Brustbereich, dem 50 MHz Wandler kann in einer instabilen Bild Doppler aufgrund einer Detektion normalen Atembewegung führen. Dies kann mit Hilfe der Option "Respiration Gating" in der Registerkarte "physiologische" beseitigt werden. - Umgeben den ausgewählten Lymphknoten mit der gelben Box, die die Region bezeichnet, die von Power-Doppler untersucht werden, und wählen Sie "3D-Scan", um Bilder zu erwerben. Heben Sie den Wandler aus der Maus und verschieben Sie sie in die gegenüberliegende Seite des Halses. Senken Sie den Wandler auf die Maus und wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte, um image Lymphknoten auf dieser Seite des Halses.
- Sparen Bildsätze für die anschließende Analyse.
3. Cervical Lymph Node Biopsy
- Wählen Sie die gewünschte Lymphknoten Biopsie und pflegen HFUS Bildgebung mit der 50 MHz-Schallkopf. Wählte die größten sichtbaren zervikalen Lymphknoten in jeder Seite der Maus Hals. Lymphknotenvergrößerung in der Regel zeigt eine Entzündungsreaktion und damit solche Knoten sind ideale Kandidaten für die Biopsie.
HINWEIS: Wir haben festgestellt, es ist sehr schwierig, Biopsien am Halslymphknoten kleiner als 10 mm 3 durchzuführen. - Vorbereitung der Nadel und einer Spritze für eine Biopsie durch Anordnen einer 1 ml Spritze mit aufgesetzter 27 G, 0,5 Inch Nadel in den Spritzenhalter. Justieren des Nadelhalters, um die Nadel auszurichten 90º zur Maus Hals (4A).
- Die Herstellung erfolgt nach Anheben der gesamten Maus-Plattform auf die Höhe der Nadel. Dies erreichen, indem Sie die 3D-Motor und die Umstellung auf eine größere Plattform, oder indem Sie einen festen Gegenstand geeigneter Höhe unter dem vorgesehenen Kurz Plattform. Verwenden Sie einen Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen Rack für diesen Zweck. Wenn erforderlich, dann ist die Plattform um 180 ° um die Biopsie Knoten auf der Seite des Halses gegenüber dem Nadelvorrichtung angeordnet.
- Stellen Sie die Übernahme Einstellungen, indem Sie "Einstellungen", dann mit der Auswahl "Max & Verlängerungspuffer". Vergrößern Sie das Sichtfeld bis zu einer Tiefe von 8,00 mm und einer Breite von 9,73 mm. Schalten Sie die Nadelführung mit dem Screen-Tasten wählen. Die Nadelführung wird den Weg der Nadel auf dem Bildschirm vorherzusagen und erlaubt dem Benutzer, in der richtigen Position für die Biopsie Line-Up der Lymphknoten in der Umgebung.
- Sicherzustellen, dass die Lymphknoten bleibt ständig im Blick durch Zentrieren der Lymphknoten in der Mitte oder etwas nach links der Mitte auf dem Bildschirm (4B). Um die gesamte Filmschleife des Verfahrens zu erhalten, drücken Sie Pre-Trigger für die Systemtastatur vor Beginn der Biopsie.
- Stellen Sie den Nadelhalter, bis die Nadelspitze in Sicht und in Kontakt mit der Haut (4B) kommt. Voran die Nadel mit einer festen, schnell drücken, um die Haut zu durchstechen. Weiter, um die Nadel vor, bis die Spitze durchsticht auch die Kapsel (4C) und befindet sich in der Medulla (4D) sichtbar.
- Sobald die Nadel richtig in dem Knoten befindet, ziehen Sie den Spritzenkolben zurück zwischen den 200-300 ul Abgrenzungen, um die Biopsie (4D und 4E) durchzuführen. Man beachte, daß Biopsiematerial ist typischerweise nicht in der Spritze sichtbar.
- Entfernen Sie vorsichtig die Nadel aus der Maus Hals. Vertreibung der Spritzeninhalt in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Nach Entfernen der Nadel von der Spritze, wobei die Nadel in der Röhre. Sammeln von 1 ml Biopsie Medien (aus einem aliquoten getrennt vom Lager Quelle) mit einer Spritze und dann wieder zu befestigen, um die Nadel der Spritze, während die Nadel in the Rohr.
- Spülen Sie die Spritze und Nadel mit den Biopsie Medien durch die Vertreibung der Biopsie-Medien in die Röhre.
HINWEIS: Ziehen Sie nicht zurück auf den Kolben, während die Nadel an einer beliebigen Stelle nach der Biopsie angebracht. Dies reduziert das Risiko des Verlustes der Biopsiematerial aufgrund der kleinen Probengrße.
- Spülen Sie die Spritze und Nadel mit den Biopsie Medien durch die Vertreibung der Biopsie-Medien in die Röhre.
- Bestätigen Lymphknotengehalt durch histologische Mittel (4F) und weitere Verfahren (Histochemie, Durchflusszytometrie, etc.) gegebenenfalls zu analysieren.
- Sobald Biopsie abgeschlossen ist, schalten Sie die Anästhesie und entfernen Sie die rektale Temperatursonde. Entfernen Sie überschüssiges Ultraschall-Gel aus der Maus mit Gaze, und entfernen Sie das Klebeband von jeder Pfote.
- Entfernen Sie die Maus vom Imaging-Plattform und zurück zum Käfig. Minimale Blutungen aus Biopsiestelle auftreten, aber das stoppt ohne Intervention. Überwachen Sie die Maus während der Wiederherstellung bis zur vollständigen Tätigkeit wieder aufgenommen wird.
4. Bildanalyse der Halslymphknoten
- Wählen Sie "3D-Rekonstruktionsbild" in der linken oberen Ecke, Sie auf den "Display Einzel Pane" -Taste. Verwenden Sie die Zoomfunktion das Bild zu vergrößern, falls gewünscht. Toggle "Display Layout", um das Bild nur im B-Modus, der die Power-Doppler-Overlay aus dem Blickfeld entfernt zu sehen. Dies macht es einfacher, die Kanten des Lymphknotens bei nachfolgenden 3-D-Analyse anzuzeigen. Blättern Sie in der Bilderserie auf den Beginn der Lymphknoten zu lokalisieren.
- Um die Lymphknoten zu umschreiben, navigieren Sie zu der Registerkarte "3D-Einstellungen". Wählen Sie "Lautstärke", dann die "Start" Taste neben "Parallel".
- Zeichnen Konturen um den interessierenden Bereich innerhalb der einzelnen Bilder durch Scrollen. Fortfahren, bis Bilder, die den gesamten Lymphknoten umfassen werden markiert. Wählen Sie "Fertig stellen"vervollständigen die Analyse.
- Am unteren Rand des Bildes wird 3D-Volumen und% Vaskularität automatisch angezeigt.
HINWEIS: 3D-Volumen entspricht dem Lymphknoten Volumen und prozentuale Vaskularisierung stellt den Prozentsatz des Lymphknotens positiv auf den Blutfluss durch Power-Doppler. - Toggle "Display Layout", um die Power-Doppler-Bildgebung als Überlagerung auf der B- Modus-Bild anzuzeigen. Auf der Oberfläche Ansicht beobachten einen Netto Blick auf den Volumenbereich von Interesse. Exportieren Sie die Bilder in Tagged Image File (TIF) Format oder 3D-Scans als Filme (avi) zur weiteren Verwendung.
Representative Results
Das Gesamtschema für die Bildgebung und Biopsieverfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Die wichtigsten Schritte des Verfahrens sind die richtige Vorbereitung der Maus für die Bildgebung, die Identifizierung der Halslymphknoten, korrekte Vorbereitung und Durchführung der Nadelbiopsie, und die Analyse der B -Modus und Doppler-Bilder, um die Lautstärke und die Menge der Durchblutung in jedem ausgewählten Knoten mit Computer-Software zu messen.
HFUS Bildgebung von Maus Halslymphknoten erfordert die Anwendung und Aufrechterhaltung richtige Anästhesie in der gesamten Bildaufnahmeperiode (2A), als auch die vollständige Entfernung der Haare über die gesamte Halsbereich (2B). Die liberale Anwendung von Ultraschall-Gel auf die enthaarte Gebiet gewährleistet eine klare HFUS Signal während des Verfahrens (Abbildung 2C).
HFUS Abbildung des Halsbereichs wird durch die Visualisierung von anatomischen Landmarken, die zervikale charakteristischen Ultraschallbilder zu erzeugen unterstützt. Fig3 zeigt Beispiele der wichtigsten Organe (3A-C), Lymphknoten im B-Modus (Figur 3D) und Power-Doppler-Modus (Figur 3E).
Echtzeit-Bildgebung HFUS bei narkotisierten Mäusen ermöglicht geführte Feinnadelbiopsie der Halslymphknoten ähnlich dem, was in der klinischen Praxis durchgeführt. Platzierung der Biopsiekanüle und Entnahmespritze angebracht zu der Steuer Mikroinjektor Ausrüstung ist in 4A gezeigt. Anschließende B-Mode-Ultraschallbilder zeigen ideal Nadelplatzierung vor der Biopsie (4B), Nadelspitze Eintritt in einen zervikalen Lymphknoten (4C) und Nadelposition während Biopsie (4D). Close-up Bild zeigt die Nadelspitze in der Medulla der Lymphknoten (4E). Die Verarbeitung der Biopsie Komponenten durch Cytospin zeigt reichlich lymphatischen Zellhaufen und zugehörige Bindegewebe, die Überprüfung erfolgreich LymphknotenBiopsie (4F).
Computational-basierte Analyse von HFUS Bilder können für detaillierte Informationen über Lymphknotenarchitektur, Volumen und Gefäßfluss zu erhalten. Verwenden von Power-Doppler-Modus und 3D-Volumenmessungen Prozent Vaskularität (PV) kann von Bild-Serie umfasst gesamten Knoten (5A) berechnet werden. Darüber hinaus ermöglicht die 3D-Bildgebung für den Wiederaufbau virtuelle Lymphknoten und enthüllt Gesamtlymphknoten Topographie (5B).
Abb. 1: schematische Übersicht der Schritte in diagnostischen HFUS zervikalen Lymphknotens Bildgebung in Mäusen beteiligt Die wichtigsten Schritte sind 1: Vorbereitung der Mäuse HFUS Bildgebung und Gewinnung 40 bis 50 MHz auflösende Bilder der Halsbereich mit den drei Maus-Lymphknoten . 2: Feine Nadelbildgeführte Biopsie der Lymphknoten und die anschließende histologische Analyse der Biopsie Material. 3: Die computergestützte Bildanalyse und 3D-Rekonstruktion von Lymphknoten Bilder in B-Mode- und Doppler erhalten, um die jeweiligen Lymphknoten Volumen und Prozent (%) der vaskulären Strömung bestimmen.
Abb. 2: Übersicht über die hohe Auflösung in vivo Mikro-Bildgebungssystems für zervikale Lymphknoten Beurteilung und Biopsie (A) Die HFUS System ist mit einer narkotisierten Maus für zervikale Lymphknoten Bildgebung bereit gezeigt. Ebenfalls dargestellt ist die Mikroinjektor (MI) und 3D-Motorstufe (3D MS) Zusatzausrüstung. (B) Schließen Sie herauf Ansicht eines betäubten Maus für HFUS Bildgebung mit dem Haar im Halsbereich entfernt vorbereitet. (C) Das gleiche Maus mit der 50 MHz-Sonde an Ort und Stelle auf dem Hals. Beachten Sie die zusätzlichen Ultraschall-Gel verwendet werden, um Halsbereich Bildgebung ermöglichen.
718fig3.jpg "/>
Abbildung 3: Repräsentative HFUS Hals Anatomie Bilder in B-Mode und Power-Doppler. (A, B) B-Modus-Bilder von der Mundhöhle, die die Mundhöhle (BC) und der Zunge (T) durch die Abbildung in der Nähe des Nasenhöhle visualisiert. Die drei Halslymphknoten auf jeder Seite des Halses gefunden (bezeichnet M, Kiefer; SM, Glandula; SP, oberflächliche Parotis) als (B) gezeigt, werden als eine Gruppe von echo Strukturen in einem einzigen Bildebene. (C) Die Schilddrüse (Th), wie in der oberen Brustbereich sichtbar gemacht, als Feststoff, echogenen schmetterlingsförmige Struktur erscheinen. (AC) wurden mit einem 40 MHz-Sonde sichtbar gemacht; Maßstabsbalken = 1 mm. (D, E) Repräsentative Bilder der normalen (D) und erweiterten (E) Halslymphknoten mit B-Mode und Power-Doppler (rot). Gestrichelten Linien zu skizzieren Einzel Lymphknoten. Maßstabsbalken = 0,5 mm.
Abbildung 4: Cervical-Lymphknoten-Biopsie Set-up, Imaging und Cytospin Analyse der Biopsiematerial (A) Die Imaging-Plattform, die die Mikro-Injektor und Nadelplatzierung in der Nähe der Maus Hals.. Eine große Reaktionsgefäß-Ständer (orange-Block) wird verwendet, um leicht erhöhen die Plattform, die den richtigen Nadelplatzierung und es trotzdem erlauben Raum für die 3D-Motorstufe. Diese Anordnung minimiert Zeitaufwand für das Entfernen der Motorstufe für jede Maus. (B - D) insgesamt Hals HFUS Bilder aus einem Video von einem Hals-Lymphknoten-Biopsie mit der 50 MHz-Sonde gemacht. (B) HFUS B-Modus-Bild, das die Nadel an der Seite des Halses vor Biopsie angeordnet ist. Die Nadelspitze ist die echoreiche Struktur direkt unterhalb der Position der Nadelführung (grüne gestrichelte Linie) während der Bilderzeugung, um die Nadel Trajektorie bezeichnen lagert. Lymphknotens in der Mittedas Bild. Maßstabsbalken = 1 mm. (C) Nadeleinstich in die Lymphknoten. (D) Biopsie der zervikalen Lymphknoten. (E) Zoomed Biopsie der zervikalen Lymphknoten. Maßstabsbalken = 0,5 mm. (F) Cytospin Analyse der repräsentativen Biopsie Lymphe Material bestätigt erfolgreiche Biopsie. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m.
Abb. 5: Computer-Analyse von 3D-Hals-Lymphknoten-Bilder (A) Repräsentative Screenshot von einem Lymphknoten analysiert mit Computer-Software. Der Knoten wird in blau umschrieben; Analyseergebnisse zeigen, 3D-Volume und Prozent Vaskularität (PV) wie angegeben. (B) ein Oberflächenbild Blick auf demselben Knoten nach der 3D-Analyse. Rendert gesamte Volumen Lymphknoten basierend auf Messungen in A.
Discussion
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Visualisierung und in situ Auswertung murine Lymphknoten nicht-invasiv HFUS Bildgebung. Die Verwendung von B-Mode- und Doppler-Bildgebung Leistung zu visualisieren zervikalen Lymphknotens Morphologie bietet Volumen und Lymphknoten Blutfluß für eine experimentelle Analyse präklinischen Mausmodellsystemen ähnlich der für die Charakterisierung des zervikalen Knoten Patienten in der klinischen Praxis verwendet. Die Fähigkeit, die Cervial Lymphknoten über Feinnadelbiopsie überwachen stellt auch eine nützliche Technik zum Nachweis von Immunzellen Veränderungen und die Anwesenheit ausländischer Zelltypen oder Bakterien während der Mundhöhle Krankheit induzierte Lymphadenopathien bei Mäusen. Die einfache Handhabung und niedrige Kosten mit HFUS assoziiert ermöglicht das schnelle Screening von Gebärmutterhalskrebs Lymphknotenstatus in einer Vielzahl von Tiermodellen.
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist das zunächst erfolgreicher Identifizierung der Lymphknoten in HFUS Bilder. Unsere Anlage verfügt über ein Sortiment von HFUS transducers wie beschrieben, so dass wir sie benutzt haben, um Bilder von höchster Qualität zu erhalten. Wenn die Wandler beschreiben wir die nicht verfügbar sind, ist es jedoch möglich, die Bilderzeugung unter Verwendung anderer Sensoren anzupassen. Zu diesem Zweck wird die Einstellung der Bildtiefe und Breite, um eine ausreichende Bild erhalten, ist alles, was erforderlich. Auflösung solcher Bilder kann variieren, es sollte jedoch immer noch möglich sein, Bilder hoher Qualität unter Verwendung HFUS erhalten. Abbildungs Sehenswürdigkeiten der Mundhöhle und der Schilddrüse werden große Hilfe bei der Ausrichtung des Benutzers an die richtige Bereich, wo die Lymphknoten lokalisiert. Die charakteristische ovale, echoarme Art und oberflächliche Lage in der Nähe der Hautoberfläche ermöglicht eine schnelle Identifizierung der Zweithalslymphknoten in der richtigen Halsbereich. Während alle drei Knoten können in einer einzigen Bildebene (3B) sichtbar werden, werden typischerweise eine oder zwei Knoten während der Bilderzeugung erfasst. Kleinere Anpassungen der Wandlerposition durchgeführt, um zu zerreißen werdener verschiedene Bildebenen sichtbar und ermöglicht die Visualisierung aller Knoten auf einer einzigen Seite des Halses.
Zwar haben wir die beschriebene Technik zuverlässig zum Identifizieren zervikalen Lymphknoten gefunden werden, gibt es bestimmte Beschränkungen für die Bildgebung und Biopsietechnik. Die oberflächliche Natur der Maus Halslymphknoten verleiht übermäßige Mobilität auch leichten Druck auf die Haut über den Wandlerkopf angewendet. Dies kann durch langsames Anlegen der Wandlerkopf in die Ultraschall-Gel auf der Maus Hals, bis die Wahrzeichen Bilder identifiziert werden entgegengewirkt werden. Lymphknoten Mobilität kann auch erschweren die Feinnadelbiopsie, insbesondere bei Verwendung von Sensoren in der höheren Auflösung (50 MHz) -Bereich. Zentriert Bilder von Lymphknoten für die Biopsie werden typischerweise aus dem Sichtfeld auf Grund der Kraft der Biopsienadel benötigt, um die darüber liegende Haut und die Kapsel zu durchstechen geschoben. Dies kann durch die außermittige Positionierung der Lymphknoten in Richtung der Nadeleinstich behoben werden kann,Nutzfläche die Lymphknoten, über geschoben werden, aber dennoch im Sichtfeld während der Biopsie. Nach unserer Erfahrung Lymphknoten> 10 mm 3 sind sehr schwierig zu Biopsie, und werden häufig durch die Nadel während der Nadelvorschub geschoben anstatt eingedrungen. So wird Biopsie am besten für vergrößerte Lymphknoten, wo die Größe ist reserviert> 10 mm 3, um eine ausreichende Knotenzielgröße und Stabilität im Halsbereich zu gewährleisten. Zusätzlich kann Biopsiematerial enthält ausreichende Zellzahlen für Verfahren, bei denen größere Zellzahlen benötigt werden (zB Durchflusszytometrie).
HFUS wurde genutzt, um erfolgreich zu visualisieren orthotopen HNSCC Tumoren 25 und hat das Potenzial, Halslymphknotenmetastasen in Mäusen, die mit oralen Tumoren 24 zu überwachen. Zusätzlich zu Ultraschall hat Biolumineszenz-Bildgebung auch verwendet worden, um oral orthotope Tumorbildung und zervikalen Lymphknoten-Metastasen in lebenden Mäusen 26,27 visualisieren. Als alterntive Ansatz hat Biolumineszenz-Bildgebung einen deutlichen Vorteil gegenüber HFUS in der Lage, direkt zu quantifizieren Tumorprogression und metastasierendem Belastung im Laufe der Zeit in dem gleichen Tier. Während zweifellos nützlich ist Biolumineszenz-Bildgebung nicht in der Lage, viele der Parameter durch HFUS visualisiert, einschließlich Lymphknoten Morphologie Knotenvolumen oder den Blutfluss zu messen. Biolumineszenz-Bildgebung erfordert auch spezialisierte dunklen Kästen an Mäuse während der Bildgebung zu halten, wodurch diese Technik für die Anpassung für Feinnadelbiopsie ungeeignet.
Weiterhin Biolumineszenz-Bildgebung erfordert die Herstellung von Tumorzellen, die stabil exprimieren das Luciferase-Enzym, so dass dieses Verfahren nur in den Fällen von orthotope Xenotransplantaten mit Luciferase-transfizierten Tumorzellen in immunsupprimierten Mäusen oder mit induzierbarer gewebsspezifische transgenen Systemen, die Luciferase-Expression verwendet werden, beschränken in einem räumlich-zeitlichen spezifische Weise an das Gewebe von Tumor Ursprungs. Im Gegensatz dazu kann HFUS U BEin Verbindung mit Biolumineszenz Bilder in diesen Modellen Sed, sowie in der Lage ist Abbilden Lymphknoten in Modellen der Karzinogen-induzierte oralen Tumoren in Mäusen mit vollständigen Immunsystem 28,29. Während HFUS kann mehr an die meisten Mausmodellen von Mundkrebs, der in Kombination gegenüber der Biolumineszenz und HFUS Bildgebung in Systemen erhalten werden können, in denen Tumorzellen exprimieren Luciferase kann ein vollständigeres Bild der zervikalen Lymphknotenbefall als die beiden bildgebenden Verfahren allein bieten.
Die Fähigkeit, in Echtzeit zu identifizieren und zu erfassen Maus Lymphknoten erlaubt diese Technik in den meisten Modellen von Erkrankungen der Mundhöhle, die in entzündlichen Lymphadenopathie, den das Tier in einer umgekehrten Position unter Kurznarkose aufrechterhalten werden Ergebnisses verwendet werden. Nachweis von Lymphknotenmetastasen oder bakterielle Infektion und der damit verbundenen Auswirkungen auf die Lymphknoten-Morphologie in lebenden Tieren stellt einen signifikanten Vorteil gegenüber traditionellen Methodenführen, die Lymphknoten, um von toten Tieren zur histologischen Verarbeitung entfernt werden. Kombinieren HFUS mit Feinnadelbiopsie erlaubt eine Einrichtung zum Leiten pathologische Routineanalyse des zervikalen Lymphknoten, ähnlich dem, was in der Klinik durchgeführt, ein verbessertes Verfahren zur Überwachung der Progression der Erkrankung in den meisten aktuellen Mausmodellen der Mundhöhle Erkrankungen.
Disclosures
Publikationskosten für diesen Artikel sind die von Visual Sonics gesponsert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Dorothy D. Radford Stiftungsfonds von der West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center unterstützt. Die Verwendung der West Virginia University Tiermodellen und Imaging Facility (AMIF) und Mikroskopie Imaging Facility (MIF) (von der Mary Babb Randolph Cancer Center und NIH Zuschüsse P20 RR16440 unterstützt, P30 RR032138 / GM103488 und S10 RR026378) gedankt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27 G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
