Summary
Этот протокол описывает применение высокочастотного ультразвука (HFUS) для визуализации мыши шейных лимфатических узлов. Этот метод оптимизирует визуализацию и количественную шейки морфологии лимфатических узлов, объема и кровотока. Изображение биопсия шейки матки лимфатических узлов и лимфатических обработки ткани для гистологического исследования также показали,.
Abstract
Высокочастотный ультразвуковой (HFUS) широко используется в качестве неинвазивного метода визуализации для внутренних анатомических структур в экспериментальных малых систем животных. HFUS имеет способность обнаруживать структуры, как малые, как 30 мкм, имущество, которое было использовано для визуализации поверхностных лимфатических узлов у грызунов в яркости (B) -Режим. Сочетание мощности доплеровского с изображения в В-режиме позволяет для измерения кровообращения кровоток внутри лимфатических узлов и других органов. В то время как HFUS была использована для визуализации лимфатических узлов в ряде модельных систем мыши, не сообщалось Подробный протокол описания HFUS изображений и характеристику шейных лимфатических узлов у мышей. Здесь показано, что HFUS может быть выполнен с возможностью обнаружения и характеризуют шейных лимфатических узлов у мышей. В сочетании в В-режиме и мощность допплерографии может быть использован для обнаружения увеличения кровотока в иммунологически увеличенных шейных узлов. Мы также не описывают использование изображений в В-режиме, чтобы провести тонкую иглу биопсии шейки лимфы нетде, чтобы получить лимфатической ткани для гистологического анализа. Наконец, программное обеспечение автоматизированного шаги описаны для расчета изменения в лимфатических узлов и объема визуализировать изменения в лимфатических узлов морфологии следующие реконструкции изображения. Возможность визуально контролировать изменения в шейном биологии лимфатических узлов в течение долгого времени обеспечивает простую и мощную технику для неинвазивного мониторинга шейки изменений лимфатических узлов в доклинических моделях мыши болезни полости рта полости.
Introduction
Лимфодренаж из межклеточной жидкости ткани является основным методом распространения инфекционных микроорганизмов и раковых, возникающих в челюстно-лицевой области 1,2. Клиническая оценка шейных лимфатических узлов является общей практикой диагностики используется для определения наличия или прогрессирования заболеваний, которые возникают в ротовой полости. Это подчеркивает важность сбора шейных лимфатических узлов, как ценные анатомических участков для диагностики заболеваний полости рта 3. Несколько специализированных методик визуализации клинически используется для идентификации больные шейные лимфатические узлы. Они включают в себя позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), компьютерной томографии (КТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ). В то время как очень ценный, все эти методы требуют тщательной подготовки пациента, высоко специализированное оборудование и / или химического настой в обращение, чтобы включить или усилить процесс формирования изображения.
Ультразвуковое исследование (УЗИ; США) является широко применяется метод, используемый для имвозраст шейные лимфатические узлы, представляющие с лимфаденопатией из-за инфекции или метастатического поражения 4-6. США часто сочетается с ПЭТ-КТ и МРТ, чтобы обеспечить всестороннее представление пациента лимфатических узлов статуса, помогая определить постановку опухоли и необходимость хирургического иссечения 7. Неинвазивный характер США также имеет свои достоинства по сравнению с другими методами визуализации, в том числе простота использования, низкая стоимость, минимальным дискомфортом для пациента и подготовки. Поверхностные подкожные расположение большинства шейных лимфатических узлов позволяет США вести минимально инвазивных тонкоигольная аспирационная биопсия с повышенной точностью, улучшение диагностической точности 8.
Коммерческая высокочастотный (ВЧ) США предоставляет подробную разрешение внутренних анатомических структур до 30 мкм 9. Использование преобразователей в диапазоне от 22-70 МГц, HFUS был легко применены к различных экспериментальных систем грызунов, чтобы в реальном времени изображений внутренних органов в живом организме.; HFUS была адаптирована для визуализации образования опухоли в обычной яркости (В) -Режим, а также с рядом общих и специализированных усиления контраста agents9. Использование энергетического допплера с HFUS предоставляет возможность контролировать кровоток в опухоли мыши, что позволяет комплексную оценку ангиогенной перфузии в живом мышей 10,11. HFUS был использован для визуализации больные мыши лимфатические узлы в пределах главного полости тела, демонстрируя параллельный полезность этой технологии в клинической практике. В частности, воспалительных и метастатических лимфоузлов висцерального изменений были обнаружены в мышиных моделях рака молочной железы, несущим 12,13 поджелудочной 14, колоректальный 15 и 16 легких опухолей, а также волокнистые histocytomas 17 и выдержанный мыши модель приобретенного гидронефрозе 18 , Эти примеры затвердеть значение HFUS как мощный инструмент для следственной индуцированного опухолью лимфатических узлов в самых разнообразных ровмятина системы.
Некоторые модели бактериальной инфекции 19,20 головы и шеи плоскоклеточного рака клеток (ПРГШ) 21,22 были разработаны для изучения этих болезней в доклинической обстановке. В отличие от человека, мышей содержат три шейные лимфатические узлы, которые опроса лимфы от тканей полости рта (нижней челюсти, нижней челюсти и подчелюстной околоушной поверхностного 23). Недавно мы сообщали, использование HFUS на карту расположение и морфологию этих лимфатических узлов, мониторинга изменений в лимфатических узлов и объема кровотока в канцероген-индуцированного мышиной модели ПРГШ 24. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования HFUS для выявления, визуализации и анализа шейные лимфатические узлы в живых мышей. Этот протокол также демонстрирует возможность использования HFUS провести Image- руководствуясь тонкой иглой биопсии увеличенный мыши шейных лимфатических узлов, что позволяет гистологическое мониторинг изменений в шейных лимфатических узлов содержания и патологий более тIME в том же животного. Этот протокол можно легко приспособить для обеспечения детального изучения шейки матки патологии лимфатических узлов полученных от любого инвазивного заболевания полости рта полости у мышей.
Protocol
Все процедуры на животных продемонстрировали в этом протоколе были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию Западной Вирджинии университет животного по протоколам 11-0412 14-0514 и и проводится в соответствии с принципами и процедурами, изложенными в Руководстве NIH по уходу и использованию животных.
1. Подготовка животных
- Обезболить один курсор в индукции камеры с использованием 3% изофлуораном, смешанный с 1,5 л / мин 100% кислорода. Удалить животное от индукции камеры и места в лежачем положении на платформе изображений, предварительно нагретый до 40 ° С и поддерживают между 37-42 ° C (фиг.2А). Подтвердите анестезии отсутствием ответа на носок щепотку.
- Расположите морду мыши в головная, подключенного к системе анестезии. Применить анестезию, чтобы сохранить устойчивое состояние седации (1,5% изофлуораном, смешанный с 1,5 л / мин 100% кислорода).
- Применить глаз смазке на каждый глаз, чтобы предотвратить dryinг. Применение электродов гель на электроды и использовать ленту, чтобы обеспечить каждому из четырех лапах с соответствующим электродом. Электродные площадки будет передавать ЭКГ животного к системе формирования изображения, чтобы мониторинг частоты сердечных сокращений и частоты дыхания. Смажьте и вставьте ректального датчика температуры для непрерывного мониторинга температуры тела. Нормальная температура тела мыши 36,9 ° С. 1-2 ° С изменение нормально под наркозом.
- Использование крема для удаления волос для удаления шерсти с шеи мыши. Промойте область шеи с водой пропитанной марли, чтобы удалить волосы и избыток удаления волос крем. При желании, использовать дополнительное приложение для депиляции кремом для удаления остатков волос на теле (рис 2B).
2. Выявление и Image Acquisition мышиного шейных лимфатических узлов, используя HFUS
- Для начала нанесите слой подогретого ультразвукового геля на область шеи, лишенной шерсти. Используйте либеральное применение геля для оптимального изображенияКачество (рис 2С). Избегайте введения пузырьков воздуха в гель при нанесении, которые могут помешать ультразвуковой визуализации.
- Отрегулируйте изображений платформы 20-30 °, так мышь позиционируется с головой слегка приподнятой. Эта позиция помогает обеспечить оптимальную частоту дыхания для мыши. Поместите датчик в 40 МГц в поперечном направлении установочной системы и тщательно снизить его до тех пор, передняя часть датчика сканирующей головки не погружен в ультразвуковой гель (фиг.2с).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не прилагайте чрезмерное давление на шею мыши, так как это может привести к неоправданной респираторный дистресс. Кроме того, это полезно для формирования изображения, чтобы иметь буфер геля между преобразователем и мыши.
В-режиме визуализации и обнаружения лимфатических узлов:
- Используя компьютер, управляющий ПО HFUS приобретения, регулировать яркость (B-) настройки режима к следующим параметрам: Получите 22 дБ, глубина 10,00мм, ширина 14,08 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры предложил отправную точку, и может потребовать небольшой поправкой на оптимальном получения изображений между различными приложениями. Соблюдайте нормальные шейные лимфатические узлы, как овальные гипоэхогенных структур вблизи поверхности кожи в окружающую гиперэхогенная области. Появление больных лимфатических узлов может варьироваться между моделями. Систематически изображения все лимфатические узлы в пределах области шеи выполните следующие действия:- Используйте Y-ось для сканирования шею в головы к хвосту образом к грудной области. Используйте X-ось для центрирования изображения.
- Определить основные ориентиры: ротовую полость, язык, и щитовидную железу (3А, В и С; соответственно); наклонить платформу изображений горизонтально регулировать вентральной поверхности шеи мыши, делая обе стороны шеи появляются даже в изображении в В-режиме. Количество наклона зависит от физиологии каждого отдельного мыши.
- Найдите язык / Ротовой область (рис 3а) и обратите внимание на численное место на шкале Y.
- Найдите щитовидной железы (рис 3C) и обратите внимание на численное место на шкале Y.
- Рассчитайте разницу между полученными значениями в (2.4.1) и (2.4.2), чтобы определить общую длину в миллиметрах для региона распечатанных шеи.
- Используйте ручку Y для центрирования датчика на середину определенной общей длины.
- Нажмите "3D". Введите общую длину. Для 3D размером шага, используйте 0,076 мм приобрести пачку серии изображений для всей области шеи.
- После завершения сканирования, выберите правую или левую сторону шеи и центрирования датчика на индивидуальной лимфатического узла интерес, затем поднимите 40 МГц преобразователь от мыши. Удалить преобразователь на 40 МГц и заменить 50 МГц Микроскан преобразователя (также в положении поперечной) для получения изображений высокого разрешения. Пополнить ультразвуковой гель на шее мыши и снизить на 50 МГц датчик в ультразвуковой гель.
3D питания допплерографии
- Проведение 3D сканирование мощностью Доплера к объему ослов и кровеносных сосудов отдельных шейных лимфатических узлов следующим образом:
- Нажмите кнопку питания на клавиатуре системы, чтобы приобрести власть и Dopper настроить следующие параметры питания режима: пруф 4 кГц, доплеровский получить 34 дБ, 2D усиления 30 дБ, глубина 5.00 мм, ширина 4.73 мм. Примечание: Как и прежде, эти параметры предложено отправной точкой и могут быть изменены по мере необходимости для оптимального захвата изображений в различных моделях.
- Найдите черепно-самый точку лимфатического узла интерес и внимание, расположение на шкале Y.
- Найдите самый хвостовой точку того же узла и нотыместо на шкале Y.
- Рассчитать разницу расстояния, чтобы определить общую длину лимфатического узла (см шаг 2.4.3).
- Центрирование датчика на середине определенной общей длины, с использованием Y-масштаб расположение.
- Нажмите "3D" и введите общую длину лимфатических узлов. Используйте 0,051 мм для размера шага.
Примечание: Из-за близости от датчика до области груди, преобразователь 50 МГц, может привести к нестабильной доплеровского изображения вследствие обнаружения нормальной дыхательных движений. Это может быть устранена с помощью опции "Дыхание" Gating доступной на вкладке "физиологической". - Окружите выбранный лимфатический узел с желтым окне обозначает регион, чтобы быть проанализированы мощности доплеровского и выберите "3D сканирование", чтобы получать изображения. Повысить преобразователь от мыши и перемещать ее к противоположной стороне шеи. Опустите датчик на мыши и повторите шаги, описанные выше, IMAGE лимфатические узлы на этой стороне шеи.
- Сохранить наборы изображений для последующего анализа.
3. шейки биопсии лимфатического узла
- Выберите нужный лимфоузел для биопсии и поддерживать HFUS изображений с датчика 50 МГц. Выбрали самую большую видимую шейных лимфатических узлов с каждой стороны шеи мыши. Лимфодренаж расширение узла, как правило, указывает на воспалительный ответ, и, следовательно, такие узлы являются идеальными кандидатами для биопсии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы нашли это очень трудно провести биопсию шейки матки на узлах меньше, чем 10 мм 3. - Подготовьте иглу и шприц для биопсии путем размещения 1 мл шприц с прикрепленным 27 г, 0,5 дюйма иглы в держатель шприца. Отрегулируйте держатель иглы ориентироваться иглу 90 ° к шее мыши (рис 4а).
- Готовят путем повышения всю платформу мыши на уровень иглы. Достичь этого путем удаления 3D двигатель и переход на более высокий Макс.высотаORM, или путем размещения твердый объект подходящей высоты под предоставленной короткой платформе. Использование пластиковой пробирке стойку для этой цели. При необходимости поворачивать платформу, на 180 ° для биопсии узлов, расположенных на стороне шеи, противоположном аппарата иглы.
- Настройте параметры сбора, выбрав "Настройки", а затем выбрав "Макс & Extended буфер". Увеличить поле зрения на глубину 8,00 мм и шириной 9,73 мм. Включите руководства иглы, используя экран Ключи набрать. Руководство игла предсказать путь иглы на экране и позволяет пользователю выстроить лимфатический узел интересов в правильном месте для биопсии.
- Убедитесь, что лимфатический узел остается постоянно на виду, центрирования лимфатический узел в середине или немного влево от центра экрана в (фиг.4В). Чтобы получить весь кинопетли процедуры, нажмите до запуска на клавиатуре системы перед началом биопсию,
- Отрегулируйте держатель иглы, пока кончик иглы не попадает в поле зрения и контактов кожи (4В). Продвигайте иглу с фирмой, быстро нажать, чтобы проколоть кожу. Продолжайте продвигать иглу, пока наконечник также не прокалывает капсулу (рис 4C) и виден в мозговом веществе (рис 4D).
- После того, как игла правильно расположен в пределах узла, осторожно потяните поршень шприца назад между 200-300 мкл демаркации провести биопсию (рис 4D и 4E). Следует отметить, что биопсии материал обычно не видны в шприц.
- Аккуратно извлеките иглу из шеи мыши. Выгнать содержимое шприца в 1,5 мл пробирке. Удалить иглу от шприца, оставив иглу в трубку. Соберите 1 мл биопсии СМИ (из аликвоты, отдельные от источника наличии) с той же шприца, а затем прикрепить иглу шприца, держа иглу в гое трубки.
- Промойте шприц и иглу с биопсии СМИ, изгнав биопсии СМИ в трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не отступить на поршень, а игла прикреплена в любой момент после биопсии. Это уменьшает риск потери биопсии материал из-за небольшого размера выборки.
- Промойте шприц и иглу с биопсии СМИ, изгнав биопсии СМИ в трубку.
- Подтвердите содержимое узла лимфы по гистологических средств (рис 4F) и анализировать с помощью дополнительных методов (гистохимия, проточной цитометрии, и т.д.) по мере необходимости.
- После того, как биопсия завершения, выключите анестезии и удаления прямой кишки датчик температуры. Удалите излишки ультразвуковое гель от мыши марлей и удалите ленту с каждой лапой.
- Удалить мышь с платформы изображений и возврата в клетке. Минимальная кровотечение из биопсии может произойти, но это останавливает без вмешательства. Монитор мыши в течение восстановления до полного деятельность не возобновляется.
4. Изображение Анализ шейных лимфатических узлов
- Выберите "3D восстановленное изображение" в верхнем левом углу, нажав на кнопку "Показать одна панель". Используйте функцию масштабирования для увеличения изображения, если это необходимо. Переключить "Display Макет" для просмотра изображения только в B-режиме, который удаляет питания Доплера накладку из поля зрения. Это делает его легче увидеть края лимфатического узла при последующей 3-D анализа. Прокрутите серии изображений, чтобы найти начало лимфатического узла.
- Для ограничить лимфатического узла, перейдите на вкладку "Настройки 3D". Выберите "объем", затем кнопку "Пуск" рядом с "Parallel".
- Нарисуйте контуры вокруг интересующей области внутри отдельных изображений с помощью прокрутки. Продолжайте до тех пор образы, которые охватывают весь лимфатический узел не отмечены. Выберите "Готово", чтобызавершения анализа.
- В нижней части изображения, 3D и объем% васкуляризация будет автоматически отображаться.
Примечание: 3D объем соответствует объему узла лимфы, и процент васкуляризация представляет процент лимфатического узла положительного для кровотока по мощности Доплера. - Переключить "Display Макет", чтобы просмотреть власть допплерографии в виде наложения на изображения в режиме B-. На вид поверхности наблюдать чистую вид на площадь объемом интереса. Экспорт изображений в отмеченных файлов изображений (TIF) в формате 3D или сканирования в кино (.avi) для дальнейшего использования.
Representative Results
Общая принципиальная для процедур визуализации и биопсии показано на рисунке 1. Основные шаги в процедуре включают надлежащую подготовку мыши для визуализации, идентификации шейных лимфатических узлов, правильную подготовку и проведение в биопсии, и анализ B -Режим и доплеровские изображения для измерения объема и количества кровеносных сосудов внутри каждого выбранного узла, используя программное обеспечение.
HFUS визуализации мыши шейных лимфатических узлов требуется применение и поддержание системы анестезии в течение всего периода обработки изображений (фиг.2А), а также полное удаление волос, охватывающего всю область шеи (фиг.2В). Либеральная применение ультразвука гель на депилированной области обеспечивает четкий сигнал HFUS во время процедуры (рис 2С).
HFUS томография области шеи способствует то визуализации шейки матки анатомических ориентиров, которые производят характерные Сонографические изображения. Рисунок3 показаны примеры ключевых органов (3А-С), шейные лимфатические узлы в B-режиме (рис 3D) и в мощности доплеровского режима (рис 3Е).
В режиме реального времени HFUS изображений в наркотизированных мышей позволяет руководствоваться тонкой иглой биопсии шейки матки узлов, подобных тому, что проводится в клинической практике. Размещение биопсии иглой и придает коллекции шприца контрольного оборудования microinjector показано на рисунке 4A. После B-режим эхографические изображения показывают идеальную размещение иглы перед биопсией (рис 4В), игольчатый наконечник запись в шейном лимфатическом узле (рис 4C), и положение иглы при биопсии (рис 4D). Крупным планом изображение показывает кончик иглы внутри мозга лимфатического узла (рис 4E). Обработка биопсии компонентов по Cytospin показывает обильные скопления лимфоидной клетки и связанных с ними соединительной ткани, подтверждающие успешное лимфатический узелБиопсия (рис 4F).
Вычислительная основе анализа HFUS изображений позволяет подробная информация должна быть получена в отношении лимфатических узлов архитектуры, объема и сосудистой потока. Использование режима питания Доплера и измерения 3D объем, процентов кровоснабжения (PV) может быть рассчитана из серии изображений, охватывающих весь узлов (рис 5а). Кроме того, 3D визуализация позволяет виртуальной реконструкции лимфатических узлов, выявления общей топографии лимфатических узлов (рис 5B).
Рисунок 1:. Обзор Схема этапов в диагностике HFUS шейных лимфатических узлов визуализации мышей Ключевые шаги включают в себя 1: Подготовка мышей для визуализации HFUS и получения 40 и 50 МГц разрешение изображения на области шеи, содержащей три мыши шейные лимфатические узлы , 2: Тонкая игла изображение биопсия шейки матки лимфатических узлов и последующего гистологического анализа из биопсию материал. 3: Компьютерный анализ изображений и 3D-реконструкция лимфатических узлов, полученных изображений в B-режиме и доплеровского определить соответствующий объем лимфатических узлов и процентов (%) сосудистой потока.
Рисунок 2:. Обзор высокого разрешения в естественных условиях системы микро-изображений для оценки шейки лимфатических узлов и биопсии () система HFUS показано с наркозом мыши, подготовленном для шейного изображений лимфатических узлов. Также показано microinjector (ИМ) и стадии 3D-двигатель (3D МС) дополнительное оборудование. (Б) Закройте вид наркозом мыши, подготовленном для HFUS изображений с волосами удаляют в области шеи. (С) же мыши с преобразователем 50 МГц в месте на шее. Обратите внимание на дополнительный ультразвуковой гель, используемый для облегчения области формирования изображения шеи.
718fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Представитель HFUS шейки изображения Анатомия си-режиме и мощности Доплера. (А, В) изображения в В-режиме полости рта, показывающие ротовой полости (ВС) и язык (T) визуализировали с помощью визуализации ближе к носовой полости. Три шейных лимфатических узлов, найденные на каждой стороне шеи (обозначенный М, нижнечелюстного; SM, подчелюстные, СП, поверхностная околоушной), появляются в качестве группы гипоэхогенных структур в одной плоскости изображения, как показано (B). (С) щитовидной железы (Th), как визуализируется в верхней грудной области, появляющиеся в виде твердого вещества, эхогенной бабочки-образной структуры. (Переменного тока), визуализировали с датчиком 40 МГц; Шкала бар = 1 мм. (D, E) Типичные изображения нормального (D) и увеличенные (E) шейные лимфатические узлы с B-режиме и мощности доплеровского (красный). Пунктирные линии наметить индивидуальные лимфатические узлы. Масштаб бар = 0,5 мм.
Рисунок 4: шейки биопсии лимфатического узла настройки, визуализации и цитоспина анализ биопсийного материала () изображения платформа показывая микро-инжектор и размещение иглы около шеи мыши.. В стойку микроцентрифуга трубки (оранжевый блок) используется для слегка приподнять платформу, что позволяет правильное размещение иглы в то же время позволяя пространство для сцены 3D-двигателя. Такое расположение минимизирует время, затрачиваемое удаления этап двигателя для каждой мыши. (В - Д) Всего HFUS изображения шеи взяты из видео шейного лимфатического узла биопсии с использованием датчика 50 МГц. (Б) HFUS В-режима изображение, показывающее иглу, расположенную на стороне шеи до биопсии. Кончик иглы гиперэхогенная структура чуть ниже позиции руководства иглы (зеленая пунктирная линия) накладываются во время съемки для обозначения траектории иглы. Лимфатических узлов в центреизображение. Масштаб бар = 1 мм. (С) вход иглы в лимфатический узел. (D), Биопсия шейки лимфатических узлов. (Е) Увеличенный биопсия шейки лимфатических узлов. Масштаб бар = 0,5 мм. (F), Cytospin анализ репрезентативной биопсия лимфатического материала, подтверждающего успешное биопсию. Масштаб бар = 100 мкм.
Рисунок 5:. Компьютерный анализ изображений 3D шейных лимфатических узлов () Представитель скриншот лимфатического узла проанализированы с помощью программного обеспечения. Узел ограниченный синим; Результаты анализа показывают, 3D Volume и процентов кровоснабжение (PV), как указано. (В) вид изображение поверхности одного и того же узла после 3D анализа. Оказывает весь объем лимфатического узла на основе измерений в A.
Discussion
Описанный протокол позволяет для визуализации и оценки в месте мышиных шейных лимфатических узлов, использующих неинвазивные изображений HFUS. Использование B-режиме и мощности доплеровского изображения для визуализации шейки морфология лимфатических узлов, объем и лимфатических узлов кровотока предусматривает экспериментального анализа доклинических модельных систем, аналогичных мыши, которая используется для характеристики цервикальной узлов пациентов в клинической практике. Способность контролировать cervial лимфатические узлы через биопсии тонкой также предоставляет полезную технику для обнаружения изменений иммунных клеток и присутствие иностранных типов клеток или бактерий во полости рта болезни, вызванной лимфаденопатий у мышей. Простота использования и низкой стоимости, связанной с HFUS позволяет быстрого скрининга шейки лимфоузлов в самых разнообразных животных моделях.
Важным шагом в этом протоколе является начальной успешной идентификации шейных лимфатических узлов в HFUS изображений. Наш объект имеет ассортимент HFUS Транsducers как описано, так что мы использовали их, чтобы получить высокое качество изображения. Однако, если мы описываем преобразователи недоступны, то можно адаптировать изображение, используя другие датчики. Для этого, регулируя глубину и ширину изображения, чтобы получить адекватный образ это все, что требуется. Разрешение таких изображений может варьироваться, но она по-прежнему должна быть возможность получить высокое качество изображения с помощью HFUS. Визуализации ориентиры полости рта и щитовидной железы значительно помочь в ориентации пользователя на соответствующую область, где лимфатические узлы локализованы. Характерной овальной формы, гипоэхогенной природа и поверхностным расположение близко к поверхности кожи позволяет быстро подтверждающего идентификации шейных лимфатических узлов пределы правильного участка шеи. В то время как все три узла могут быть видны в одной плоскости изображения (рис 3B), как правило, один или два узла в плен во время съемки. Незначительные корректировки положения датчика может быть проведена раздиратьER отличается визуализации плоскостей видно, что позволяет визуализировать все узлы на одной стороне шеи.
В то время как мы нашли описанный метод надежного выявления шейные лимфатические узлы, существуют специфические ограничения на методики визуализации и биопсии. Поверхностный характер мыши шейных лимфатических узлов дает чрезмерное мобильность, когда даже небольшое давление прикладывают к коже при помощи датчика головы. Это может быть нейтрализована медленно применением датчика голову в ультразвуковой гель на шее мышей, пока знаковые изображения не идентифицированы. Лимфатических узлов мобильность может также усложнить мелкий биопсии, особенно при использовании преобразователей в более высоком разрешении (50 МГц) диапазона. По центру изображения лимфатических узлов для биопсии, как правило, вытеснены из поля зрения из-за силы биопсии иглой, необходимого для прокола кожи над и капсулы. Это может быть исправлено с помощью нецентральной позиционирования лимфатического узла в направлении вступления иглы,обеспечивая пространство для лимфатического узла для толкания по но все еще остаются в поле зрения во время биопсии. По нашему опыту, лимфатических узлов> 10 мм 3, очень трудно биопсии, и часто толкает иглу, а не проникла во продвижению иглы. Таким образом, биопсия лучше использовать для увеличенных лимфатических узлов, где размер> 10 мм 3 для обеспечения достаточного размера целевой узел и стабильности в шейном отделе. Кроме того, биопсия материал может не содержать достаточное количество клеток для процедур, где большее число ячеек, необходимых (например, проточной цитометрии).
HFUS был использован успешно визуализировать ортотопическая ПРГШ опухоли 25, и имеет потенциал, чтобы контролировать шейки метастазы узла у мышей с опухолями полости рта 24. В дополнение к УЗИ, томография биолюминесценции также использоваться для визуализации ортотопическая устное образование опухоли и рак шейки лимфатических узлов метастазы в живых мышей 26,27. Как Alternтельный подход, изображений биолюминесценции имеет явное преимущество над HFUS в состоянии непосредственно количественно прогрессирование опухоли и метастазов бремя в течение долгого времени в то же животное. В то время как несомненно полезно, изображений биолюминесценции не может измерить многие параметры, визуализированных с помощью HFUS, в том числе лимфатических узлов морфологии, узловых объемов или кровотока. Изображений биолюминесценции также требует специализированных темные коробки, чтобы сохранить мышей во время съемки, делая эту технику непригодной для адаптации для тонкой биопсии.
Кроме того, изображения биолюминесценции требуется производство опухолевых клеток, которые стабильно выразить люциферазы фермент, позволяя эту технику, чтобы использовать только в случае ортотопической ксенотрансплантатов с люциферазы трансфецированных клеток опухоли в ослабленным иммунитетом мышей, или с индуцируемых ткане-специфических трансгенных систем, которые ограничивают экспрессию люциферазы в пространственно-временной форме конкретного к ткани опухоли происхождения. В отличие от этого, может быть HFUS UСЭД в сочетании с биолюминесценции изображений в этих моделях, а также способен визуализации шейные лимфатические узлы в моделях канцероген-индуцированного устных опухолей у мышей с полным иммунитетом 28,29. В то время как HFUS может быть более гибкой, для большинства моделей мыши рака полости рта, в сочетании информации, которая может быть получена из биолюминесценции и HFUS изображений в системах, где опухолевые клетки экспрессируют люциферазы может обеспечить более полную картину шейки лимфатических узлов, чем любой модальности изображений только.
Способность идентифицировать и выявить мыши шейные лимфатические узлы в режиме реального времени позволяет этот метод будет использоваться в большинстве моделей заболеваний полости рта, что приводит к воспалительным лимфаденопатией, где животное может быть сохранена в перевернутом положении под краткосрочной анестезии. Обнаружение метастазов в лимфатических узлах или бактериальной инфекцией и сопутствующей воздействия на морфологии лимфатических узлов у животных представляет собой значительное преимущество по сравнению с традиционными методамикоторые требуют лимфатические узлы должны быть удалены из мертвых животных для гистологического исследования. Сочетание HFUS с тонкой биопсии позволяет средства для проведения рутинного патологический анализ шейных лимфатических узлов, аналогичных тому, что проводится в клинике, обеспечивая улучшенный способ мониторинга прогрессирования заболевания в большинстве текущих мышиных моделях заболеваний полости рта.
Disclosures
Расходов на публикацию для этой статьи спонсируются визуальной Звука.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Дороти Д. Рэдфорд фонда пожертвований от университета Мэри Babb Рэндольф онкологического центра Западной Вирджинии. Использование Модели и изображений Университет Западной Вирджинии за животными (AMIF) и микроскопии изображений Facility (MIF) (при поддержке Марии Бабб Рэндольф онкологического центра и NIH гранты P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 и S10 RR026378) выражает искреннюю признательность.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27 G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
