Summary
Detta protokoll beskriver tillämpningen av högfrekvent ultraljud (HFUS) för avbildning mus livmoderhalscancer lymfkörtlar. Denna teknik optimerar visualisering och kvantifiering av cervikal lymfkörtel morfologi, volym och blodflöde. Bildstyrd biopsi av livmoderhalscancer lymfkörtlar och bearbetning av lymfa vävnad för histologisk utvärdering också visat.
Abstract
Högfrekvent ultraljud (HFUS) är allmänt används som en icke-invasiv metod för att avbilda interna anatomiska strukturer i experimentella små djursystem. HFUS har förmågan att upptäcka strukturer så små som 30 pm, en egenskap som har använts för att visualisera ytliga lymfkörtlar hos gnagare i ljusstyrka (B) -läge. Kombinera power Doppler med B-mode scanning möjliggör mätning av cirkulations blodflöde i lymfkörtlar och andra organ. Medan HFUS har använts för lymfkörtel avbildning i ett antal mus modellsystem har ett detaljerat protokoll som beskriver HFUS avbildning och karakterisering av livmoderhalscancer lymfkörtlar hos möss inte rapporterats. Här visar vi att HFUS kan anpassas för att detektera och karakterisera cervikala lymfkörtlar i möss. Kombinerad B-mode och makt Doppler avbildning kan användas för att detektera ökningar av blodflödet i immunologiskt förstorade livmoderhalscancer noder. Vi beskriver också användningen av B-mode scanning att genomföra fina nålbiopsier av livmoderhalscancer lymfa intedes att hämta lymfan vävnad för histologisk analys. Slutligen mjukvarustödd steg beskrivs för att beräkna förändringar i lymfkörteln volym och för att synliggöra förändringar i lymfkörtel morfologi följande bildrekonstruktion. Möjligheten att visuellt övervaka förändringar i livmoderhalscancer lymfkörtel biologi över tiden ger en enkel och kraftfull teknik för icke-invasiv övervakning av cervical lymfkörtel förändringar i prekliniska musmodeller av munhålan sjukdom.
Introduction
Lymfdränage av interstitiell vävnadsvätska är den huvudsakliga metoden för spridning av infektions mikroorganismer och cancer uppstår i oral och maxillofacial regionen 1,2. Klinisk utvärdering av livmoderhalscancer lymfkörtlar är en vanlig diagnostisk metod som används för att bestämma närvaron eller utvecklingen av sjukdomar som har sitt ursprung i munhålan. Detta understryker vikten av att samla livmoderhalscancer lymfkörtlar som värdefulla anatomiska platser för diagnos oral sjukdom 3. Flera specialiserade avbildningsmetoder är kliniskt används för att identifiera sjuka livmoderhalscancer lymfkörtlar. Dessa inkluderar positronemissionstomografi (PET), datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MR). Medan mycket värdefullt, dessa metoder alla kräver omfattande patientförberedelse, högspecialiserad utrustning och / eller kemisk infusion i cirkulationen för att möjliggöra eller förbättra bildprocessen.
Sonografisk imaging (ultraljud, USA) är en allmänt vedertagen teknik som används för att imålders livmoderhalscancer lymfkörtlar som uppvisar lymfadenopati på grund av infektion eller metastaserande engagemang 4-6. USA kombineras ofta med PET-CT och MR-avbildning att ge en heltäckande representation av patientens lymfkörtel status, hjälpa till att bestämma tumörstadieindelning och behovet av kirurgisk excision 7. Den icke-invasiv metod har också inneboende fördelar över andra avbildningsmodaliteter, inklusive lätthet att använda, låg kostnad, minimal obehag för patienten och beredning. Den ytliga subkutana placeringen av de flesta cervikala lymfkörtlar möjliggör för USA att styra minimalt invasiva finnålsaspiration biopsier med ökad precision, förbättra diagnostiska noggrannheten 8.
Kommersiell högfrekvent (HF) USA ger detaljerad upplösning av interna anatomiska strukturer till 30 pm 9. Använda transduktorer som spänner från 22 till 70 MHz, har HFUS varit lätt tillämpas på en mängd olika experimentella gnagare system så att i realtid avbildning av inre organ in vivo.; HFUS har anpassats för visualisering av tumörbildning i konventionell ljusstyrka (B) -läge, samt med ett antal allmänna och specialiserade kontrastförstärkning agents9. Använda energidoppler med HFUS ger möjlighet att övervaka blodflödet i mustumörer, vilket gör en helhetsbedömning av angiogen perfusion i levande möss 10,11. HFUS har använts för att visualisera sjuka mus lymfkörtlar i huvudkroppshålan, visar samtidigt nytta av denna teknik för klinisk praxis. I synnerhet inflammatoriska och metastatiska visceral lymfkörtel förändringar har observerats i musmodeller av cancer som härbärgerar bröst 12,13, pankreatiska 14, kolorektal 15 och lunga 16 tumörer, liksom fibrösa histocytomas 17, och en åldrig musmodell av förvärvad hydronefros 18 . Dessa exempel stelna värdet av HFUS som ett kraftfullt undersökande verktyg för tumörinducerad lymfadenopati i en bred variation av robuckla system.
Flera modeller av bakteriell infektion 19,20 och huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) 21,22 har utvecklats för att studera dessa sjukdomar i preklinisk miljö. I motsats till människor, möss innehåller tre livmoderhalscancer lymfkörtlar som kart lymfa från munhålan vävnader (underkäken, submandibulär underkäken och ytliga parotis 23). Nyligen rapporterade vi användning av HFUS att kartlägga läget och morfologi av dessa lymfkörtlar, övervakning av förändringar i lymfkörtel volymen och blodflödet i ett cancerframkallande-inducerad musmodell av HNSCC 24. Här ger vi ett detaljerat protokoll för användning av HFUS för att identifiera, bildbehandling och analys av livmoderhalscancer lymfkörtlar i levande möss. Detta protokoll visar också möjligheten att använda HFUS att genomföra image- guidad fin nål biopsi av förstorad mus livmoderhalscancer lymfkörtlar, vilket gör histologiska övervakning av förändringar i livmoderhalscancer lymfkörtel innehåll och sjukdomar över time i samma djur. Detta protokoll kan lätt anpassas för att möjliggöra detaljerad studie av cervical lymfkörtel patologier resulterande från någon invasiv munhålan sjukdom i möss.
Protocol
Alla djurförsök visat i detta protokoll har granskats och godkänts av West Virginia University Djurvård och användning kommittén enligt protokoll 11 till 0412 och 14-0514 och genomföras i enlighet med de principer och förfaranden som beskrivs i NIH Guide för skötsel och användning av djur.
1. Animaliska Framställning
- Söva en enda mus i en induktionskammare med 3% isofluoran blandas med 1,5 l / min 100% syre. Ta bort djuret från induktionskammare och plats i ryggläge på bild plattform förvärmd till 40 ° C och hölls mellan 37-42 ° C (Figur 2A). Bekräfta anestesi av bristen på svar på en tå nypa.
- Placera musen nosen i noskonen ansluten till anestesisystemet. Applicera anestesi att upprätthålla steady state sedering (1,5% isofluoran blandas med 1,5 l / min 100% syre).
- Applicera ögon smörjmedel för varje öga för att förhindra drying. Applicera elektrodgel till elektroderna och använd tejp för att fästa var och en av de fyra tassar till den motsvarande elektroden. Elektroderna kommer att överföra djurets EKG till bildsystem för att möjliggöra övervakning av hjärtfrekvens och andningsfrekvens. Smörj och sätt in den rektala temperaturgivare för kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen. Normal mus kroppstemperatur är 36,9 ° C. 1-2 ° C variation är normal under anestesi.
- Använd hårborttagningskräm för avlägsnande av päls från nacken på musen. Skölj halsregionen med vattniga gasväv för att ta bort hår och överskott hårborttagningskräm. Du kan också använda ytterligare tillämpning av hårborttagningskräm för att avlägsna eventuella kvarvarande kroppsbehåring (Figur 2B).
2. Identifiering och Image Acquisition av mus Cervical lymfkörtlar Använda HFUS
- Till att börja, applicera ett skikt av värmdes ultraljudsgel till halsområdet saknar päls. Använd liberal tillämpning av gel för optimal bildkvalitet (figur 2C). Undvik att införa luftbubblor i gelén under ansökan, vilket kan störa ultraljudsbilder.
- Justera bildplattform 20-30 ° så att musen är placerad med huvudet något förhöjd. Denna position hjälper till att säkerställa ett optimalt andningsfrekvens för musen. Placera 40 MHz givaren på tvären i monteringssystemet och sänk försiktigt tills den främre delen av givaren proben är nedsänkt i ultraljudsgel (Figur 2C).
OBS: Var noga med att inte utöva överdrivet tryck på musen halsen, eftersom det kan orsaka onödig andnöd. Dessutom är det bra för avbildning att ha en buffert av gel mellan omvandlaren och musen.
B-läge Imaging och detektion av lymfkörtlar:
- Med hjälp av datorn som styr HFUS förvärv programvara, justera ljusstyrkan (B-) lägesinställningar till följande parametrar: Få 22 dB, djup 10.00mm, bredd 14.08 mm.
OBS: Dessa inställningar ett förslag utgångspunkt, och kan kräva viss justering för optimal bildtagning mellan olika applikationer. Följ normala cervikala lymfkörtlar som ovala hypoechoic strukturer nära hudytan inom ett omgivande hyperechoic fält. Utseendet på sjuka lymfkörtlar kan variera mellan olika modeller. Att systematiskt bild alla lymfkörtlar i halsregionen använda följande steg:- Använd Y-axeln för att skanna halsen i en hjärn att stjärtfenan sätt mot bröstregionen. Använd X-axeln för att centrera bilden.
- Identifiera viktiga landmärken: munhålan, tunga, och sköldkörteln (figurerna 3A, B och C, respektive); luta avbildning plattform för att horisontellt justera den ventrala ytan av musen hals, vilket gör båda sidorna av halsen visas även i B-modbild. Mängden lutning beror på fysiologi av varje individuell mus.
- Leta reda på tungan / munhålan regionen (Figur 3A) och notera numeriska plats på Y-skala.
- Leta sköldkörteln (figur 3C) och notera numeriska plats på Y-skala.
- Beräkna skillnaden mellan de erhållna värdena i (2.4.1) och (2.4.2) för att bestämma den totala längden i mm för den avbildade halsregionen.
- Använd Y ratten för att centrera givaren på mittpunkten av den fastställda totala längden.
- Tryck på "3D". Ange den totala längden. För 3D stegstorleken, använd 0,076 mm att förvärva bildserie stacken för hela halsregionen.
- När skanningen är klar väljer du höger eller vänster sida av halsen och centrera givaren på en individuell lymfkörtel av intresse, höj sedan 40 MHz givaren av musen. Ta bort 40 MHz givaren och ersätt med en 50 MHz micro omvandlare (även i ett tvärgående läge) för att erhålla högre upplösning. Fyll ultraljud gel på musen halsen och sänka 50 MHz givaren i ultraljudsgel.
3D Effekt doppler
- Conduct 3D skannar med energidoppler att bedöma volym och vaskularitet enskilda livmoderhalscancer lymfkörtlar enligt följande:
- Tryck på strömbrytaren på systemet tangentbordet för att skaffa sig makt Dopper och justera följande strömlägesinställningar: PRF 4 KHz, Doppler få 34 dB, 2D förstärkning 30 dB, djup 5,00 mm, bredd 4,73 mm. OBS: Som tidigare, dessa inställningar är ett förslag utgångspunkt och kan modifieras efter behov för optimal bildtagning i olika modeller.
- Leta hjärnrsta punkt lymfkörteln av intresse och notera platsen på Y-skala.
- Leta upp mest caudal punkten i samma nod och noterarplatsen på Y-skala.
- Beräkna avståndsskillnaden för att bestämma den totala längden av lymfkörteln (se steg 2.4.3).
- Centrera givaren på mittpunkten av den fastställda totala längden, med hjälp av Y-skala plats.
- Tryck på "3D" och ange den totala lymfkörtel längd. Använd 0,051 mm för stegstorleken.
OBS: På grund av närheten av givaren till bröstregionen, kan 50 MHz omvandlare resultera i en instabil Doppler bild på grund av upptäckten av normal andningsrörelser. Detta kan elimineras genom att använda "Andnings Gating" alternativet under "fysiologiska" -fliken. - Omge vald lymfkörtel med den gula rutan som anger det område som skall analyseras med energidoppler och välj "3D scan" att förvärva bilder. Höj omvandlaren bort av musen och flytta den till den motsatta sidan av halsen. Sänk givaren på musen och upprepa de steg som beskrivs ovan för att imaGE lymfkörtlar på denna sida av halsen.
- Spara bilduppsättningar för efterföljande analys.
3. Cervical lymfkörtelbiopsi
- Välj önskad lymfkörteln för biopsi och upprätthålla HFUS avbildning med 50 MHz givaren. Valde den största synliga cervikala lymfkörtlar i vardera sidan av musen halsen. Lymfkörtel utvidgningen indikerar vanligtvis ett inflammatoriskt svar, och därför sådana noder är perfekta kandidater för biopsi.
OBS: Vi har funnit att det är mycket svårt att genomföra biopsier på livmoderhalscancer noder mindre än 10 mm 3. - Förbered nålen och sprutan för biopsi genom att placera en 1 ml spruta med en bifogad 27 G, 0,5 tums nål i spruthållaren. Justera nålhållaren att orientera nålen 90 ° i förhållande till mus-hals (Figur 4A).
- Förbered genom att höja hela musen plattformen till nivån av nålen. Uppnå detta genom att ta bort 3D motorn och att byta till en högre Platform, eller genom att placera ett fast föremål med lämplig höjd under den medföljande korta plattformen. Använd en plast mikrofugrör rack för detta ändamål. Om det behövs, rotera plattformen 180 ° för att biopsi noder placerade på sidan av halsen motsatt nålen apparaten.
- Justera förvärvs inställningarna genom att välja "Inställningar" och sedan genom att välja "Max & Extended buffert". Större synfältet till ett djup av 8,00 mm och bredden 9,73 mm. Slå på nålgejden med hjälp av Screen Keys ratten. Nålen guide kommer förutsäga banan för nålen på skärmen och gör att användaren kan rada upp lymfkörteln av intresse i korrekt läge för biopsi.
- Se till att den lymfkörtel förblir ständigt i vyn genom centrering av lymfkörtel i mitten eller något till vänster om mitten i skärmen (Figur 4B). För att få hela cine slinga av förfarandet, tryck Pre-trigger på system tangentbordet innan biopsin.
- Justera nålhållaren tills nålspetsen kommer i sikte och kommer i kontakt med huden (Figur 4B). Advance nålen med en fast, snabb tryck för att punktera huden. Fortsätt att föra nålen tills spetsen punk också kapseln (Figur 4C) och är synlig i märgen (Figur 4D).
- När nålen är rätt placerad i noden, försiktigt dra tillbaka mellan 200-300 il avgränsningar sprutkolven att genomföra biopsin (Figur 4D och 4E). Notera att biopsimaterial är normalt inte synliga inom sprutan.
- Ta försiktigt bort nålen från musen halsen. Utvisa sprutans innehåll i en 1,5 ml mikrofugrör. Ta bort kanylen från sprutan, lämnar nålen i röret. Samla 1 ml biopsi media (från ett prov, separat från aktie källan) med samma spruta, och sedan tillbaka nålen till sprutan medan nålen i the röret.
- Skölj sprutan och nålen med biopsi media genom att utvisa biopsi media i röret.
OBS: Dra inte tillbaka på kolven medan nålen är fäst vid någon punkt efter biopsi. Detta minskar risken att förlora biopsimaterialet på grund av den lilla provstorleken.
- Skölj sprutan och nålen med biopsi media genom att utvisa biopsi media i röret.
- Bekräfta lymfkörtel innehåll genom histologiska medel (Figur 4F) och analysera med ytterligare metoder (histokemi, flödescytometri, etc.) som är lämpligt.
- När biopsi är klar, stäng av anestesi och ta den rektala temperaturgivare. Ta bort överflödigt ultraljudsgel från mus med gasväv och ta bort tejpen från varje tass.
- Avlägsna musen från avbildningsplattformen och återgå till en bur. Minimal blödning från biopsi plats kan förekomma, men det slutar utan ingripande. Övervaka musen under återhämtning förrän full aktivitet återupptas.
4. bildanalys av Cervical lymfkörtlar
- Välj "3D rekonstruerade bilden" i övre vänstra hörnet, klicka på "Visa Single Pane" -knappen. Använd zoomfunktionen för att förstora bilden om så önskas. Växla "Display Layout" för att visa bilden endast i B-läge, vilket tar bort energidoppler overlay ur sikte. Detta gör det lättare att se kanterna på lymfkörtel under efterföljande 3-D-analys. Bläddra igenom bildserie för att lokalisera början av lymfkörteln.
- För att begränsa lymfkörteln, navigera till fliken "3D-inställningar". Välj "volym", då "Start" knappen bredvid "Parallel".
- Rita konturerna runt området av intresse i enskilda bilder genom att bläddra. Fortsätt tills bilder som omfattar hela lymfkörtel är markerade. Välj "Avsluta" för attslutföra analysen.
- Längst ner på bilden, kommer 3D-volym och% vaskularitet visas automatiskt.
OBS: 3D-volym motsvarar den lymfkörtel volymen, och procent vaskularitet representerar procentandelen av lymfkörteln positivt för blodflödet genom att energidoppler. - Växla "Display Layout" för att visa makt Doppler avbildning som ett överlägg på B- läget bilden. På ytan visa iaktta en netto tanke på omfattningen intresseområde. Exportera bilderna i taggade bildfil (TIF) format eller 3D-skanningar som filmer (.avi) för vidare användning.
Representative Results
Det övergripande schema för bild och biopsi förfaranden visas i figur 1. De viktigaste stegen i proceduren innehålla en ordentlig beredning av musen för avbildning, identifiering av livmoderhalscancer lymfkörtlar, rätt förberedelser och genomförande av nål biopsi och analys av B -läge och Doppler bilder för att mäta volymen och mängden vaskularitet inom varje utvald nod med hjälp av datorprogram.
HFUS avbildning av mus livmoderhalscancer lymfkörtlar kräver tillämpa och upprätthålla lämpliga anestesi hela bildperioden (Figur 2A), samt fullständigt avlägsnande av håret som täcker hela halsområdet (Figur 2B). Den liberala tillämpningen av ultraljud gel på avhårade regionen ger en tydlig HFUS signal under förfarandet (Figur 2C).
HFUS avbildning av halsregionen underlättas genom visualisering av livmoderhalscancer anatomiska landmärken som producerar karakteristiska sonografisk bilder. Figur3 visar exempel på de viktigaste organ (Figur 3A-C), livmoderhalscancer lymfkörtlar i B-läge (Figur 3D) och i energidoppler läge (figur 3E).
Realtids HFUS avbildning i sövda möss möjliggör guidad fin nål biopsi av livmoderhalscancer noder som liknar det som bedrivs i klinisk praxis. Placering av biopsi nål och spruta fäst samling till den kontrollerande microinjector utrustningen visas i figur 4A. Efterföljande B-mode sonografisk bilder visar perfekt nål placering före biopsi (Figur 4B), nålspets inträde i en cervikal lymfkörtel (Figur 4C), och nålposition under biopsi (Figur 4D). Närbild bilden visar nålspetsen i märgen av lymfkörteln (Figur 4E). Bearbetning av biopsi komponenter från cytospin avslöjar rikliga lymfoida cellkluster och tillhörande bindväv, verifiering framgångsrika lymfkörtelbiopsi (Figur 4F).
Beräkningsbaserad analys av HFUS bilder möjliggör detaljerad information kan erhållas om lymfkörtel arkitektur, volym och kärlflöde. Använda energidopplerläge och 3D volym mätningar procent vaskularitet (PV) kan beräknas från bildserien omfattar hela noder (Figur 5A). Dessutom ger 3D-röntgen för virtuell lymfkörtel återuppbyggnad, avslöjar övergripande lymfkörtel topografi (Figur 5B).
Figur 1:. Översikt schema över de olika stegen i diagnostisk HFUS livmoderhalscancer lymfkörtel avbildning i möss De viktigaste stegen är 1: Förbereda möss för HFUS avbildning och få 40 och 50 MHz upplösning av halsregionen innehåller tre mus livmoderhalscancer lymfkörtlar . 2: fin nål bildstyrd biopsi av livmoderhalscancer lymfkörtlar och efterföljande histologiska analys av biopsier materialet. 3: Datorstödd bildanalys och 3D-rekonstruktion av lymfkörtel bilder som erhållits i B-mod och Doppler för att bestämma den respektive lymfkörtel volym och procent (%) av vaskulära flödet.
Figur 2:. Översikt över den höga upplösningen in vivo mikroavbildningssystem för livmoderhalscancer lymfkörteln bedömning och biopsi (A) HFUS systemet visas med en sövd mus förberedd för livmoderhalscancer lymfkörtel avbildning. Dessutom visas microinjector (MI) och 3D-motor stadiet (3D MS) tillbehörsutrustning. (B) närbild av en sövda mus förberedd för HFUS avbildning med håret bort i halsregionen. (C) Samma mus med 50 MHz-omvandlare i plats på halsen. Notera den extra ultraljuds gel som används för att underlätta halsområdet avbildning.
718fig3.jpg "/>
Figur 3: Representant HFUS livmoderhalscancer anatomi bilder i B-mode och makt Doppler. (A, B) B-mode bilder av munhålan, som visar den buckala håligheten (BC) och tungan (T) visualiserades genom avbildning närmast till näshålan. De tre livmoderhalscancer lymfkörtlar som finns på vardera sidan av halsen (märkt M, underkäken, SM, submandibulär, SP, ytlig öronspott), framstår som en grupp hypoechoic strukturer i en enda avbildnings plan som visas (B). (C) Sköldkörteln (Th) som visualiseras i övre bröstregionen, uppträder som en fast, ekogent butterfly-formade struktur. (AC) visualiserades med en 40 MHz-omvandlare; skala bar = 1 mm. (D, E) Representativa bilder av normal (D) och förstorade (E) livmoderhalscancer lymfkörtlar med B-mode och energidoppler (röd). Prickade linjer beskriva enskilda lymfkörtlar. Skalstreck = 0,5 mm.
Figur 4: Cervical lymfkörtel biopsi set-up, bildbehandling och cytospin analys av biopsimaterial (A) avbildning plattform som visar mikro injektorn och nål placering nära musen halsen.. Ett brett mikrocentrifugrör kuggstång (apelsin blocket) används för att något höja plattformen, genom att en korrekt nålplacering samtidigt tillåta utrymme för 3D-motorsteget. Detta arrangemang minimerar tid avlägsna motorsteget för varje mus. (B - D) Hela hals HFUS bilder tagna från en video av en livmoderhalscancer lymfkörtel biopsi använder 50 MHz givaren. (B) HFUS B-modbild visar nålen placerad vid sidan av halsen före biopsi. Nålen tips är hyperechoic struktur strax under position nålgejden (grön streckad linje) lagrad under avbildning för att beteckna nålen bana. Lymfkörteln är i centrum avbilden. Skalstreck = 1 mm. (C) Needle inträde i lymfkörteln. (D) Biopsi av den cervikala lymfnoden. (E) zoom biopsi av cervikal lymfkörtel. Skalstreck = 0,5 mm. (F) Cytospin analys av representativ biopsi lymfa material bekräftar framgångsrik biopsi. Skalstreck = 100 | am.
Figur 5:. Datoranalys av 3D livmoderhalscancer lymfkörtel bilder (A) representant skärmbild av en lymfkörtel analyseras med hjälp av datorprogram. Noden är kringskuren i blått; analysresultat visar 3D-volym och procent vaskularitet (PV) som anges. (B) En yta visa bilden av samma nod efter 3D-analys. Renders hela volymen av lymfkörteln baseras på mätningar i A.
Discussion
Den beskrivna protokollet möjliggör visualisering och in situ utvärdering av murina livmoderhalscancer lymfkörtlar med hjälp av icke-invasiv HFUS avbildning. Användningen av B-mode och makt Doppler imaging att visualisera livmoderhalscancer lymfkörtel morfologi, ger volym och lymfkörtel blodflöde för en experimentell analys av prekliniska mus modellsystem som liknar det som användes för karakterisering av livmoderhalscancer patienter noder i klinisk praxis. Förmågan att övervaka cervial lymfkörtlar via Finnålspunktion ger också en användbar teknik för att detektera immunceller förändringar och närvaron av utländska celltyper eller bakterier under munhålan sjukdoms inducerade lymphadenopathies hos möss. Den enkel användning och låg kostnad i samband med HFUS möjliggör snabb screening av cervikala lymfkörtlar status i en mängd olika djurmodeller.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är den första framgång i att identifiera de cervikala lymfkörtlar i HFUS bilder. Vår anläggning har ett sortiment av HFUS transducers som beskrivits, så vi har använt dem för att få bilder med högsta kvalitet. Men om omvandlarna vi beskriver inte är tillgängliga, är det möjligt att anpassa den avbildning med andra givare. För detta ändamål, justering av bildens djup och bredd för att erhålla en adekvat bild är allt som erfordras. Upplösning av sådana bilder kan variera, men det bör ändå vara möjligt att få högkvalitativa bilder med hjälp av HFUS. Landmärken Imaging i munhålan och sköldkörteln kommer att kraftigt underlätta orientering användaren till rätt region där lymfkörtlarna är lokaliserade. Den karakteristiska ovala, hypoechoic natur och ytliga läge nära hudytan möjliggör snabb bekräftande identifiering av livmoderhalscancer lymfkörtlar i rätt halsregionen. Även om alla tre noder kan vara synliga i ett enda avbildningsplanet (figur 3B), är typiskt en eller två noder fångas under avbildning. Smärre justeringar av givarens position kan utföras för att rämnaER annorlunda avbildning hyvlar synlig, vilket möjliggör visualisering av alla noder på en enda sida av halsen.
Medan vi har hittat den beskrivna tekniken tillförlitlig för att identifiera cervikala lymfkörtlar, det finns särskilda begränsningar för bildbehandling och biopsi teknik. Den ytliga naturen hos mus livmoderhalscancer lymfkörtlar ger överdriven rörlighet när även svagt tryck appliceras på huden via givarhuvudet. Detta kan motverkas genom att långsamt applicera givarhuvudet in i ultraljud gel på musen halsen tills landmärket bilderna identifieras. Lymfkörtel rörlighet kan också komplicera fin nål biopsi, speciellt när man använder givare i högre upplösning (50 MHz) området. Centrerade bilder av lymfkörtlar för biopsi typiskt tryckas ut ur synfältet på grund av kraften från biopsinål som behövs för att punktera den överliggande huden och kapsel. Detta kan avhjälpas genom att den excentriskt positionering av lymfkörteln i den riktning av nålens inträde,ge utrymme för lymfkörteln att skjutas över men fortfarande förbli inom synfältet under biopsi. Enligt vår erfarenhet, lymfkörtlar> 10 mm 3 är mycket svåra att biopsi, och är ofta trycks av nålen snarare än penetreras under nål avancemang. Således är biopsi bäst reserveras för förstorade lymfkörtlar där storleken är> 10 mm 3 för att säkerställa tillräcklig nod mål storlek och stabilitet inom halsregionen. Dessutom kan biopsimaterialet inte innehåller tillräckligt cellantal för förfaranden där det krävs större cellantal (t.ex. flödescytometri).
HFUS har använts för att framgångsrikt visualisera orthotopic HNSCC tumörer 25, och har potential att övervaka cervical nod metastaser i möss med orala tumörer 24. Förutom ultraljud, har bioluminescens avbildning också använts för att visualisera orthotopic orala tumörbildning och livmoderhalscancer lymfkörtel metastas i levande möss 26,27. Som en Alterntivt tillvägagångssätt har mareld imaging en klar fördel jämfört med HFUS i att kunna direkt kvantifiera tumörprogression och metastaserande börda över tiden i samma djur. Medan onekligen bra, är mareld avbildning inte att mäta många av de parametrar som visualiseras genom HFUS, inklusive lymfkörtel morfologi, nodala volymer eller blodflödet. Bioluminescence avbildning kräver också specialiserade mörka rutor för att upprätthålla möss under avbildning, vilket gör denna teknik olämplig för anpassning för fin nål biopsi.
Dessutom kräver produktionen av tumörceller som stabilt uttrycker luciferasenzymet, vilket gör att denna teknik kan användas endast i fall av orthotopic xenografter med luciferas-transfekterade tumörceller i nedsatt immunförsvar möss, eller med inducerbara vävnadsspecifika transgena system som begränsar luciferasuttryck mareld avbildning i en spatiotemporala sätt specifikt för vävnaden av tumörursprung. I motsats härtill kan HFUS vara used i samband med mareld bilder i dessa modeller, samt vara i stånd att avbilda cervikala lymfkörtlar i modeller för cancerframkallande-inducerad orala tumörer hos möss med kompletta immunsystem 28,29. Medan HFUS kan vara mer anpassningsbar till de flesta musmodeller för cancer i munhålan, den kombinerade information som kan erhållas från mareld och HFUS avbildning i system där tumörceller uttrycker luciferas kan ge en mer fullständig bild av livmoderhalscancer lymfknutor än antingen avbildningsmodalitet ensam.
Förmågan att identifiera och upptäcka mus livmoderhalscancer lymfkörtlar i realtid möjliggör denna teknik för att användas i de flesta modeller av oral sjukdom som leder till inflammatorisk lymfadenopati där djuret kan hållas i en inverterad position under kortsiktiga anestesi. Upptäckt av lymfkörtel metastaser eller bakteriell infektion och samtidig påverkan på lymfkörtel morfologi i levande djur utgör en betydande fördel jämfört med traditionella metodersom kräver lymfkörtlar tas bort från döda djur för histologisk bearbetning. Kombinera HFUS med fin nål biopsi kan ett medel för att utföra rutin patologisk analys av cervical lymfkörtlar, som liknar det som bedrivs på kliniken, vilket ger en förbättrad metod för att övervaka sjukdomsprogression i de flesta nuvarande musmodeller av munhålan sjukdomar.
Disclosures
Publicerings kostnader för denna artikel är sponsrad av Visual Sonics.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Dorothy D. Radford Endowment fonden från West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Användningen av West Virginia University djurmodeller och Imaging Facility (AMIF) och mikroskopi Imaging Facility (MIF) (stöds av Mary Babb Randolph Cancer Center och NIH bidrag P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 och S10 RR026378) är tacksamma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27 G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
