Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تسيطر البيئة الميكروية للتحقيق ديناميكية الدم الحمراء تجميع خلية

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

وصف بروتوكول تفاصيل إجراء التجارب لقياس خلايا الدم الحمراء (RBC) المجاميع تحت معدل القص للرقابة والمستمر، استنادا إلى تقنيات معالجة الصور. والهدف من هذا البروتوكول هو لربط RBC أحجام الركام إلى معدل القص المقابلة في بيئة الموائع الدقيقة التي تسيطر عليها.

Abstract

الدم، ويمثل باعتباره biofluid غير النيوتونية محور العديد من الدراسات في مجال hemorheology. وتشمل مكونات الدم خلايا الدم الحمراء، خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية التي علقت في بلازما الدم. بسبب وفرة من كرات الدم الحمراء (40٪ إلى 45٪ من حجم الدم)، تملي سلوكهم سلوك الانسيابية الدم خاصة في دوران الأوعية الدقيقة. بأسعار القص منخفضة جدا، وينظر إلى كرات الدم الحمراء لتجميع ودعا الكيانات شكل مجاميع، والذي يسبب السلوك غير النيوتونية من الدم. من المهم أن نفهم ظروف تشكيل مجاميع لفهم الريولوجيا الدم في الأوعية الدقيقة. بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل الإجراء التجريبي لتحديد الكمية المجاميع RBC في دوران الأوعية الدقيقة في ظل معدل القص المستمر، على أساس معالجة الصور. لهذا الغرض، ويتم اختبار RBC-المعلقات وتحليلها في 120 × 60 ميكرون بولي ميثيل-siloxane (PDMS) microchannels. وRBC-تعليق التفاوض والأنف والحنجرةأمطرت باستخدام السوائل الثاني من أجل الحصول على لمحة سرعة خطي داخل طبقة الدم وبالتالي تحقيق مجموعة واسعة من معدلات القص ثابتة. يتم تحديد معدل القص باستخدام نظام الجزئي Velocimetry الجسيمات صورة (μPIV)، في حين أن تصور المجاميع RBC باستخدام كاميرا عالية السرعة. يتم تحليل مقاطع الفيديو الملتقطة من المجاميع RBC باستخدام تقنيات معالجة الصور من أجل تحديد الأحجام الإجمالية على أساس الصور شدة.

Introduction

خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) تلعب دورا حاسما في تحديد سلوك الانسيابية الدم. هم متفرد تقريبا مسؤولة عن خصائص معينة من الدم في المختبر والمجراة. في ظل الظروف الفسيولوجية، كرات الدم الحمراء تحتل 40٪ إلى 45٪ من حجم الدم. في دوران الأوعية الدقيقة، كرات الدم الحمراء تحتل فقط ما يصل الى 20٪ من حجم الدم بسبب أقطار سفينة أصغر والبلازما القشط تأثير 1. وتعرف هذه الظاهرة للحد من البلازما في دوران الأوعية الدقيقة كما أثر أثر فاريو. بأسعار منخفضة القص، كرات الدم الحمراء قادرة على سد معا وتشكيل الهياكل واحد الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد تسمى "النضائد" أو مجاميع، وبالتالي المساهمة في السلوك غير النيوتونية من الدم. ومع ذلك، ليست مفهومة تماما آلية RBC التجميع. وتوجد نظريتان لنموذج تجميع كرات الدم الحمراء: سد نظرية الخلايا بسبب ربط قطاعات من الجزيئات (2) وattrac القوةنظرية نشوئها الناجمة عن نضوب الجزيئات بسبب التدرج الاسموزي 3.

عادة، للدم البشري، وحدات تشكل بأسعار منخفضة جدا القص 4 تتراوح بين 1 إلى 10 ثانية -1. فوق هذا النطاق، كرات الدم الحمراء تميل إلى تفصيل وتتدفق بشكل منفصل داخل السفينة.

فهم ظروف تشكيل المجاميع هو من أهمية كبيرة في الميدان hemorheology من حيث تحديد السلوك الدم الانسيابية. وغالبا ما ينظر هذه المجاميع على مستوى macrocirculation (> 300 ميكرون قطر) 5. في هذا النطاق، ويعتبر الدم والسوائل النيوتونية وخليط متجانس. ومع ذلك، نادرا ما ينظر إلى هذه المجاميع في المستوى الشعري (4-10 ميكرون في القطر) وعادة ما تكون مؤشرا على الحالات المرضية مثل السكري والسمنة 6. الحالات المرضية الأخرى التي يمكن أن تغير RBC تجميع تشمل حالات الالتهابات أو العدوى،أمراض القلب والأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم أو تصلب الشرايين، والأمراض الوراثية والأمراض المزمنة 7. وبالتالي، فهم آلية تجميع RBC وتحليل هذه الكيانات (عن طريق تحديد العلاقة بين حجم هذه المجاميع وظروف تدفق) يمكن أن تؤدي إلى فهم سلوك microrheological من الدم، وبالتالي ربطها التطبيقات السريرية.

المجاميع RBC يمكن تغييرها من قبل العديد من العوامل مثل الهيماتوكريت (حجم كرات الدم الحمراء في الدم)، ومعدل القص، وقطر السفينة، صلابة غشاء RBC وتكوين متوسطة تعليق 10/8. لذلك، يطلب من ظروف خاضعة للرقابة من أجل تحليل فعال المجاميع RBC. عدة طرق هي قادرة على تحليل تشكيل الكلي من خلال توفير قياسات تجميع ثابتة (مؤشر التجميع) التي توفر المعلومات ذات الصلة حول سلوك الدم. وتشمل هذه الأساليب، في جملة أمور، سرعة ترسب الدمطريقة 11، وطريقة انتقال الضوء 12، وطريقة انعكاس الضوء (13) وانخفاض القص طريقة اللزوجة 14.

وقد حاول عدد قليل من الدراسات لدراسة RBC التجميع وتحديد درجة التجميع في ظروف تدفق تسيطر 15-17. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات غير مباشرة التحقيق RBC الأحجام الإجمالية من خلال تحديد نسبة من الحيز الذي يشغله في نظام القص محسوبا على أساس الصور الدموية المجهرية التي توفر معلومات عن درجة التجميع فضلا عن اللزوجة المحلية.

لذا نقدم الإجراء الجديد لتحديد مباشرة RBC المجاميع في دوران الأوعية الدقيقة، حيوي، في ظل معدلات القص للرقابة وثابتة. ومجرور RBC-الايقاف، في مضاعفة Y-متناهية (كما هو موضح في الشكل رقم 1)، مع حل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وبالتالي خلق تدفق القص في طبقة الدم. ضمن هذا الدم طبقة لالشيا المستمرويمكن الحصول على معدل ص. يتم اختبار RBC-تعليق على الهيماتوكريت مختلفة (H) المستويات (5٪، 10٪ و 15٪) وتحت معدلات القص المختلفة (2-11 ثانية -1). يتم تحديد سرعة الدم ومعدل القص باستخدام نظام الجزئي Velocimetry الجسيمات صورة (μPIV) في حين أن التدفق هو تصور يستخدم كاميرا عالية السرعة. النتائج التي تم الحصول عليها بعد ذلك يتم معالجتها مع رمز MATLAB استنادا إلى شدة صورة من أجل الكشف عن كرات الدم الحمراء وتحديد الأحجام الإجمالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم جمع الدم من الأشخاص الأصحاء بموافقة لجنة الأخلاقيات من جامعة أوتاوا (H11-13-06).

1. متناهية تلفيق

هي ملفقة و microchannels على أساس أساليب ضوئيه القياسية 18.

  1. تصميم الهندسة متناهية باستخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) والبرمجيات وطباعة التكوين على الشفافية الصور قناع. هذه الأقنعة هي الحاسمة لأنها تملي مسار الضوء أثناء عملية التصنيع. في هذه الحالة، أبعاد متناهية هي 120 ميكرون في سمك، 60 ميكرومتر في عمق و 7 ملم في الطول.
  2. في غرف الأبحاث، ومعطف تدور الايبوكسي استنادا السلبية الصور مقاومة على رقاقة السيليكون في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للحصول على عمق متناهية المطلوب (60 ميكرون).
  3. فضح الرقاقة والصور قناع تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية في 650 ميغا جول / سم 2 لمدة 70 ثانية. ضمان لفضح فقط مناطق شفافة للالصور قناع لضوء الأشعة فوق البنفسجية. تعرض مناطق شفافة تسمح للبلمرة السلاسل مما أدى إلى تصلب الصور مقاومة. تزج قطعة السيليكون إلى مطور لإزالة الفائض من الصور مقاومة.
  4. بمجرد ملفقة العفن، وخلط المطاط الصناعي القائمة على السيليكون وكيل علاج في نسبة 10: 1 لإيجاد حل للبولي ميثيل-siloxane (PDMS). وضع حل PDMS في فراغ الغرفة لديغا. سكبه في قالب وتسخينها عند 60 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لخلق microchannels. ثم السندات القنوات الفردية إلى شريحة الزجاج باستخدام الأكسجين الترابط البلازما لمدة 90 ثانية.
    ملاحظة: يتم تنفيذ عملية PDMS ديغا من أجل القضاء على فقاعات الهواء التي نتجت عن عملية الخلط.
  5. تأكد من أن أبعاد متناهية تسمح للاختبار ناجح. في هذا البروتوكول، و microchannels لها مستطيل المقطع العرضي 120 × 60 ميكرون. في المقارنة، بمتوسط ​​RBC يبلغ قطرها 8 ميكرون وسمكها من 2 ميكرون. الrefore، وعرض متناهية يكفي لمراقبة التجميع السليم وتحديد دقيق لملامح السرعة.

2. إعداد الدم

  1. جمع الدم من المتبرعين المتطوعين صحية، بعد موافقة لجنة الأخلاقيات. علاج الدم مع حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) موجودة في أنابيب جمع (7.2 ملغ EDTA في 4 مل من الدم).
    ملاحظة: يتم استخدام EDTA لتجنب تجلط الدم.
  2. الطرد المركزي عينات الدم ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في 1400 x ج (3000 دورة في الدقيقة) وذلك لفصل مكونات الدم. نتيجة الطرد المركزي، ومراقبة ثلاث طبقات متميزة.
    ملاحظة: ثلاث طبقات هي طبقة RBC (الموجود في الجزء السفلي من الأنبوب)، ومعطف الشهباء (التي تتكون من خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية الموجودة على الجزء العلوي من طبقة RBC) وطبقة البلازما (الموجود على رأس كل الآخر المكونات).
    1. بعد الطرد المركزي الأول، وجمع بلازما الدم باستخدام ماصة الدم. تجنب أي ج ontact مع معطف الشهباء.
    2. جمع والتخلص من معطف الشهباء في وعاء مع التبييض المخفف بنسبة 10٪.
    3. إضافة 3 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى كل من الأنابيب مع طبقة RBC المتبقية وضمان التوازن السليم من أجهزة الطرد المركزي. المزيج بلطف الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 1400 x ج (3000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من أن حل PBS لا يحتوي على أية المغنيسيوم أو الكالسيوم لأنها يمكن أن تغير التصاق الخلية.
    4. التخلص من PBS في الأنابيب بعد الطرد المركزي الثاني وإزالة الغلالة الشهباء المتبقية إذا كان موجودا. كرر الخطوات من 2.2.3 و2.2.4 لالطرد المركزي الثالث لانتاج كرات الدم الحمراء نظيفة.
  3. مزيج من المبلغ المطلوب (0.05، 0.1 و 0.15 مل) من كرات الدم الحمراء نظيفة مع البلازما (0.95، 0.9 و 0.85 مل) في أنبوب 1 مل من أجل الحصول على RBC-التعليق مع ما يوازيها من (5٪، 10٪ و 15٪ ) الهيماتوكريت. تحقق hematocrits مع microcentrifuge ل.

3. إعداد السوائل

معشوقة = "jove_content"> إدخال اثنين من السوائل في مضاعفة Y-متناهية: RBC-المعلقات وPBS.

  1. إضافة 60 ميكرولتر من محلول الجزيئات التتبع الفلورسنت (1٪ الصلبة، د الجسيمات = 0. 86 ميكرون، λ = 542 نانومتر أبس والانبعاثات λ = 612 نانومتر) في 1 مل أنابيب RBC-تعليق.
    ملاحظة: الجزيئات التتبع الفلورسنت (مصبوغ داخليا جزيئات البوليستيرين) وتستخدم لقياس سرعة تدفق داخل متناهية. هذه الجسيمات يتألق عندما تتعرض لموجة المماثل من شعاع ليزر (λ = 542 نانومتر).
  2. يعد حل PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وإضافة 60 ميكرولتر من نفس الفلورسنت حل الجزيئات التتبع في 1 مل من محلول PBS.

4. المجاميع الحجم القياسات

  1. لإدراج السوائل (RBC-المعلقات وPBS) في متناهية، استخدام اثنين من الحقن كوب من 25 ميكرولتر و 100 ميكرولتر. هذه الإرادةيساعد على الحد من الامتثال للنظام. ربط متناهية إلى الحقن عن طريق الأنابيب والوصلات تركيب فتحات الدخول. ملء المحاقن الزجاجية باستخدام فرق الضغط القائم بين الحاوية السوائل والحقنة. ضمان عدم وجود فقاعات موجودة في النظام. كطريقة بديلة، واستخدام نظام الضغط التي تسيطر عليها لدفع كل من السوائل في متناهية.
  2. وضع متناهية على مرحلة مجهر مقلوب متصلة كاميرا عالية السرعة ونظام μPIV. برنامج ضخ حقنة لمعدلات التدفق المطلوب (على سبيل المثال، Q = 2 ميكرولتر / ساعة للدم مما ادى الى معدل التدفق من Q = 8 ميكرولتر / ساعة لPBS).
    ملاحظة: يتم استخدام واحد فقط ضخ حقنة. باستخدام اثنين من الحقن الزجاجية المتنوعة، مع اثنين من أقطار داخلية مختلفة، فمن الممكن أن تختلف إلى معدل التدفق دخول كل فرع من فروع Y-متناهية.
  3. إدراج كل السوائل في مضاعفة Y-متناهية كل من فرع دخول مختلفة وعلى معدلات تدفق مختلفة كما هو موضح في 19 (أرقام 2 و 3). انتظر تدفق للوصول إلى حالة مستقرة قبل الحصول على قياسات: تفقد البصر الصور كاميرا عالية السرعة لزيادة انسياب.
    ملاحظة: نسبة حاسمة في الحصول على لمحة سرعة خطي داخل طبقة الدم.
  4. تصور كرات الدم الحمراء باستخدام كاميرا عالية السرعة. توصيل الكاميرا إلى جهاز كمبيوتر لمراقبة وتسجيل وحفظ الصور من تدفق السوائل. مرة واحدة اثنين من التدفقات السوائل تصل إلى حالة مستقرة، بدء التسجيل.
    1. الحصول على عدة صور لنتائج المعالجة أفضل. تحديد وقت التعرض الكاميرا الأمثل للحصول على صورة واضحة عن المجاميع.
      وكانت مدة التعرض الكاميرا لهذه الحالة 0.5 مللي ثانية: ملاحظة. ويستند اختيار من الفاصل الزمني بين كل إطار على معدل الإطار الكاميرا ومعدل التدفق في تيانه متناهية. كان الوقت بين كل إطار معالجتها في هذا الإجراء 60 مللي ثانية. لذا كاميرا قادرة على تسجيل 18 لقطة في ثواني كافية.
      ملاحظة: تجنب تصفية الدم في أنبوب والمحاقن، والتي يمكن أن تؤدي إلى قياسات خاطئة.
  5. باستخدام تقنيات معالجة الصور (برنامج MATLAB في هذه الحالة) لتحسين جودة الصورة، وكشف عن المجاميع في كل من الصور على أساس كثافة بكسل (موضح في الشكل 4) على النحو التالي:
    1. تعزيز النقيض من الصور باستخدام طريقة الرسم البياني التعادل للحصول على جودة صورة أفضل عن كل إطار.
    2. تحويل الصور إلى اللون الرمادي صور ثنائية. لهذا الغرض، تعيين قيمة العتبة، تتراوح 0-1، أن يملي على تحويل كل بكسل. سوف يتم الكشف عن أي بكسل في الصورة أدناه قيمة العتبة كما بكسل الأسود، في حين سيتم الكشف عن بكسل مع القيم أكبر من عتبة كما بكسل البيضاء.
    3. ملءثقوب (إذا كان موجودا والضرورة) الموافق الثغرات الموجودة تجميع واحد لتحقيق نتائج أفضل.
    4. كشف الخلايا عن طريق تحديد بكسل البيضاء المجاورة في صورة ثنائية بحيث الخلايا المجاورة ترتبط كما الركام.
    5. تسمية المجاميع المختلفة والكشف عن تحويل الصورة إلى صورة ثنائية الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) لتحسين التصور. الجمع بين الإطارات الأصلية مع كل من الصور المجهزة المقابلة للتحقق من كفاءة تقنية معالجة الصور وضمان اتخاذ كافة الخلايا في الاعتبار، كما هو مبين في الشكل (5). نفذ الخطوات 4.5.1، 4.5.2، 4.5.3 ، 4.5.4 و 4.5.5 لجميع الأطر التي تم التقاطها.
    6. حساب مساحة كل الركام الكشف في إطار استنادا إلى عدد من وحدات البكسل الكشف عنها. استنادا إلى التكبير عدسة المستخدمة، وحساب معامل التحويل، وذلك باستخدام شبيكة الشعر المعايرة، وتحويل النتائج إلى ميكرون 2. متوسط ​​أحجام الإجمالية التي رصدت في كلالإطار وثم متوسط ​​النتائج لجميع الأطر للحصول على متوسط ​​حجم الكلي لكل تسجيل RBC-تعليق.
    7. حساب مساحة واحدة RBC لتحديد عدد تمثيلي التقديرية لكرات الدم الحمراء في كل الركام الكشف عنها. باستخدام هذه النتائج، وحساب توزيع نسبة كرات الدم الحمراء في كل الركام بوصفها وظيفة من الأحجام الإجمالية (ويمثلها يقدر عدد الخلايا في كل مجموع المباراتين)، كما هو موضح في الشكل (6).
      ملاحظة: لقياس المجاميع RBC، يمكن أن تستخدم البرمجيات يماغيج (بدلا من MATLAB) لأداء نفس المهام على كل إطار.

5. سرعة السائل والقص معدل القياسات

تحديد سرعة السائل وبالتالي معدل القص باستخدام نظام μPIV.

  1. مرة واحدة يتم الحصول على البيانات باستخدام كاميرا عالية السرعة، والتحول إلى كاميرا مزدوجة نابض المستخدمة لنظام μPIV. استخدام برامج التصوير للصورة ميلانquisition من تدفق ومعالجة الصور لتحديد سرعة الميدان.
  2. اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة، وهذا يتوقف على فئة ليزر، قبل ان يتحول على الليزر. ثم قم بتشغيل النظام، الكاميرا والليزر.
  3. معايرة الكاميرا على أساس التكبير عدسة المستخدمة. لهذا الغرض، واستخدام الميكروسكيل من 10 ميكرون الدقة تحت المجهر وتعيين حجم 1 بكسل في الصورة.
  4. بدء تشغيل الليزر وتصور الجسيمات في كل السوائل. العثور على طائرة الوسطى متناهية من خلال التركيز على أسرع الجزيئات في تدفق (أي يجب أن يكون أسرع الجسيمات ألمع).
  5. تعيين دينارا (الفاصل الزمني بين إطارين متتالية) لضمان تشريد السليم للجسيمات. يجب أن أسرع جسيمات تتحرك حوالي 5 إلى 10 بكسل بين كل من الصور.
  6. بدء تسجيل التدفق. ضبط البرنامج للاستحواذ على 100 أزواج من الصور، 5 ميللي ثانية على حدة. تنفيذ الخطوات 5.4 و 5.5 و 5.6 لكل DIFferent وبالنسبة لمعدلات القص المختلفة-RBC تعليق.
    يتم إعطاء المزيد من التفاصيل عن المنهجية في دراسة بيتس وفينيش 20: ملاحظة.
  7. معالجة التسجيلات المكتسبة باستخدام طريقة عبر الارتباط مع برنامج التصوير.
    ملاحظة: هذا يتكون من discretizing زوج من الصور في نوافذ صغيرة من حجم محدد سلفا (على أساس تدفق السوائل والفاصل الزمني الذي يختاره المستخدم) دعا النوافذ الارتباط وبعد تشريد الجزيئات في كل نافذة.
    1. أولا، تحديد ما إذا كانت الصور المكتسبة تتطلب معالجة قبل (بما في ذلك الطرح الخلفية "قاعدة لقطة" 21 أو صورة متداخلة 22،23) لمعالجة البيانات بشكل أفضل.
    2. ثم اختيار حجم الإطار ارتباط والشكل، وكذلك النسبة المئوية من الصور المتداخلة. تم إجراء دراسة مفصلة من قبل بيتس وآخرون. 24 لتحديد أفضل المعايير والتقنيات صورة عمليات تجهيز الدمتتدفق في تكوينات قناة مختلفة. التعبير عن النتائج على النحو حقل سرعة متوسط ​​المحسوبة من أزواج من 100 صورة والخطأ الجذر التربيعي يعني (RMS) في سرعة.
  8. استخراج لمحة السرعة عند مخرج القناة، من البيانات التي تتم معالجتها كما هو مبين في الشكل (7). للحصول على افضل صورة، ومتوسط ​​الميدان السرعة في الفضاء.
    ملاحظة: أشرطة يؤلف الشخصى سرعة تتوافق مع حجم الإطار علاقة المختار بالنسبة إلى عرض القناة. يظهر الخطأ RMS في السرعة أيضا في الشكل 7، وهو ما يمثل خطأ في تقدير سرعة التجريبية.
  9. إيقاف ليزر مرة واحدة يتم تنفيذ جميع القياسات والتجهيز،. اغلاق جميع مكونات النظام: البرمجيات، والكاميرات، لتنتقل المرحلة، وأجهزة الكمبيوتر والليزر.
  10. لحساب معدل القص، وكشف لأول مرة وتقدير سمك الدم في متناهية على أساس تسجيل كاميرا عالية السرعة. لهذا الغرض، ومتوسط ​​كلالإطارات في تسجيل خاص للحصول على صورة خلفية الفيديو. ترسيم طبقة الدم (كما هو موضح في الشكل رقم (8) لRBC-تعليق تتدفق في 10 ميكرولتر / ساعة عندما علقت على 5٪ و 10٪ و 15٪ الهيماتوكريت). الحصول على قيمة سرعة للالمقابلة سمك طبقة الدم وحساب معدل القص بقسمة قيمة سرعة من سمك طبقة الدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد مثال على تدفق السوائل اثنين في مزدوجة Y-متناهية في الشكل 2 لكرات الدم الحمراء الإنسان مع وقف التنفيذ في 5٪ و 10٪ و 15٪ الهيماتوكريت وتتدفق في 10 ميكرولتر / ساعة. ويبين الشكل 3 الاختلاف في الأحجام الإجمالية عند يتم تقليل التدفق في القناة من 10 ميكرولتر / ساعة إلى 5 ميكرولتر / ساعة لالهيماتوكريت 10٪. وهذا يعطي فكرة النوعية من أحجام الركام عندما متفاوتة الهيماتوكريت ومعدل القص الشكل 5 التالي تشريد أربعة مجاميع RBC الإنسان، لمدة ثلاثة إطارات متتالية، وتوفير مقياس نوعي لمعدل الإطار الكاميرا المطلوبة ومفهوم النوعية لل المجاميع التوزيع داخل كل إطار. في الشكل (5)، وترد المجاميع الصغيرة (مع كرات الدم الحمراء 8 أو أقل المقدرة) باللون الأزرق، بينما المجاميع المتوسطة (تتراوح 9-30 قدرت كرات الدم الحمراء) والمجاميع الكبيرة (أكبر من 30 تقدر كرات الدم الحمراء) وتظهر باللون الأخضر والأحمر على التوالي.

الحمار = "jove_content"> يتم عرض لمحات سرعة المختلفة RBC-التعليق في القناة في الشكل 7، حيث تمثل المنحنيات الحمراء والزرقاء والخضراء لمحات سرعة من كرات الدم الحمراء مع وقف التنفيذ في 5٪ و 10٪ و 15٪ الهيماتوكريت على التوالي. وRMS أخطاء السرعة، عرض أيضا في الشكل 7 لكل RBC-تعليق، هي صغيرة نسبيا بالمقارنة مع القيم سرعة، مما يدل على دقة قياسات السرعة، وبالتالي القص أسعار الفائدة. وتدل على مواقع اجهة باسم 'E' وكما هو مبين في خطوط الصلبة في نفس الرقم.

وأظهرت المقابلة معدلات القص لمختلف RBC-تعليق (استنادا إلى ملامح سرعة وسمك طبقة الدم) في الجدول 1. ويبلغ متوسط ​​أحجام الإجمالية المقررة لكل من RBC-تعليق، استنادا إلى طريقة معالجة الصور للكشف عن منطقة المجاميع RBC، وتظهر في الشكل 9، وذلك functأيون معدل القص المقابلة. ويرد مثال على توزيع نسبة كرات الدم الحمراء في كل الركام في الشكل (6)، حيث شارك أحجام الإجمالية كما يقدر عدد RBC في الركام.

الشكل 1
الشكل 1. مزدوجة التكوين Y-متناهية ودخول السوائل. يدخل الدم أول فرع في Q = 2 ميكرولتر / ساعة في حين يدخل PBS الفرع الثاني في Q = 8 ميكرولتر / ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. الإنسان RBC-تعليق على الهيماتوكريت مختلفة. وهذا الرقم يمثل لقطة من الإنسان RBC-تعليق تتدفق في Q = 10 ميكرولتر / ساعة على القبض على (A) 5٪ (B)10٪ و (C) 15٪ الهيماتوكريت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الإنسان RBC-تعليق على معدلات تدفق مختلفة. وهذا الرقم يمثل إطارات من كرات الدم الحمراء الإنسان مع وقف التنفيذ في 10٪ الهيماتوكريت H المتدفقة (A) Q = 10 ميكرولتر / ساعة و(B) س = 5 ميكرولتر / ساعة القبض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. مخطط تدفق برنامج معالجة الصور المستخدمة للكشف الكلي. والخطوات الموضحة وصف المنهجية الأساسية المستخدمة. ومما يعزز من جودة الصورة لتكون ج onverted إلى صورة ثنائية. تم الكشف عن المجاميع وصفت على أساس الأحجام كل منها. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. RGB التلوين والحركة الصافية لعدة RBC البشري المجاميع لمدة ثلاثة إطارات متتالية. هذا الرقم يدل على الحركة صافية قدرها أربعة مجاميع الكشف في ثلاثة إطارات متتالية في (A) ر = 0 مللي ثانية، (B) ر = 60 مللي ثانية و (C) ر = 120 مللي ثانية. المجاميع الكبيرة (> 30 تقدر كرات الدم الحمراء)، وحدات متوسطة (9-30 كرات الدم الحمراء تشير التقديرات) والمجاميع الصغيرة (<8 تقدر كرات الدم الحمراء) وتظهر باللون الأحمر والأخضر والأزرق على التوالي. وتتميز كل من المجاميع الكشف مع دائرة سوداء._blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. RBC توزيع حجم الكلي على 10٪ H-RBC تعليق لمعدلات تدفق مختلفة. حجم التوزيع الكلي للعينات الدم مع وقف التنفيذ على 10٪ H، التي تتدفق في Q = 10 و 5 ميكرولتر / ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. سرعة المقارنة الشخصي للالهيماتوكريت مختلفة. وتظهر ملامح سرعة لكرات الدم الحمراء في البلازما مع وقف التنفيذ في 5٪ H (الأحمر)، و 10٪ H (الأزرق)، و 15٪ H (الخضراء) ومحاكاة 19 (خط الصلبة) ل 120 × 60 ميكرون مزدوجة Y-متناهية مع Q = 10 ميكرولتر / ساعة. راشي الموقع واجهة عن طريق البريد لالتجارب. يتم عرض RMS أخطاء المقابلة من ملامح سرعة مختلفة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8. الخلفية صورة لمختلف RBC-تعليق وتعيين حدوده من سمك طبقة الدم. وهذا الرقم يظهر ترسيم الحدود في سمك طبقة دم RBC-تعليق تتدفق في 10 ميكرولتر / ساعة مع وقف التنفيذ في (A) 5٪ (B ) 10٪ و (C) 15٪ H. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
فيقوإعادة 9. متوسط ​​أحجام الإجمالية بوصفها وظيفة من المقابلة معدلات القص. يتم الحصول على النتائج لمختلف RBC-تعليق تتدفق في Q = 10 ميكرولتر / ساعة في 5٪ (A)، 10٪ (B) و 15٪ H (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الهيماتوكريت معدل التدفق (ميكرولتر / ساعة) معدل القص (ثانية -1)
5٪ 10 11.02
5٪ 5 5.36
10٪ 10 8.17
10٪ 5 4.47
15٪ 10 7.41
15٪ 5 2.51

الجدول القيم معدل 1. القص لمختلف الحالات تدفق الدم. ويتم الحصول على قيم معدل القص باستخدام البيانات والصور μPIV نتائج المعالجة لمختلف RBC-التعليق مع 5٪ و 10٪ و 15٪ H، التي تتدفق في Q = 10 ميكرولتر / ساعة وQ = 5 ميكرولتر / ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باستخدام المنهجية الحالية، فمن الممكن لتحليل نوعي وكمي لRBC المجاميع في ظل ظروف تدفق مختلفة وhematocrits. لاختبار ناجح والكشف الكلي، لا بد من تحديد نسبة سرعة مناسبة بين السوائل اثنين عند مدخل متناهية. هذه النسبة مهمة جدا للحصول على أفضل سمك طبقة الدم حيث الشخصى سرعة هو شبه الخطية (19).

وثمة عامل آخر رئيسي للاختبار الناجح هو جودة الصورة جيدة. في الواقع، منذ وتستند هذه الطريقة على معالجة الصور، من المهم جدا أن يكون التباين بين صورة الخلفية (في السوائل داخل القناة) والجزيئات إلى الكشف عنه. هنا، كما هو مبين في الشكلين 2 و 3، ويبدو أن الجزيئات لتكون أكثر قتامة من الخلفية، والتي تساعد في الكشف الكلي. المعلمة الأكثر أهمية للنظر في تقنية معالجة الصور هي رقيمة hreshold. لذلك، على أساس التباين التي تم الحصول عليها من المهم أن تختار قيمة العتبة المثلى حيث سيتم اتخاذ جميع المجاميع بعين الاعتبار، كما هو مبين في الشكل (5). وتجزئة الصورة الحالية، وتستخدم لهذه الدراسة، ويستخدم على نطاق واسع للكشف عن الخلية والفرز 25- 27. وإذا كانت جودة الصورة ليست النحو المرغوب فيه وقيمة العتبة العالمية غير ملائم، يمكن للمرء أن استخدام خوارزمية مختلفة لتحديد قيمة العتبة المثلى مثل طريقة أوتسو في 28 أو أسلوب العتبة التكيفية (discretizing الصورة و الحصول على عتبة المحلية لكل نافذة discretized).

عامل آخر أن تأخذ في الاعتبار هو عامل مقياس لتحويل المناسبة من بكسل إلى ميكرومتر.

باستخدام عامل التحويل الصحيح، يمكن للمرء تحديد القطر وسمك واحد RBC التي من شأنها أن تساعد على تحديد حجم التوزيع الكلي (على أساس العدد. d يقدرص من كرات الدم الحمراء في كل مجموع المباراتين). اعتمادا على اتجاه المجاميع، وحساب الجيدة للمنطقة على RBC واحد (أمامي أو عرض الجانب). كما هو مذكور في المادة 4 (الخطوة 4.4.1)، فمن المهم تحديد الوقت المناسب التعرض الكاميرا ومعدل الإطار لضمان أن الخصائص الديناميكية للمجاميع يتم التقاط بين كل إطار على التوالي. ويستند هذه القيمة على معدل التدفق تستخدم عند الحصول على القياسات. عدة عوامل أخرى يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند الحصول على النتائج باستخدام نظام μPIV وتناقش بشكل واضح في دراسة بيتس وفينيش 20.

تم اختبار المنهجية بنجاح على عدة RBC-تعليق تتدفق في الهيماتوكريت مختلفة. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى الحد من تقنية معالجة الصور وعدم وجود التناقض بين الخلفية صورة والمجاميع، فإنه من الصعب للكشف عن RBC تجمع لhematocrits أعلى (من 20٪ إلى 45٪). في الواقع كما ذكرسابقا، جودة الصورة هو أمر حاسم لهذه المنهجية.

باستخدام هذا البروتوكول، وأحجام الركام RBC يمكن قياسها في جهاز ميكروفلويديك للرقابة وبالتالي فمن الممكن الحصول على معلومات عن RBC تجميع حيوي في دوران الأوعية الدقيقة والحصول على RBC الأحجام الإجمالية لمجموعة من معدلات القص الفسيولوجية. ومن الممكن أيضا أن تكمل الدراسات العددية والتجريبية من الريولوجيا الدم وربط الأحجام الإجمالية والسلوك إلى الدراسات السريرية والمرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا. تم تنفيذ التصنيع الدقيق بدعم من مرفق ماكجيل Nanotools Microfab في جامعة ماكجيل وقسم الإلكترونيات في جامعة كارلتون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
  2. Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
  3. Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
  4. Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
  5. Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
  6. Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
  7. Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
  8. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
  9. Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
  10. Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
  11. Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
  12. Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
  13. Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
  14. Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
  15. Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
  16. Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
  17. Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
  18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
  19. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
  20. Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
  21. Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
  22. Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
  23. Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
  24. Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
  25. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
  26. Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
  27. Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
  28. Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 100، وخلايا الدم الحمراء، والتجميع، دوران الأوعية الدقيقة، على microfluidics، الصغير الصور الملتقطة للجسيمات، الريولوجيا الدم

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

تسيطر البيئة الميكروية للتحقيق ديناميكية الدم الحمراء تجميع خلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter