Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrolleret Mikrofluid Miljø for Dynamic Undersøgelse af røde blodlegemer Sammenlægning

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollen beskrevet nærmere en eksperimentel procedure at kvantificere Red Blood Cell (RBC) aggregater under en styret og konstant forskydningshastighed, baseret på billedbehandlingsteknikker. Målet med denne protokol er at relatere RBC aggregerede størrelser til den tilsvarende forskydningshastighed i et kontrolleret microfluidic miljø.

Abstract

Blod, som en ikke-newtonsk biovæske, repræsenterer fokus for talrige undersøgelser i hemorheology felt. Blodbestanddele omfatter røde blodlegemer, hvide blodlegemer og blodplader, der er suspenderet i blodplasma. På grund af den overflod af de røde blodlegemer (40% til 45% af blodvolumen), deres adfærd dikterer den rheologiske opførsel af blod især i mikrocirkulation. Ved meget lave forskydningshastigheder, der RBC'er ses at samle og danne enheder kaldet aggregater, hvilket forårsager ikke-newtonsk opførsel af blod. Det er vigtigt at forstå betingelserne for aggregater formationen for at forstå blodet rheologien i mikrocirkulationen. Protokollen beskrevet her beskriver den eksperimentelle procedure til kvantitativ bestemmelse af RBC aggregater i mikrocirkulationen under konstant forskydningshastighed, baseret på billedbehandling. Til dette formål er RBC-suspensioner testet og analyseret i 120 x 60 um poly-dimethyl-siloxan (PDMS) mikrokanaler. RBC-suspensioner er entspredes ved hjælp af et andet fluid for at opnå en lineær hastighed profilen blodet lag og dermed opnå en lang række konstante forskydningshastigheder. Den forskydningshastighed bestemmes ved hjælp af et system, micro Particle billede Velocimetri (μPIV), mens RBC aggregater visualiseres ved hjælp af en høj hastighed kamera. Videoerne fanget af RBC aggregater analyseres ved hjælp af billedbehandling teknikker for at bestemme de samlede størrelser baseret på billeder intensiteter.

Introduction

Røde blodlegemer (RBC) spiller en afgørende rolle i fastsættelsen af ​​rheologiske opførsel af blod. De er næsten ualmindeligt ansvarlige for de særlige egenskaber for blod in vitro og in vivo. Under fysiologiske betingelser, RBC'er optager 40% til 45% af blodvolumen. I mikrocirkulationen, kun RBC optager op til 20% af blodvolumen grundet mindre fartøj diametre og plasma skimming virkning 1. Dette fænomen af ​​plasma reduktion i mikrocirkulationen er kendt som Fåhræus virkning. Ved lave forskydningshastigheder, RBC'er er i stand til at bygge bro sammen og danne en dimensional eller tredimensionale strukturer kaldet "rouleaux" eller aggregater, dermed bidrager til den ikke-newtonsk opførsel af blod. Imidlertid er mekanismen af ​​RBC aggregation ikke fuldstændigt forstået. Der findes to teorier at modellere sammenlægning af RBC: at bygge bro over celler teori på grund af den krydsbinding af makromolekyler 2 og force attraksesteori forårsaget af udtømning af molekylerne på grund af den osmotiske gradient 3.

Typisk for humant blod, aggregater dannes ved meget lave forskydningshastigheder 4 i området fra 1 til 10 sek -1. Over dette område, RBC'er tendens til at opsplitte og flow separat inden i karret.

Forståelse betingelserne for aggregater dannelsen er af stor betydning for hemorheology felt i form af at definere blodets reologiske adfærd. Disse aggregater er ofte set på macrocirculation niveau (> 300 um diameter) 5. På denne skala, er blod betragtes som en newtonsk fluid og en homogen blanding. Men disse aggregater sjældent set i det kapillære niveau (4-10 um i diameter) og er normalt en indikation af patologiske tilstande, såsom diabetes 6 og fedme. Andre patologiske tilstande, der kan ændre RBC sammenlægning omfatter inflammatoriske eller infektiøse tilstande,cardiovaskulære sygdomme, såsom hypertension eller aterosklerose, genetiske sygdomme og kroniske sygdomme 7. Derfor forstå RBC aggregeringsmekanismen og analyse af disse enheder (ved at definere et forhold mellem størrelsen af ​​disse aggregater og strømningsforholdene) kan føre til en forståelse af den microrheological adfærd af blod og dermed relatere det til kliniske anvendelser.

RBC-aggregater kan ændres ved adskillige faktorer, såsom hæmatokrit (volumen af RBC'er i blod), forskydningshastigheden, kardiameteren, RBC membran stivhed og suspenderingsmediet sammensætning 8-10. Derfor er kontrollerede forhold kræves for effektivt at analysere RBC aggregater. Flere metoder er i stand til at analysere aggregatdannelse ved at give statiske sammenlægning målinger (sammenlægning index), der giver relevante oplysninger om blod adfærd. Disse fremgangsmåder indbefatter, bl.a. blodsænkningFremgangsmåde 11, lystransmissionen metode 12, lysrefleksion metode 13 og den lave forskydningsviskositet metode 14.

Kun få undersøgelser har forsøgt at studere RBC sammenlægning og bestemme graden af aggregering i kontrollerede strømningsforhold 15-17. Men disse undersøgelser indirekte undersøge RBC aggregerede størrelser ved at bestemme forholdet mellem den besatte plads i en klipning system, målt baseret på mikroskopiske blod billeder med oplysninger om graden af ​​aggregering samt den lokale viskositet.

Vi har derfor præsentere en ny procedure for direkte at kvantificere RBC aggregater i mikrocirkulationen, dynamisk, under kontrollerede og konstante forskydningshastigheder. RBC-suspensioner medrives, i en dobbelt Y-mikrokanalplade (som illustreret i figur 1), med en phosphatpufret saltopløsning (PBS) opløsning dermed skabe en forskydningsstrømning i blodet lag. Inden dette blod lag en konstant shear sats kan opnås. RBC-suspensioner testes ved forskellige hæmatokrit (H) niveau (5%, 10% og 15%) og under forskellige forskydningshastigheder (2-11 sek -1). Blodet hastighed og forskydningshastighed bestemmes ved hjælp af et system, micro Particle billede Velocimetri (μPIV), mens strømmen visualiseres ved hjælp af en høj hastighed kamera. De opnåede resultater behandles derefter med en MATLAB kode baseret på billedstyrkerne for at detektere RBC'erne og bestemme aggregerede størrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blod opsamles fra sunde individer med godkendelsen af ​​den etiske komité ved universitetet i Ottawa (H11-13-06).

1. Mikrokanalplader Fabrication

Mikrokanalerne er fremstillet på grundlag af standard fotolitografiske metoder 18.

  1. Designe mikrokanalplade geometri ved hjælp af en Computer Aided Design (CAD) software og udskrive konfigurationen på en gennemsigtighed foto-maske. Disse masker er afgørende, da de dikterer lysbanen under produktionsprocessen. I dette tilfælde er de mikrokanalplader dimensioner er 120 um i tykkelse, 60 um i dybden og 7 mm i længden.
  2. I en renrum, spin-coat en epoxybaseret negativ fotoresist på en siliciumskive ved 2000 rpm i 30 sek for at opnå den ønskede mikrokanalplade dybde (60 pm).
  3. Udsætte skiven og foto-maske under en UV-lampe ved 650 mJ / cm2 i 70 sek. Sikre at eksponere kun de gennemsigtige områder ifoto-maske for UV-lys. Eksponeringen af ​​de gennemsigtige områder muliggør polymerisation af kæderne resulterer i en hærdning af fotoresist. Fordyb stykke silicium i en udvikler til at fjerne overskud af foto-modstå.
  4. Når formen er fremstillet, blandes en silicium elastomer og et hærdningsmiddel i et forhold på 10: 1 for at skabe en opløsning af poly-dimethyl-siloxan (PDMS). Sætte PDMS opløsning i et vakuumkammer til afgasse. Hæld det i formen og opvarmes ved 60 ° C i 90 min for at skabe mikrokanaler. Derefter binde de enkelte kanaler til et objektglas under anvendelse af oxygenplasma bonding i 90 sek.
    BEMÆRK: PDMS afgasse proces udføres for at fjerne luftboblerne fremkaldt af blandeprocessen.
  5. Sørg for, at mikrokanalplader dimensioner tillader vellykket test. I denne protokol, mikrokanalerne har et rektangulært tværsnit på 120 x 60 um. Til sammenligning en gennemsnitlig RBC har en diameter på 8 um og en tykkelse på 2 um. DenDerfor indgår, mikrokanalplade bredden er tilstrækkelig til at observere ordentlig sammenlægning og præcist bestemme hastighedsprofiler.

2. Blood Forberedelse

  1. Indsaml blod fra raske frivillige donorer, efter godkendelse af en etisk komité. Behandle blodet med ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til stede i opsamlingsrør (7,2 mg EDTA i 4 ml blod).
    BEMÆRK: EDTA bruges til at undgå blodpropper.
  2. Centrifuger blodprøver tre gange i 10 minutter ved 1.400 xg (3000 rpm) for at adskille de blodbestanddele. Som et resultat af centrifugeringen, observere tre adskilte lag.
    BEMÆRK: De tre lag er RBC lag (placeret i bunden af ​​røret), buffy coat (bestående af hvide blodlegemer og blodplader placeret på toppen af ​​RBC layer) og plasmaet lag (placeret på toppen af ​​alle de andre bestanddele).
    1. Efter den første centrifugering, indsamle blodplasma under anvendelse af en blod pipette. Undgå contakt med buffy coat.
    2. Indsamle og bortskaffe fibrinlaget i en beholder med blegemiddel fortyndet til 10%.
    3. Tilsæt 3 ml PBS pH 7,4 til hver af rørene med det resterende RBC lag og sikre den korrekte balance af centrifugen. Bland forsigtigt rørene og centrifugeres igen ved 1.400 xg (3000 rpm) i 10 min.
      BEMÆRK: Sørg for, at PBS løsning ikke indeholder magnesium eller calcium, da de kunne ændre celleadhæsion.
    4. Bortskaffe PBS i rørene efter den anden centrifugering og fjerne det resterende buffy coat hvis til stede. Gentag trin 2.2.3 og 2.2.4 for tredje centrifugering for at give rene RBC.
  3. Bland den krævede mængde (0,05, 0,1 og 0,15 ml) af de rene RBC'er med plasma (0,95, 0,9 og 0,85 ml) i en 1 ml rør for at opnå RBC-suspensioner med den tilsvarende (5%, 10% og 15% ) hæmatokrit. Check hæmatokritværdier med en mikrocentrifuge.

3. Væsker Forberedelse

  1. Tilføje 60 pi af det fluorescerende sporstof partikler opløsning (1% faststof, d partikel = 0. 86 um, λ abs = 542 nm og λ emission = 612 nm) i 1 ml RBC-suspension rør.
    BEMÆRK: De fluorescerende sporstof partikler (internt farvet polystyrenpartikler) anvendes til at måle hastigheden af ​​strømmen i mikrokanalplade. Disse partikler fluorescerer, når de udsættes for den tilsvarende bølgelængde af laserstrålen (λ = 542 nm).
  2. Forberede en PBS pH 7,4 og der tilsættes 60 pi af den samme fluorescerende sporstof partikler opløsning i 1 ml af PBS-opløsning.

4. Aggregater Size Målinger

  1. At indsætte væsker (RBC-suspensioner og PBS) i mikrokanalplade, bruge to glas sprøjter med 25 pi og 100 pi. Dette vilbidrage til at reducere overholdelse af systemet. Tilslut mikrokanalplade til sprøjterne via slanger og konnektorer passer posten huller. Fyld glassprøjter hjælp af trykforskel der eksisterer mellem væskebeholderen og sprøjten. Sikre, at ingen bobler i systemet. Som en alternativ metode, bruge et tryk kontrolleret system til at køre begge væsker i mikrokanalplade.
  2. Placer mikrokanalplade på et omvendt mikroskop stadium forbundet til en højhastigheds kamera og en μPIV system. Program sprøjtepumpen til de ønskede strømningshastigheder (f.eks Q = 2 pi / time for blod optrapper en strømningshastighed på Q = 8 pi / time i PBS).
    BEMÆRK: bruges kun én sprøjte pumpe. Anvendelse af to forskellige glassprøjter, med to forskellige indvendige diametre, er det muligt at variere strømningshastigheden ind hver gren af ​​Y-mikrokanalplade.
  3. Sæt begge væsker i den dobbelte Y-mikrokanalplade hver fra en anden post gren og på forskellige strømningshastigheder, som vist i 19 (figur 2 og 3). Vent til strømmen for at nå steady state før erhverve målingerne: visuelt inspicere kamerabilleder den høje hastighed for en jævn strøm.
    BEMÆRK: Forholdet er afgørende i at opnå en lineær hastighed profilen blodet lag.
  4. Visualiser RBC'erne hjælp af high speed kamera. Slut kameraet til en computer for at kontrollere, optage og gemme billeder af væskestrømmen. Når de to fluidumstrømme nå steady state, starte optagelsen.
    1. Erhverve flere billeder for bedre behandling resultater. Bestemme en optimal kamera eksponeringstid for et klart billede af aggregaterne.
      BEMÆRK: Kameraet eksponeringstid for denne sag var 0,5 msek. Valget af tidsintervallet mellem hver frame er baseret på kameraets billedhastighed og strømningshastigheden i than mikrokanal. Tiden mellem hver ramme behandles i denne procedure var 60 msek. Derfor et kamera kan optage 18 frames per sekund er tilstrækkelig.
      BEMÆRK: Undgå blod bundfældning i røret og sprøjte, hvilket kan føre til fejlagtige målinger.
  5. Ved hjælp af billedbehandling teknikker (en MATLAB program i dette tilfælde) for at forbedre billedkvaliteten, opdage aggregaterne i hver af de billeder, baseret på pixel intensiteter (illustreret i figur 4) som følger:
    1. Forbedre billederne kontrast bruge histogrammet equalizer metode til at opnå en bedre billedkvalitet for hver ramme.
    2. Konverter gråtonebilleder i binære billeder. Til dette formål indstilles en tærskelværdi, der spænder fra 0 til 1, der dikterer omdannelsen af ​​hver pixel. En pixel i billedet under tærskelværdien, vil blive detekteret som en sort pixel, medens pixel med værdier større end tærskelværdien, vil blive detekteret som hvide pixels.
    3. Fyldhuller (hvis til stede og nødvendigt) svarende til de huller inden for én samlet for bedre resultater.
    4. Påvisning af cellerne ved at bestemme tilstødende hvide pixels i det binære billede, så tilstødende celler er forbundet som granulater.
    5. Mærke de forskellige aggregater detekteret og konvertere det binære billede ind i en rød-grøn-blå (RGB) image for bedre visualisering. Kombinerer de oprindelige rammer med hver af de tilsvarende behandlede billeder for at kontrollere effektiviteten af billedbehandling teknik og sikre, at der tages hensyn til alle de celler, som vist i figur 5. Udfør trin 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 og 4.5.5 for alle rammer tilfangetagne.
    6. Beregne arealet af hvert aggregat detekteret i rammen baseret på antallet af detekterede pixels. Baseret på objektivet forstørrelse anvendte beregne omregningsfaktoren, ved hjælp af en kalibrering netvasrk, og konvertere resultatet til um 2. Gennemsnittet af aggregerede størrelser påvist i hverramme og derefter gennemsnittet af resultaterne for alle rammer for at opnå den gennemsnitlige samlede størrelse for hver optagelse af RBC-suspensioner.
    7. Beregn arealet af et RBC at bestemme en repræsentativ anslåede antal RBC'er inden for hvert detekteret aggregat. Under anvendelse af disse resultater, beregne fordelingen af procentdelen af RBC'er inden hvert aggregat som en funktion af de aggregerede størrelser (repræsenteret ved den anslåede antal celler i hvert aggregat), som vist i figur 6.
      BEMÆRK: For at måle RBC aggregater, kunne ImageJ software bruges (i stedet for MATLAB) til at udføre de samme opgaver på hver ramme.

5. fluidhastighed og forskydningshastighed Målinger

Bestemme væskens hastighed og dermed forskydningshastigheden ved anvendelse af et μPIV system.

  1. Når dataene er erhvervet ved hjælp af den høje hastighed kamera, skifte til det dobbelte pulserende kamera anvendes til μPIV systemet. Brug en imaging software til billedbehandling ackøbet af flowet og billedbehandling for feltet hastighed beslutsomhed.
  2. Træffe alle forholdsregler nødvendige, afhængig af klassen af ​​laseren, før du tænder på laser. Derefter tænde for anlægget, kameraet og laseren.
  3. Kalibrere kameraet baseret på objektivet forstørrelse anvendes. Til dette formål skal du bruge en mikroskala på 10 um præcision under lup og indstille størrelsen på 1 pixel i billedet.
  4. Start laseren og visualisere partiklerne i begge væsker. Find midterplanet af mikrokanalplade ved at fokusere på de hurtigste partikler i strømmen (dvs., bør de hurtigste partikler være den lyseste).
  5. Indstil dt (tidsintervallet mellem to på hinanden følgende rammer) for at sikre en korrekt forskydning af partiklen. De hurtigste partikler bør bevæge sig omkring 5 til 10 pixels imellem begge billeder.
  6. Start optagelse strømmen. Indstil softwaren til at erhverve 100 par billeder, 5 msek fra hinanden. Udfør trin 5.4, 5.5 og 5.6 for alle difskellige RBC-suspensioner og for forskellige forskydningshastigheder.
    BEMÆRK: Flere oplysninger om den metode, der er givet i studiet af Pitts og Fenech 20.
  7. Behandle optagelserne erhvervet ved hjælp af den krydskorrelation metoden med imaging software.
    BEMÆRK: Denne består af diskretisering parret af billeder i små vinduer med forudbestemt størrelse (baseret på fluidstrømmen og tidsintervallet valgt af brugeren) kaldet sammenligningstabeller vinduer og efter forskydningen af ​​partiklerne i hvert vindue.
    1. Først afgøre, om billederne erhvervede kræver forbehandling (herunder baggrund subtraktion, "base-klipning" 21 eller billede overlappende 22,23) for bedre databehandling.
    2. Vælg derefter korrelationen vindue størrelse og form, samt den procentdel af billeder overlappende. En detaljeret undersøgelse blev udført af Pitts et al. 24 for at bestemme de optimale parametre og billede pre-behandlingsteknikker til blodflow i anden kanal konfigurationer. Resultaterne udtrykkes som en gennemsnitlig hastighed område beregnes fra de 100 billedfiler par og Root Mean Square (RMS) fejl i hastighed.
  8. Udtrække en hastighedsprofil på kanalen udløb, fra de behandlede data som vist i figur 7. For en bedre profil, gennemsnittet for hastighedsfeltet i rummet.
    BEMÆRK: Søjlerne komponere hastighedsprofilen svarer til korrelationen vinduesstørrelse valgt i forhold til kanalbredden. RMS fejl i hastighed er også vist i figur 7, der repræsenterer fejlen i den eksperimentelle hastighed estimation.
  9. Sluk for laseren, når alle målinger og behandling udføres ,. Luk alle komponenter i systemet: software, kameraer, flytter scenen, computere og laser.
  10. For at beregne shear rate, første opdage og estimere blodet tykkelse i de mikrokanalen baseret på den høje hastighed kamera optagelse. Til dette formål gennemsnit allerammerne i den specifikke optagelse for at få et baggrundsbillede af videoen. Afgrænse blodet lag (som vist i figur 8 for RBC-suspensioner flyder på 10 pi / time, når suspenderes ved 5%, 10% og 15% hæmatokrit). Opnå hastigheden for den tilsvarende tykkelse blod lag og beregne forskydningshastigheden ved at dividere hastigheden værdi med tykkelsen blodet lag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på to-fluidstrøm i den dobbelte Y-mikrokanalplade er vist i figur 2 for humane RBC'er suspenderet ved 5%, 10% og 15% hæmatokrit og flyder på 10 pi / time. Figur 3 viser forskellen i aggregerede størrelser ved strømmen i kanalen reduceres fra 10 pi / time til 5 ul / time i en hæmatokrit på 10%. Dette giver en kvalitativ opfattelse af størrelserne af aggregaterne når variere hæmatokrit og forskydningshastighed. Figur 5 følger forskydningen af fire humane RBC aggregater, i tre på hinanden følgende rammer, hvilket giver et kvalitativt mål for den krævede kamera frame rate og kvalitativ forestilling om aggregater fordeling inden for hver ramme. I figur 5 er de små aggregater (med 8 eller fradrag af skønnede RBC) vist med blåt, mens mellemstore aggregater (spænder 9-30 anslået RBC) og store aggregater (større end 30 anslået RBCs) er vist i grøn og rød hhv.

figur 7, hvor de røde, blå og grønne kurverne repræsenterer hastighedsprofiler for RBC'erne suspenderet ved 5%, 10% og 15% hæmatokrit henholdsvis. RMS fejl hastigheden, også vises i figur 7 for hver RBC-suspension, er relativt små i forhold til de velocity værdier, der angiver præcisionen af hastighedsmålinger og dermed forskyde satser. Grænsefladelokaliteter betegnes som »E« og vist som de fuldt optrukne linjer i samme figur.

De tilsvarende forskydningshastigheder for de forskellige RBC-suspensioner (baseret på hastighedsprofiler og tykkelse blodet lag) er vist i tabel 1. De gennemsnitlige samlede størrelser bestemmes for hver af RBC-suspensioner, baseret på billedbehandling metode til at detektere arealet af RBC aggregater, er vist i figur 9, som funktion af den tilsvarende forskydningshastighed. Et eksempel på fordelingen af procentdelen af RBC'er inden hvert aggregat er vist i figur 6. De samlede størrelser er repræsenteret som et anslået antal RBC i aggregaterne.

Figur 1
Figur 1. Double Y-mikrokanalplade konfiguration og indrejse væsker. Blod ind i første afdeling ved Q = 2 pi / time, mens PBS kommer ind i anden gren på Q = 8 pi / time. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Menneskelig RBC-suspension på forskellige hæmatokrit. Tallet repræsenterer fanget billeder af de menneskelige RBC-suspensioner flyder på Q = 10 gl / time ved (A) 5% (B)10%, og (C) 15% hæmatokrit. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Menneskelig RBC-suspension ved forskellige strømningshastigheder. Tallet repræsenterer fanget billeder af de menneskelige RBC suspenderet ved 10% hæmatokrit H flyder (A) Q = 10 ul / time og (B) Q = 5 ul / time. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Rutediagram af billedbehandling program, der bruges til samlet detektion. Illustrationerne beskriver den grundlæggende metode, der anvendes trin. Kvaliteten af ​​billedet forbedres at blive c onverted til et binært billede. Detekteres aggregaterne og mærket på grundlag af deres respektive størrelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. RGB farve og netto bevægelse af flere menneskelige RBC aggregater for tre på hinanden følgende rammer. Figuren viser netto bevægelse af fire aggregater påvist i tre på hinanden følgende frames ved (A) t = 0 ms, (B) t = 60 ms og (C) t = 120 msek. De store aggregater (> 30 anslået RBC), medium aggregater (30/09 estimerede RBC) og små aggregater (<8 anslået RBC) er vist i rød, grøn og blå hhv. Hver af aggregaterne detekterede er markeret med en sort cirkel._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. RBC samlet størrelsesfordeling for 10% H RBC-suspension til forskellige strømningshastigheder. Aggregate størrelsesfordeling for blodprøver suspenderet på 10% H, der flyder på Q = 10 og 5 pl / hr. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Velocity profil sammenligning for forskellige hæmatokrit. Er De hastighedsprofiler vist for RBC i plasma suspenderet ved 5% H (rød), 10% H (blå), 15% H (grøn) og simulering 19 (fuldt optrukket linie) for den 120 x 60 um dobbelt Y-mikrokanalplade med en Q = 10 pi / time. Grænsefladen placering er betegnet med E forforsøg. De tilsvarende RMS fejl af de forskellige hastighedsprofiler vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. billede baggrund for de forskellige RBC-suspensioner og afgrænsning af tykkelsen blodet lag. Figuren viser afgrænsningen af blodet lagtykkelse af RBC-suspensioner flyder på 10 ul / t suspenderes (A) 5%, (B ) 10% og (C) 15% H. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9
Figure 9. gennemsnitlige samlede størrelser som en funktion af de tilsvarende forskydningshastigheder. Resultaterne er opnået for de forskellige RBC-suspensioner flyder på Q = 10 gl / time ved 5% (A), 10% (B) og 15% H (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Hæmatokrit Strømningshastighed (pl / hr) Forskydningshastighed (sek-1)
5% 10 11.02
5% 5 5.36
10% 10 8,17
10% 5 4.47
15% 10 7,41
15% 5 2,51

Tabel 1. forskydningshastighed for forskellige blodgennemstrømning tilfælde. Er forskydningshastigheden værdier opnået under anvendelse af de μPIV data og billedbehandling resultater for forskellige RBC-suspensioner med 5%, 10% og 15% H, der strømmer med Q = 10 pi / time og Q = 5 ul / time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved hjælp af denne metode er det muligt at analysere kvalitativt og kvantitativt RBC aggregater under forskellige strømningsforhold og hæmatokrit. For vellykket testning og samlede afsløring, er det afgørende at bestemme den passende forhold hastigheden mellem de to væsker ved mikrokanalplade indgang. Dette forhold er meget vigtigt at opnå en optimal blod lagtykkelse hvor hastighedsprofil er quasi-lineær 19.

En anden vigtig faktor for en vellykket test er en god billedkvalitet. Faktisk, da metoden er baseret på billedbehandling, er det meget vigtigt at have en kontrast mellem billedets baggrund (fluidet i den kanal), og de partikler, der skal påvises. Her, som vist i figur 2 og 3, partiklerne synes at være mørkere end baggrunden, som hjælper i den samlede detektion. Den vigtigste parameter at overveje for billedbehandling teknik er threshold værdi. Derfor, baseret på kontrasten opnåede det afgørende at vælge den optimale tærskelværdi, hvor alle aggregaterne vil blive taget i betragtning, som vist i figur 5. Den foreliggende billedsegmentering, anvendt til denne undersøgelse, er meget udbredt til påvisning og tælling celle 25- 27. Hvis kvaliteten af billedet ikke er som ønsket, og en global tærskelværdi er ikke hensigtsmæssigt, kan man anvende en anden algoritme til at bestemme den optimale tærskelværdi såsom Otsu metode 28 eller en adaptiv tærskelværdiansættelse metode (diskretisering af billedet og opnåelse af en lokal tærskel for hver diskretiseres vindue).

En anden faktor at tage i betragtning, er skaleringsfaktoren for en ordentlig konvertering fra pixels til um.

Bruger den korrekte omregningsfaktor, kan man bestemme diameteren og tykkelsen af ​​et RBC, der vil tjene til at bestemme den samlede størrelse distribution (baseret på den estimerede number af RBC i hvert aggregat). Afhængigt af orienteringen af ​​aggregaterne, korrekt beregne arealet på en RBC (frontal eller fra siden). Som nævnt i afsnit 4 (trin 4.4.1), er det vigtigt at bestemme den korrekte kamera eksponeringstid og frame rate for at sikre, at de dynamiske egenskaber af aggregaterne indfanges mellem hvert træk ramme. Denne værdi er baseret på strømningshastigheden anvendes, når de erhverver målingerne. Brug flere andre faktorer, der skal tages i betragtning, når de erhverver resultater ved hjælp af μPIV-systemet og er klart diskuteres i studiet af Pitts og Fenech 20.

Metoden blev afprøvet med succes på flere RBC-suspensioner flyder på forskellige hæmatokrit. Men på grund af begrænsningen af ​​billedbehandling teknik og manglen på kontrasten mellem billedets baggrund og aggregaterne, er det vanskeligt at detektere RBC aggregater for højere hæmatokrit (fra 20% til 45%). Faktisk som nævnttidligere, billedkvaliteten er afgørende for denne metodik.

Ved hjælp af denne protokol, kan måles RBC aggregerede størrelser i et kontrolleret mikrovæskeanordning og derfor er det muligt at få oplysninger om RBC sammenlægning dynamisk i mikrocirkulationen og få de RBC samlede størrelser for en række fysiologiske shear satser. Det er også muligt at supplere numeriske og eksperimentelle undersøgelser af blod rheologi og relatere de samlede størrelser og adfærd til kliniske og patologiske undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada. Mikrofabrikation blev udført med støtte fra McGill Nanotools MicroFab facilitet på McGill University og Department of Electronics ved Carleton University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
  2. Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
  3. Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
  4. Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
  5. Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
  6. Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
  7. Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
  8. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
  9. Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
  10. Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
  11. Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
  12. Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
  13. Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
  14. Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
  15. Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
  16. Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
  17. Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
  18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
  19. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
  20. Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
  21. Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
  22. Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
  23. Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
  24. Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
  25. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
  26. Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
  27. Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
  28. Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).

Tags

Bioengineering Røde blodlegemer sammenlægning mikrocirkulationen mikrofluidik mikro partikel billede Velocimetri blod rheologi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

Kontrolleret Mikrofluid Miljø for Dynamic Undersøgelse af røde blodlegemer Sammenlægning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter