Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

הפרוטוקול מתואר פרטי הליך ניסיוני לכמת אגרגטים של תאי דם אדומים (RBC) תחת שיעור גזירה מבוקרת וקבוע, המבוסס על טכניקות עיבוד תמונה. המטרה של פרוטוקול זה היא להתייחס גדלים כולל RBC לשיעור הגזירה המקביל בסביבת microfluidic מבוקרת.

Abstract

דם, כBiofluid אינו הניוטונית, מייצג את המוקד של מחקרים רבים בתחום hemorheology. מרכיבי דם כוללים תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם שמושעים בפלזמת דם. בשל הריבוי של תאי הדם האדומים (40% עד 45% מנפח הדם), ההתנהגות שלהם מכתיבה את התנהגות rheological דם במיוחד בזרימת הדם. בשיעורי גזירה נמוכים מאוד, RBCs נראה להרכיב וגופי טופס הנקראים אגרגטים, שגורם להתנהגות לא-הניוטונית של דם. חשוב להבין את התנאים של היווצרות אגרגטים להבין rheology הדם בזרימת דם. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את הליך הניסוי כדי לקבוע כמותית מצרפי RBC בזרימת דם בשיעור גזירה מתמדת, המבוסס על עיבוד תמונה. למטרה זו, RBC, השעיות נבדקות ונותחו ב120 x 60 מיקרומטר פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) microchannels. RBC, ההשעיות הן אף אוזן גרוןירד גשם באמצעות נוזל שני על מנת לקבל פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם ובכך להשיג מגוון רחב של שיעורי גזירה קבועים. שיעור הגזירה נקבע באמצעות שימוש במערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV), בעוד אגרגטים RBC הם דמיינו באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. קטעי הווידאו שנתפס של אגרגטים RBC מנותחים באמצעות טכניקות עיבוד תמונה על מנת לקבוע את הגודל הכולל המבוסס על עוצמות תמונות.

Introduction

תאי דם אדומים (RBCs) לשחק תפקיד מכריע בקביעת התנהגות rheological של דם. הם כמעט להפליא אחראים לתכונות מסוימות של דם במבחנת in vivo. בתנאים פיסיולוגיים, RBCs לכבוש 40% ל -45% מנפח הדם. בזרימת דם, תאי הדם אדום לכבוש רק עד 20% מנפח הדם בשל קטרי כלי קטנים והפלזמה ברפרוף השפעת 1. תופעה זו של ירידה בזרימת דם פלזמה ידועה כאפקט Fåhræus. בשיעורי גזירה נמוכים, RBCs מסוגל לגשר יחד וליצור מבנים ממדיים חד ממדי או שלושה בשם "rouleaux" או אגרגטים, ומכאן תורם להתנהגות שאינה הניוטונית של דם. עם זאת, המנגנון של צבירת RBC אינו מובן לחלוטין. שתי תאוריות קיימות מודל הצבירה של RBCs: הגישור של תיאורית התאים עקב המקשר בין-של מקרומולקולות 2 וattrac הכוחתיאורית tion נגרמת על ידי דלדול של המולקולות בשל השיפוע האוסמוטי 3.

בדרך כלל, לדם אדם, אגרגטים יוצרים בשיעורי גזירה נמוכים מאוד 4 החל 1-10 שניות -1. מעל לטווח זה, RBCs נוטה להיות משורש ולזרום בנפרד בתוך הכלי.

הבנת התנאים של היווצרות אגרגטים היא של חשיבות רבה לשדה hemorheology במונחים של הגדרת התנהגות rheological של הדם. אגרגטים אלה נראים לעתים קרובות ברמת macrocirculation (> 300 מיקרומטר הקוטר) 5. בקנה המידה הזה, דם נחשב כנוזל הניוטונית ותערובת הומוגנית. עם זאת, אגרגטים אלה נתפסים לעתים רחוקות ברמת הנימים (4-10 מיקרומטר קוטר) והם בדרך כלל אינדיקציה למצבים פתולוגיים כגון סוכרת והשמנה 6. מצבים פתולוגיים אחרים שיכולים לשנות צבירת RBC כוללת מצבים דלקתיים או מדבקים,מחלות לב וכלי דם כמו יתר לחץ דם או טרשת עורקים, הפרעות גנטיות ומחלות כרוניות 7. לכן, הבנת מנגנון צבירת RBC וניתוח גורמים אלה (על ידי הגדרת קשר בין הגודל של אגרגטים אלה ותנאי הזרימה) יכולה להוביל להבנה של התנהגות microrheological של דם ולכן מתייחס זה ליישומים קליניים.

ניתן לשנות אגרגטים RBC על ידי מספר גורמים כגון המטוקריט (נפח של תאי דם אדומים בדם), שיעור הגזירה, קוטר הכלי, קרום נוקשות RBC והרכב הבינוני השעיית 8-10. לכן, תנאים מבוקרים נדרשים על מנת לנתח ביעילות מצרפי RBC. כמה שיטות יכולות לנתח היווצרות המצרפי על ידי מתן מדידות צבירת סטטי (מדד צבירה) שמציע מידע רלוונטי על דם התנהגות. שיטות אלה כוללות, בין היתר, שקיעת הדם11 שיטה, שיטת העברת אור 12, שיטת השתקפות אור 13 ושיטת צמיגות הגזירה הנמוכה 14.

מחקרים מעטים ניסה ללמוד צבירת RBC ולקבוע את מידת הצבירה בזרימת תנאים מבוקרים 15-17. עם זאת, מחקרים אלה בעקיפין לחקור RBC גדלים המצרפי על ידי קביעת היחס של השטח הכבוש במערכת גז שנמדדה על בסיס תמונות דם מיקרוסקופיים מתן מידע על התואר של צבירה כמו גם הצמיגות המקומית.

לפיכך, אנו מציגים נוהל חדש לכמת ישירות RBC צובר בזרימת דם, באופן דינמי, תחת שיעורי גזירה מבוקרים וקבועים. RBC, השעיותיהם לרכבת, בY-microchannel כפול (כפי שמודגם באיור 1), עם פתרון בופר פוספט (PBS) ומכאן יצירת זרימת גזירה בשכבת הדם. בתוך הדם הזה שכבת שיאה קבועהניתן להשיג שיעור r. RBC, ההשעיות נבדקות בהמטוקריט שונה (H) רמות (5%, 10% ו -15%) ותחת שיעורים שונים גזירה (2-11 שניות -1). מהירות הדם וקצב גזירה נקבעות באמצעות מערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV) ואילו הזרימה דמיין באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. התוצאות שהתקבלו לאחר מכן מעובד עם קוד MATLAB מבוסס על עוצמות תמונה כדי לזהות את תאי הדם האדומים ולקבוע גדלים כולל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דם שנאסף מאנשים בריאים באישור ועדת האתיקה של אוניברסיטת אוטווה (H11-13-06).

1. ייצור microchannel

Microchannels מיוצרות על בסיס שיטות photolithography הסטנדרטי 18.

  1. עיצוב הגיאומטריה microchannel באמצעות עיצוב תוכנה בעזרת מחשב (CAD) ולהדפיס את התצורה בתמונה-מסכת שקיפות. מסכות אלה הן קריטיות שכן הם מכתיבים את נתיב האור במהלך תהליך הייצור. במקרה זה, את ממדי microchannel 120 מיקרומטר בעובי, 60 מיקרומטר בעומק 7 מ"מ האורך.
  2. בחדר נקי, מעיל ספין אפוקסי שלילי מבוסס צילום להתנגד על פרוסות סיליקון ב2,000 סל"ד במשך 30 שניות כדי לקבל את העומק הרצוי microchannel (60 מיקרומטר).
  3. לחשוף את הרקיק והתמונה-מסכה תחת מנורת UV ב 650 mJ / 2 סנטימטר על 70 שניות. ודא לחשוף את האזורים השקופים רק שלצילום המסכה UV-האור. החשיפה של האזורים השקופים מאפשרת לפילמור של הרשתות וכתוצאה מהתקשות של התמונה-להתנגד. לטבול פיסת סיליקון למפתח כדי להסיר את העודפים של תמונה-להתנגד.
  4. ברגע העובש הוא מפוברק, לערבב אלסטומר מבוסס סיליקון וסוכן ריפוי ביחס של 10: 1 כדי ליצור פתרון של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS). שים את פתרון PDMS בתא ואקום לדגה. לשפוך אותו לתוך התבנית ולחמם אותו על 60 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות כדי ליצור microchannels. אז אג"ח הערוצים הבודדים לשקופיות זכוכית באמצעות מליטה פלזמה חמצן למשך 90 שניות.
    הערה: תהליך דגה PDMS מתבצע על מנת לחסל את בועות האוויר שנוצרו עקב תהליך הערבוב.
  5. ודא שמידות microchannel לאפשר לבדיקה מוצלחת. בפרוטוקול זה, יש לי microchannels חתך מלבני של 120 x 60 מיקרומטר. לשם השוואה, יש RBC ממוצע בקוטר של 8 מיקרומטר ועובי של 2 מיקרומטר.refore, רוחב microchannel מספיק להתבונן צבירה נכונה ולקבוע במדויק את פרופילי מהירות.

2. הכנת דם

  1. איסוף דם מתורמים מתנדבים בריאים, לאחר אישור ועדת אתיקה. פנק את הדם עם חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) הנוכחי בצינורות האיסוף (7.2 EDTA מ"ג ב 4 מיליליטר של דם).
    הערה: EDTA משמש כדי למנוע קרישת דם.
  2. צנטריפוגה דגימות הדם שלוש פעמים במשך 10 דקות ב 1400 XG (3,000 סל"ד) על מנת להפריד את מרכיבי הדם. כתוצאה מצנטריפוגה, להתבונן שלוש שכבות נפרדות.
    הערה: שלוש השכבות הן שכבת RBC (ממוקמת בחלק התחתון של הצינור), המעיל באפי (בהיקף של תאי דם לבנים וטסיות דם הממוקמים בחלק העליון של שכבת RBC) ושכבת הפלזמה (הממוקם בחלקו העליון של כל האחר בוחרים).
    1. לאחר צנטריפוגה הראשונה, לאסוף פלזמה דם בעזרת פיפטה דם. הימנע מכל ג ontact עם המעיל באפי.
    2. לאסוף ולהשליך את המעיל באפי במכל עם אקונומיקה מדוללת ב 10%.
    3. להוסיף 3 מיליליטר של pH 7.4 PBS לכל אחד מהצינורות עם שכבת RBC שנותר ולהבטיח האיזון הראוי של צנטריפוגות. לערבב בעדינות את הצינורות וצנטריפוגות שוב ב1,400 XG (3,000 סל"ד) במשך 10 דקות.
      הערה: ודא שפתרון PBS אינו מכיל מגנזיום או סידן שכן הם יכולים לשנות את הידבקות התא.
    4. השלך PBS בצינורות לאחר צנטריפוגה השנייה ולהסיר את המעיל באפי שנותר אם קיימים. חזור על שלבים 2.2.3 ו2.2.4 לצנטריפוגה השלישית להניב RBCs הנקי.
  3. מערבבים את הסכום הנדרש (0.05, 0.1 ו0.15 מיליליטר) של תאי הדם אדומים הנקי עם פלזמה (0.95, 0.9 ו0.85 מיליליטר) בצינור מיליליטר 1 על מנת לקבל RBC, השעיות עם (5% המתאימים, 10% ו -15% המטוקריט). בדוק hematocrits עם microcentrifuge.

3. נוזלי הכנה

= "Jove_content" ילדה> להציג שני נוזלים בY-microchannel הכפול: RBC, ההשעיות וPBS.

  1. חלקיקים להוסיף 60 μl של פתרון החלקיקים נותב ניאון (1% מוצקים, ד = 0. 86 מיקרומטר, שרירי בטן λ = 542 ננומטר ופליטת λ = 612 ננומטר) לצינורות RBC-ההשעיה 1 מיליליטר.
    הערה: החלקיקים נותב הניאון (צבועים פנימי חלקיקי פוליסטירן) משמשות למדידת המהירות של הזרימה בתוך microchannel. חלקיקים אלה לזרוח כאשר הם נחשפים לגל המקביל של קרן הלייזר (ננומטר = λ 542).
  2. הכן פתרון PBS pH 7.4 ולהוסיף 60 μl של אותו פתרון חלקיקים נותב הניאון ב 1 מיליליטר של פתרון PBS.

4. מדידות גודל מצרפים

  1. כדי להכניס את הנוזלים (RBC, השעיות וPBS) בmicrochannel, להשתמש בשני מזרקים זכוכית של 25 μl 100 μl. רצון זהכדי לעזור להפחית את התאימות של המערכת. חבר את microchannel למזרקים דרך צינורות והמחברים מתאימים חורי הכניסה. מלא את המזרקים הזכוכית באמצעות הבדל הלחץ הקיים בין מיכל הנוזל והמזרק. להבטיח בועות לא קיימים במערכת. כשיטת חלופית, להשתמש במערכת לחץ מבוקר לנהוג שני הנוזלים בmicrochannel.
  2. מניחים את microchannel על הבמה מיקרוסקופ הפוכה המחוברת למצלמה במהירות גבוהה ומערכת μPIV. תכנית משאבת המזרק לספיקות הרצויות (למשל, ש = 2 μl / שעה לדם מולידה flowrate של Q = μl 8 / שעה לPBS).
    הערה: רק אחד משאבת מזרק משמש. שימוש בשני מזרקים זכוכית שונים, עם שני קטרים ​​פנימיים שונים, אפשר להשתנות לflowrate נכנסת כל סניף של Y-microchannel.
  3. הכנס שני הנוזלים בY-microchannel הכפול כל מסניף כניסה שונה ובflowrates שונה כפי שמוצג ב 19 (איורים 2 ו -3). חכה לזרימה להגיע למצב יציב לפני רכישת המדידות: חזותי לבדוק את תמונות מצלמה במהירות הגבוהה לזרימה חלקה.
    הערה: היחס הוא קריטי בהשגת פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם.
  4. דמיין את RBCs שימוש במצלמה במהירות הגבוהה. חבר את המצלמה למחשב כדי לשלוט, להקליט ולשמור את התמונות של זרימת הנוזל. ברגע ששני זורם הנוזל להגיע למצב יציב, להתחיל בהקלטה.
    1. לרכוש כמה תמונות לתוצאות עיבוד טובות יותר. לקבוע זמן חשיפת מצלמה אופטימלי לתמונה ברורה של המצרפים.
      הערה: חשיפת המצלמה הזמן למקרה זה היה 0.5 msec. הבחירה של מרווח זמן בין כל מסגרת מבוססת על קצב פריימי מצלמה ואת קצב הזרימה בtהוא microchannel. הזמן בין כל מסגרת מעובד בהליך זה היה 60 אלפיות שני. לכן מצלמה מסוגלת להקליט 18 מסגרות לשניות מספיקה.
      הערה: הימנע מיישוב דם בצינור והמזרק, מה שעלול להוביל למדידות שגויות.
  5. באמצעות שימוש בטכניקות עיבוד תמונה (תכנית MATLAB במקרה זה) לשיפור איכות התמונה, לזהות את אגרגטים בכל אחת מהתמונות המבוססות על עוצמות פיקסל (באיור 4) כדלקמן:
    1. שפר את התמונות בניגוד תוך שימוש בשיטת אקולייזר היסטוגרמה להשיג איכות תמונה טובה יותר לכל מסגרת.
    2. המרת התמונות בגווני אפור לתמונות בינארי. לשם כך, נקבע ערך סף, החל 0-1, שמכתיב את ההמרה של כל פיקסל. כל פיקסל בתמונה מתחת לערך הסף יזוהה כפיקסל שחור, ואילו פיקסלים עם ערכים גדולים יותר מהסף יזוהו כפיקסלים לבנים.
    3. מלאחורים (אם קיימים והכרחי) המתאימים לפערים בתוך כולל אחד לתוצאות טובות יותר.
    4. זיהוי התאים על ידי קביעת פיקסלים לבנים שכנים בתמונה בינארי, כך שתאים סמוכים קשורים כאגרגטים.
    5. תווית המצרפים השונים זוהו ולהמיר את התמונה בינארי לתמונה כחולה-ירוק-אדום (RGB) להדמיה טובה יותר. צעדים לשלב מסגרות המקוריות עם כל אחת מתמונות מעובד המקבילות כדי לוודא את היעילות של טכניקת עיבוד תמונה ולהבטיח כי כל התאים נלקחים בחשבון, כפי שמוצגים באיור 5. בצע 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 ו4.5.5 לכל המסגרות שנתפסו.
    6. לחשב את השטח של כל כולל זוהה במסגרת מבוססת על מספר הפיקסלים מזוהים. בהתבסס על הגדלת העדשה משמשת, לחשב את מקדם ההמרה, באמצעות ארנק כיול, ולהמיר את התוצאות למיקרומטר 2. ממוצע הגדלים הכולל זוהו בכלמסגרת ולאחר מכן בממוצע התוצאות עבור כל המסגרות להשיג את הגודל כולל הממוצע לכל הקלטה של ​​RBC, השעיות.
    7. לחשב את השטח של אחד RBC לקבוע מספר משוער נציג RBCs בתוך כל כולל זוהה. שימוש בתוצאות הללו, לחשב את חלוקת אחוזי RBCs בתוך כל המצרפי כפונקציה של הגדלים הכולל (המיוצג על ידי המספר המשוער של תאים בכל כולל), כפי שמוצג באיור 6.
      הערה: כדי למדוד את אגרגטים RBC, תוכנת ImageJ יכולה לשמש (במקום MATLAB) כדי לבצע את אותן משימות בכל מסגרת.

5. מדידות מהירות נוזל ושאר דרג

לקבוע את מהירות נוזל ולכן שיעור הגזירה באמצעות מערכת μPIV.

  1. ברגע שהנתונים שנרכשו באמצעות המצלמה במהירות הגבוהה, לעבור למצלמה פעמו הכפולה המשמשת למערכת μPIV. השתמש בתוכנת הדמיה לAC תמונהquisition של הזרימה ועיבוד התמונה להגדרה שדה מהירות.
  2. קח את כל אמצעי הזהירות הנדרשת, בהתאם למעמד של הלייזר, לפני הפעלת הלייזר. לאחר מכן הפעל את המערכת, את המצלמה והליזר.
  3. לכייל את המצלמה מבוססת על הגדלת העדשה בשימוש. לשם כך, השתמש מיקרוסקופי של 10 מיקרומטר דיוק מתחת למיקרוסקופ ולהגדיר את הגודל של 1 פיקסל בתמונה.
  4. התחל הלייזר ולדמיין את החלקיקים בשני הנוזלים. מצא את מטוס אמצע microchannel על ידי התמקדות בחלקיקים המהירים ביותר בזרימה (כלומר, החלקיקים המהירים ביותר צריכים להיות הבהירים).
  5. הגדר את DT (מרווח זמן בין שתי מסגרות רצופות) כדי להבטיח את העקירה הנכונה של החלקיקים. החלקיקים המהירים ביותר צריכים לעבור על 5 עד 10 פיקסלים בין שני התמונות.
  6. להתחיל להקליט את הזרימה. הגדר את התוכנה לרכוש של תמונות 100 זוגות, 5 גזרים msec. בצע את השלבים 5.4, 5.5 ו -5.6 לכל DIFferent RBC, השעיות ולשיעורי גזירה שונות.
    הערה: פרטים נוספים על מתודולוגיה ניתנים במחקר של פיטס וFenech 20.
  7. לעבד את ההקלטות נרכשו בשיטה חוצה קשר עם תוכנת ההדמיה.
    הערה: זה מורכב מdiscretizing זוג תמונות לתוך חלונות קטנים בגודל שנקבע מראש (המבוסס על זרימת נוזל ואת מרווח הזמן שנבחר על ידי המשתמש) נקרא Windows מתאם ובעקבות התזוזה של החלקיקים בכל חלון.
    1. ראשית, לקבוע אם התמונות שנרכשו דורשות עיבוד מראש (כולל רקע חיסור, "בסיס-גזיר" 21 או תמונה חופף 22,23) לעיבוד נתונים טוב יותר.
    2. לאחר מכן בחר את גודל חלון מתאם וצורה, כמו גם של אחוז של תמונות חופפות. מחקר מפורט בוצע על ידי פיטס et al. 24 על מנת לקבוע את הפרמטרים אופטימליים וטכניקות עיבוד מראש תמונה לדםלזרום בתצורות ערוץ אחרות. להביע את התוצאות כשדה מהירות ממוצעת מחושב מזוגות התמונה 100 ושגיאת כיכר Mean שורש (RMS) במהירות.
  8. לחלץ פרופיל מהירות ביציאת הערוץ, מהעיבודים כפי שמוצג באיור 7. לפרופיל טוב יותר, בממוצע שדה המהירות בחלל.
    הערה: הברים להלחין את פרופיל המהירות מתאים לגודל חלון המתאם נבחר יחסית לרוחב הערוץ. שגיאת RMS במהירות גם מוצגת באיור 7, המייצגת את השגיאה בהערכת המהירות הניסיונית.
  9. כבה את הלייזר פעם אחת את כל המדידות והעיבוד מבוצעים ,. כבה את כל הרכיבים של המערכת: תוכנה, מצלמות, שלב מרגש, מחשבים והלייזר.
  10. כדי לחשב את שיעור הגזירה, הראשון לזהות ולהעריך את עובי הדם בmicrochannel מבוסס על הקלטת המצלמה במהירות הגבוהה. למטרה זו, בממוצע כלהמסגרות בהקלטה הספציפית כדי להשיג תמונת רקע של הווידאו. תוחם את שכבת הדם (כפי שמוצג באיור 8 לRBC, ההשעיות זורמות בμl 10 / hr כאשר הושעו ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט). לקבל את ערך המהירות לעובי שכבת הדם המתאים ולחשב את שיעור הגזירה על ידי חלוקת שווי מהירות על ידי עובי שכבת דם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמא של הזרימה דו-הנוזל בY-microchannel הכפול מוצגת באיור 2 לRBCs אדם המושעה ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט וזורם בμl 10 / hr. איור 3 מציג את ההבדל בגדלים מצטברים כאשר הזרימה בערוץ מצטמצמת מ -10 μl / שעה 5 μl / שעה להמטוקריט של 10%. זה נותן רעיון איכותי של הגדלים של המצרפים כאשר משתנה המטוקריט ושיעור גזירה. איור 5 כדלקמן עקירתם של ארבעה מצרפי RBC אדם, לשלוש מסגרות רצופות, מספק מדד איכותי של קצב המצלמה המסגרת נדרשת ורעיון איכותי של צובר הפצה בתוך כל מסגרת. באיור 5, אגרגטים הקטנים (עם RBCs 8 או פחות משוער) מוצגים בכחול, ואילו אגרגטים בינוניים (החל 9-30 מוערכים RBCs) ואגרגטים גדולים (יותר מ 30 נאמדו RBCs) מוצגים בירוק ואדום, בהתאמה.

התחת = "jove_content"> פרופילי המהירות של RBC, ההשעיות השונות בערוץ מוצגים באיור 7, שבו העקומות האדומות, כחולות וירוקות מייצגות את פרופילי המהירות של RBCs המושעה ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט בהתאמה. RMS השגיאות של המהירות, גם מוצגות באיור 7 עבור כל RBC, השעיה, הם קטנות יחסית בהשוואה לערכי מהירות, המציינות את הדיוק של מדידות המהירות, ומכאן גזירה שיעורים. מקומות הממשק מסומנים כ'E 'ומוצגים כקווים מוצקים בדמות אותה.

השיעורים המקבילים הגזירה לRBC, ההשעיות השונות (המבוססים על פרופילי מהירות ועובי שכבת דם) מוצגים בלוח 1. גדלים כולל הממוצע שנקבעו לכל אחד מRBC, ההשעיות, המבוססים על שיטת עיבוד תמונה לזיהוי אזור של אגרגטים RBC, מוצג באיור 9, כfunctיון של שיעור הגזירה המקביל. דוגמא של חלוקת אחוז RBCs בתוך כל כולל מוצגת באיור 6. הגדלים הכולל מיוצגים כמספר משוער של RBC במצרפים.

איור 1
איור 1. נוזלי תצורת Y-microchannel וכניסה זוגי. דם נכנס לסניף הראשון בQ = 2 μl / שעה תוך PBS נכנס לסניף השני בש = 8 μl / שעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אדם RBC, השעיה בהמטוקריט שונה. הדמות מייצגת נתפסה מסגרות של RBC, השעיות אדם זורמות בQ = 10 μl / שעה ב() 5% (ב)10% והמטוקריט של 15% (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. אדם RBC, השעיה בflowrates שונה. הדמות מייצגת נתפסה מסגרות של RBCs האדם המושעה ב 10% H המטוקריט זורם () Q = 10 μl / שעה וQ (B) = 5 μl / שעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. תרשים זרימה של תכנית עיבוד תמונה המשמשת לאיתור כולל. הצעדים מוצגים לתאר את המתודולוגיה הבסיסית בשימוש. איכות התמונה משופרת להיות ג onverted לתמונה בינארית. אגרגטים מזוהים ומסומנים מבוססים על הגדלים שלהם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. RGB צביעה ותנועת נטו של כמה RBC האדם צוברים במשך שלוש מסגרות רצופות. איור מציג את התנועה הנקי של ארבעה מצרפים זוהו בשלוש מסגרות ברציפות ב() t = 0 msec, t = 60 אלפיות שני (B) ו (ג) t = 120 אלפיות שני. אגרגטים הגדולים (> 30 העריכו RBCs), אגרגטים בינוניים (9-30 RBCs המשוער) ואגרגטים קטנים (<8 מוערכים RBCs) מוצגים בבהתאמה אדומה, ירוק וכחול. כל אחד מהמצרפים זוהו מסומנים בעיגול שחור._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. הפצת RBC גודל כולל של 10% H RBC, השעיה לספיקות שונות. התפלגות גודל צבירה לדגימות דם המושעית בH 10%, זורמת בQ = 10 ו -5 μl / שעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7
איור השוואת פרופיל 7. מהירות להמטוקריט שונה. פרופילי המהירות מוצגות לתאי דם אדומים בפלזמה המושעית ב 5 H% (אדום), 10% H (כחול), H 15% (ירוק) וסימולציה 19 (קו מוצק) ל 120 x 60 מיקרומטר Y-microchannel כפול עם = 10 μl / שעה ש. מיקום הממשק הוא כונה על ידי E לניסויים. שגיאות RMS המקבילה פרופילי מהירות השונים מוצגות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
רקע איור 8. תמונה לRBC, ההשעיות והתיחום השונים של עובי שכבת דם. איור מציג את התיחום של עובי שכבת דם של RBC, ההשעיות זורמות בμl 10 / hr מושעה ב 5%, (ב () ) 10% ו() ח 15% C אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
Figuמחדש 9. גדלים כולל ממוצע כפונקציה של שיעורי גזירה המקבילות. התוצאות מתקבלות לRBC, ההשעיות השונות זורמות בQ = 10 μl / שעה ב 5% (), 10% (ב) ​​ו- H 15% (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המטוקריט קצב זרימה (μl / שעה) שיעור גזירה (סעיף -1)
5% 10 11.02
5% 5 5.36
10% 10 8.17
10% 5 4.47
15% 10 7.41
15% 5 2.51

ערכי שיעור 1. שאר שולחן למקרי זרימת דם שונים. ערכי שיעור הגזירה מתקבלים באמצעות תוצאות עיבוד נתונים ותמונת μPIV לRBC, השעיות שונות עם 5%, 10% ו -15% H, זורמים בQ = 10 μl / hr וQ = 5 μl / שעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שימוש במתודולוגיה הנוכחית, ניתן לנתח איכותי וכמותית RBC אגרגטים בתנאי זרימה שונות וhematocrits. לבדיקה מוצלחת וזיהוי כולל, חשוב לקבוע את יחס מהירות הראוי בין שני הנוזלים בכניסת microchannel. יחס זה הוא חשוב מאוד כדי להשיג עובי שכבת דם אופטימלי שבו פרופיל המהירות הוא מעין-ליניארי 19.

גורם מרכזי נוסף לבדיקה מוצלחת הוא איכות תמונה טובה. למעשה, מאז השיטה מבוססת על עיבוד תמונה, זה מאוד חשוב שיהיה ניגוד בין רקע התמונה (הנוזל בתוך הערוץ) והחלקיקים כדי להתגלות. כאן, כפי שמוצגים באיורים 2 ו -3, החלקיקים נראים כהה יותר מהרקע, אשר מסייע באיתור הכולל. הפרמטר החשוב ביותר שיש לשקול לטכניקת עיבוד תמונה הוא לאערך hreshold. לכן, המבוסס על הניגוד שהושג זה הוא חיוני כדי לבחור את ערך הסף האופטימלי שבו כל המצרפים יילקחו בחשבון, כפי שמוצגים באיור 5. פילוח התמונה הנוכחי, המשמש למחקר זה, נעשה שימוש נרחב לגילוי תאים וספירה 25 27. אם איכות התמונה היא לא כרצויה וערך סף גלובלי הוא לא מתאים, אפשר להשתמש באלגוריתם שונה כדי לקבוע את ערך הסף האופטימלי כגון השיטה של Otsu 28 או שיטת סף המסתגל (discretizing התמונה ו קבלת סף מקומי לכל חלון discretized).

גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא גורם קנה המידה להמרה נכונה מפיקסלים למיקרומטר.

שימוש במקדם ההמרה המתאים, ניתן לקבוע את הקוטר ועובי של אחד RBC שישמש כדי לקבוע את התפלגות הגודל הכוללת (המבוסס על הערכת number של RBCs בכל כולל). בהתאם לכיוון של אגרגטים, לחשב כראוי את האזור על אחד RBC (קדמי או מבט מצד). כאמור בסעיף 4 (שלב 4.4.1), חשוב לקבוע את זמן חשיפת מצלמה הנכון וקצב פריימים כדי להבטיח שהתכונות הדינמיות של אגרגטים נלכדות בין כל מסגרת ברציפות. ערך זה מבוסס על קצב הזרימה משמש בעת רכישת המדידות. גורמים אחרים כמה צריכים להילקח בחשבון בעת רכישת תוצאות שימוש במערכת μPIV והם דנו באופן ברור במחקר של פיטס וFenech 20.

המתודולוגיה נוסתה בהצלחה בכמה RBC, השעיות זורמות בהמטוקריט שונה. עם זאת, בשל ההגבלה של טכניקת עיבוד תמונה וחוסר הניגוד בין רקע התמונה ואגרגטים, קשה לזהות את RBC אגרגטים לhematocrits גבוה יותר (מ -20% ל -45%). ואכן כאמורבעבר, איכות התמונה היא חיונית למתודולוגיה זו.

שימוש בפרוטוקול זה, ניתן למדוד את הגודל הכולל RBC במכשיר microfluidic מבוקר ולכן ניתן לקבל מידע על צבירת RBC דינמית בזרימת דם ולהשיג בגדלים כולל RBC עבור מגוון רחב של שיעורי גזירה פיסיולוגיים. אפשר גם להשלים את הלימודים מספריים וניסיוניים של rheology דם ומתייחסים גדלים והתנהגות המצרפי למחקרים קליניים ופתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה. Microfabrication בוצע בתמיכה של מתקן מקגיל Nanotools Microfab באוניברסיטת מקגיל ובמחלקה לאלקטרוניקה באוניברסיטת קרלטון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
  2. Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
  3. Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
  4. Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
  5. Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
  6. Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
  7. Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
  8. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
  9. Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
  10. Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
  11. Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
  12. Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
  13. Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
  14. Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
  15. Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
  16. Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
  17. Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
  18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
  19. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
  20. Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
  21. Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
  22. Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
  23. Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
  24. Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
  25. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
  26. Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
  27. Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
  28. Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 100 תאי דם אדומים צבירה זרימת דם מיקרופלואידיקה velocimetry תמונת חלקיקי מיקרו rheology דם

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter