Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrollert mikrofluid Miljø for Dynamic Gransking av røde blodceller Aggregation

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollen er beskrevet detaljer en eksperimentell prosedyre for å kvantifisere røde blodceller (RBC) tilslag under en kontrollert og konstant skjærhastighet, basert på bildebehandlingsteknikker. Målet med denne protokollen er å forholde RBC aggregerte størrelser til tilsvarende skjærhastighet i et kontrollert microfluidic miljø.

Abstract

Blod, som en ikke-Newtonsk biofluid, representerer i fokus for mange studier i hemorheology feltet. Blodbestanddeler omfatter røde blodceller, hvite blodceller og blodplater som er suspendert i blodplasma. På grunn av den mengde av RBC-ene (40% til 45% av det blodvolum), dikterer deres oppførsel reologiske oppførsel av blod, spesielt i mikrosirkulasjonen. Ved meget lave skjærhastigheter, er RBCs ses å montere og danner enheter kalt aggregater, noe som fører til ikke-Newtonske oppførsel av blod. Det er viktig å forstå betingelsene for tilslag formasjonen for å forstå blod reologi i mikrosirkulasjonen. Protokollen er beskrevet her beskriver eksperimentelle prosedyren for å bestemme kvantitativt RBC aggregater i mikrosirkulasjonen under konstant skjærhastighet, basert på bildebehandling. For dette formål er RBC-suspensjoner undersøkt og analysert på 120 x 60 um poly-dimetyl-siloksan (PDMS) mikrokanaler. RBC-suspensjoner er entregnet ved hjelp av et andre fluid for å oppnå en lineær hastighetsprofil i blodet sjiktet og således oppnå et vidt spekter av faste skjærhastigheter. Skjærhastigheten bestemmes ved hjelp av en mikro Particle bilde velocimetry (μPIV) system, mens RBC aggregater er visualisert ved hjelp av høyhastighetskamera. Videoene fanget av RBC aggregatene er analysert ved hjelp av bildebehandlingsteknikker for å fastsette den samlede størrelser basert på bildene intensiteter.

Introduction

Røde blodceller (RBC) spiller en avgjørende rolle i å bestemme reologiske oppførsel av blod. De er nesten bemerkelsesverdig ansvarlig for de spesielle egenskapene til blod in vitro og in vivo. Under fysiologiske betingelser, RBC okkupere 40% til 45% av blodvolumet. I mikrosirkulasjonen, bare RBCs opptar opptil 20% av blodvolumet som følge av mindre fartøy diametere og plasma skimming effekt en. Dette fenomenet av plasma reduksjon i mikrosirkulasjonen er kjent som Fåhræus effekt. Ved lave skjærhastigheter, RBC-er i stand til å bygge bro sammen og danner en dimensjonal eller tre-dimensjonale strukturer som kalles "rouleaux" eller aggregater derav bidrar til den ikke-Newtonske oppførsel av blod. Imidlertid er mekanismen for RBC aggregering ikke helt forstått. To teorier for å modellere aggregering av RBCs: brokopling av celler teorien på grunn av tverrbinding av makromolekylene 2 og kraften severdsjon teori forårsaket av utarming av molekylene på grunn av den osmotiske gradienten 3.

Typisk for menneskeblod, aggregater dannes ved meget lave skjærhastigheter 4 som strekker seg fra 1 til 10 sek -1. Over dette område, RBCs en tendens til å flyte og disaggregert separat i beholderen.

Forstå betingelsene for aggregater dannelsen er av stor betydning for hemorheology feltet i form av å definere blodets reologisk atferd. Disse aggregater blir ofte sett på macrocirculation nivå (> 300 um diameter) 5. På denne skalaen, blir blod betraktes som en Newtonsk væske, og en homogen blanding. Imidlertid er disse aggregater sjelden sett i kapillaren nivået (4-10 mikrometer i diameter), og er vanligvis en indikasjon på patologiske tilstander slik som diabetes og fedme 6. Andre patologiske tilstander som kan endre RBC aggregering inkluderer inflammatoriske eller infeksiøse tilstander,kardiovaskulære sykdommer som høyt blodtrykk eller åreforkalkning, genetiske sykdommer og kroniske sykdommer 7. Derfor forstå RBC aggregering mekanismen og analysere disse enhetene (ved å definere en sammenheng mellom størrelsen av disse aggregater og strømningsforhold) kan føre til forståelsen av virkemåten microrheological av blod og dermed den i forbindelse med kliniske anvendelser.

RBC-aggregater kan endres av en rekke faktorer slik som hematokrit (volum av RBC i blod), skjærhastigheten, diameter fartøyet, RBC membranen stivhet og den suspenderende medium sammensetningen 8-10. Derfor er kontrollerte betingelser som kreves for effektivt å analysere RBC aggregater. Flere metoder er i stand til å analysere aggregatdannelse ved å gi statiske aggregering målinger (aggregering index) som gir relevant informasjon om blod atferd. Disse metodene inkluderer blant annet den senkningMetode 11, lyset overføringsmetode 12, lysrefleksjon metode 13 og den lave skjærkraftviskositet metode 14.

Få studier har forsøkt å studere RBC aggregering og fastslå graden av aggregering i kontrollerte strømningsforhold 15-17. Men disse studiene indirekte undersøke RBC aggregatstørrelser ved å bestemme forholdet mellom opptatt plass i en skjær system målt på grunnlag av mikroskopiske blodbilder som gir informasjon om graden av aggregering, så vel som den lokale viskositet.

Vi vil derfor presentere en ny prosedyre for å direkte kvantifisere RBC aggregater i mikrosirkulasjonen, dynamisk under kontrollerte og konstant skjærhastigheter. RBC-suspensjoner innesluttet, i en dobbelt Y-microchannel (som illustrert i figur 1), med et fosfatbufret saltvann (PBS) løsning og dermed forårsaker en skjærstrømning i blodet lag. Innenfor dette blodet lag en konstant shear hastighet kan oppnås. RBC-suspensjoner blir testet ved forskjellig hematokrit (H) nivåer (5%, 10% og 15%) og under forskjellige skjærhastigheter (2-11 sek -1). Blodet hastighet og skjærhastighet bestemmes ved hjelp av en mikro Particle bilde velocimetry (μPIV) system mens strømmen er visualisert ved hjelp av høyhastighetskamera. De oppnådde resultater blir så behandlet med en MATLAB kode basert på bildeintensitetene for å påvise og bestemme RBCs aggregatstørrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blod er hentet fra friske personer med godkjenning av etisk komité ved University of Ottawa (H11-13-06).

1. Mikro Fabrication

De microchannels er fabrikkert basert på standard fotolitografi metoder 18.

  1. Designe microchannel geometri ved hjelp av en dataassistert konstruksjon (CAD) programvare og skriver ut konfigurasjons på en transparent foto-maske. Disse maskene er viktig siden de diktere lysbanen under fabrikasjon prosessen. I dette tilfelle microchannel dimensjoner er 120 pm i tykkelse, 60 mikrometer i dybde og 7 mm i lengde.
  2. I et renrom, spin belegge en epoksybasert negativ Fotoresistmaterialet på en silisiumskive ved 2000 opm i 30 sekunder for å oppnå den ønskede mikrokanaldybden (60 mm).
  3. Utsett wafer og foto-maske under en UV-lampe på 650 mJ / cm 2 for 70 sek. Sørg for å avsløre bare de gjennomsiktige områdene avfoto-masken til UV-lys. Eksponering av de transparente områder tillater polymerisering av kjedene som resulterer i en herding av foto-motstand. Senk silisium stykke inn i en utvikler for å fjerne overskudd av foto-motstå.
  4. Når formen er fremstilt, blandes en silisiumbasert elastomer og et herdemiddel i et forhold på 10: 1 for å lage en løsning av poly-dimetyl-siloksan (PDMS). Sett PDMS oppløsning i et vakuumkammer for å avgasse. Hell den i formen og varme den til 60 ° C i 90 minutter for å lage mikrokanaler. Deretter binde de enkelte kanaler til et glass lysbilde bruke oksygen plasma bonding for 90 sek.
    MERK: PDMS Degas prosessen utføres for å eliminere luftbobler skapt av blandeprosessen.
  5. Kontroller at microchannel dimensjoner tillate vellykket testing. I denne protokollen er microchannels har et rektangulært tverrsnitt på 120 x 60 um. Til sammenligning har en gjennomsnittlig RBC en diameter på 8 um og en tykkelse på 2 um. Denrefore, er tilstrekkelig til å observere riktig aggregering og nøyaktig bestemme hastighetsprofiler microchannel bredde.

2. Blood Forberedelse

  1. Samle blod fra friske pasienter, etter godkjenning av en etisk komité. Behandl blod med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) som er tilstede i oppsamlingsrørene (7,2 mg EDTA i 4 ml blod).
    MERK: EDTA brukes for å unngå blodpropp.
  2. Sentrifuger blodprøver tre ganger i 10 minutter ved 1400 x g (3000 rpm) for å separere blodkomponenter. Som et resultat av sentrifugeringen, observere tre forskjellige lag.
    Merk: De tre lagene er RBC laget (plassert på bunnen av røret), buffy coat (bestående av hvite blodceller og blodplater som ligger på toppen av RBC lag) og plasmalaget (plassert på toppen av alle de andre bestanddeler).
    1. Etter den første sentrifugeringen, samle blodplasma ved hjelp av en pipette blod. Unngå enhver contakt med fibrinlagområdet.
    2. Oppsamlet fibrinlagområdet i en beholder med blekemiddel fortynnet til 10%.
    3. Tilsett 3 ml PBS pH 7,4 til hvert av rørene med det gjenværende RBC lag og sikre riktig balanse av sentrifugen. Bland forsiktig rørene og sentrifuger på nytt ved 1400 x g (3000 rpm) i 10 min.
      MERK: Kontroller at PBS løsningen ikke inneholder magnesium eller kalsium siden de kunne endre celleadhesjonen.
    4. Kast den PBS i rørene etter den andre sentrifugering og fjerne resten buffycoat hvis det finnes. Gjenta trinn 2.2.3 og 2.2.4 for tredje sentrifugering for å gi rene RBC.
  3. Bland den nødvendige mengden (0,05, 0,1 og 0,15 ml) av de rene RBCs med plasma (0,95, 0,9 og 0,85 ml) i en 1 ml tube for å oppnå RBC-suspensjoner med den tilsvarende (5%, 10% og 15% ) hematokrit. Sjekk hematocrits med en mikro.

3. Fluids Forberedelse

  1. Legg 60 mL av den fluoriserende spor partikler oppløsning (1% faststoff, partikkel d = 0. 86 um, abs λ = 542 nm og λ utslipp = 612 nm) inn i en ml RBC-suspensjon rør.
    MERK: fluoriserende sporpartiklene (internt farget polystyrenpartikler) brukes til å måle hastigheten av strømningen i microchannel. Disse partiklene fluorescerer når de utsettes for den tilsvarende bølgelengden til laserstrålen (λ = 542 nm).
  2. Tilbered en PBS pH 7,4-løsning og tilsett 60 pl av det samme fluorescerende tracer partikler oppløsning i 1 ml PBS-løsning.

4. Aggregater Size Målinger

  1. For å sette inn væsker (RBC-suspensjoner og PBS) i microchannel, bruke to glass sprøyter med 25 mL og 100 mL. Dette vilbidra til å redusere overholdelse av systemet. Koble microchannel til sprøytene via slange og kontakter Montering av innføringshull. Fyll sprøyter av glass ved hjelp av trykkforskjellen som eksisterer mellom fluidbeholderen og sprøyten. Sikre at ingen luftbobler i systemet. Som en alternativ metode ved å bruke en trykkstyrt system for å drive begge fluider i microchannel.
  2. Plasser microchannel på et invertert mikroskop trinn som er koplet til en høyhastighetskamera og en μPIV system. Program sprøytepumpen til ønsket strømningsrater (f.eks Q = 2 mL / time for blod engendering en strømningshastighet på Q = 8 mL / t for PBS).
    MERK: Bare én sprøytepumpe brukes. Ved å bruke to forskjellige glassprøyter, med to forskjellige innvendige diametere, er det mulig å variere strømningshastigheten til den går inn hver gren av den Y-microchannel.
  3. Sett begge væsker i dobbel Y-microchannel hver fra en annen oppføring gren og på ulike strømningshastigheter som vist i 19 (figur 2 og 3). Vent til strømmen til steady state før du henter målingene: visuelt inspisere høyhastighets kamerabilder for en jevn flyt.
    MERK: Forholdet er avgjørende i å skaffe en lineær hastighetsprofil i blodet lag.
  4. Visualisere RBC ved hjelp av høyhastighetskamera. Koble kameraet til en datamaskin for å kontrollere, registrere og lagre bilder av væskestrømmen. Når de to væskestrømmer steady state, starte opptak.
    1. Skaffe flere bilder for bedre behandlingsresultater. Bestem et optimalt kamera eksponeringstid for et klart bilde av aggregatene.
      MERK: Kameraet eksponeringstid for denne saken var 0,5 msek. Valget av tidsintervallet mellom hver ramme er basert på kameraet bildefrekvens og strømningshastigheten i than microchannel. Tiden mellom hver ramme behandles i denne fremgangsmåten var 60 msek. Derfor et kamera kan ta opp 18 bilder per sekund er tilstrekkelig.
      MERK: Unngå blod bosetting i røret og sprøyten, som kan føre til feilmålinger.
  5. Ved hjelp av bildebehandlingsteknikker (en MATLAB program i dette tilfellet) for å forbedre den bildekvalitet, detektere aggregatene i hver av de bilder basert på bildeelementintensitetene (illustrert i figur 4) som følger:
    1. Forbedre bildene kontrast bruker histogrammet equalizer metoden for å få en bedre bildekvalitet for hver ramme.
    2. Konvertere gråtonebilder til binære bilder. For dette formål, sette en terskelverdi, som strekker seg fra 0 til 1, som styrer omdanningen av hver piksel. Enhver piksel i bildet under grenseverdien vil bli oppdaget som en svart piksel, mens pikslene med verdier større enn terskelen vil bli oppdaget som hvite piksler.
    3. Fyllhull (hvis tilstede og det er nødvendig) som svarer til hullene i løpet av ett aggregat for bedre resultater.
    4. Detect cellene ved å bestemme nabo hvite piksler i det binære bildet, slik at tilgrensende celler er forbundet som aggregater.
    5. Merke de ulike aggregatene oppdaget og konvertere den binære bildet inn i en rød-grønn-blå (RGB) bildet for bedre visualisering. Kombiner de originale rammer med hver av de tilsvarende behandlede bilder for å verifisere effektiviteten av bildebehandlingsteknikk og sikre at alle cellene er tatt hensyn til, som vist i figur 5. Utfør trinn 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 og 4.5.5 for alle bilder tatt.
    6. Beregne arealet av hvert aggregat detektert i rammen basert på antallet av detekterte piksler. Basert på objektivforstørrelse brukt, beregne omregningsfaktor, ved hjelp av en kalibrerings reticule, og konvertere resultatene til mikrometer to. Gjennomsnitt de samlede formater som kan registreres i hverramme og deretter gjennomsnitt resultatene for alle rammer for å få den gjennomsnittlige samlede størrelsen for hvert opptak av RBC-suspensjoner.
    7. Beregne arealet av en RBC for å bestemme en estimert representativt antall RBCs innenfor hver detektert aggregat. Ved hjelp av disse resultater, beregne fordelingen av prosentandelen av RBC i hvert aggregat som en funksjon av de samlede størrelser (representert ved det anslåtte antall celler i hver aggregat), som vist i figur 6.
      MERK: For å måle RBC aggregater, kan ImageJ programvare brukes (i stedet for MATLAB) til å utføre de samme oppgavene på hver ramme.

5. Fluid Velocity og skjærhastighet Målinger

Bestemme fluidhastighet og følgelig skjærhastighet ved hjelp av en μPIV system.

  1. Når dataene er anskaffet ved hjelp av høyhastighetskamera, bytte til dobbel pulset kameraet brukes for μPIV system. Bruk en bildebehandlingsprogrammer for bilde actakelse av strømningen og bildeprosessering for å bestemme hastighetsfeltet.
  2. Ta alle forholdsregler er nødvendig, avhengig av klasse av laser, før du slår på laser. Deretter slår du på systemet, kamera og laser.
  3. Kalibrere kameraet basert på objektivforstørrelse brukt. For dette formålet, kan du bruke en mikro på 10 mikrometer presisjon under mikroskopet og angi størrelsen på en piksel i bildet.
  4. Start laser og visualisere partiklene i begge fluider. Finn midten planet av microchannel ved å fokusere på de raskeste partiklene i flyten (dvs. de raskest partikler bør være den lyseste).
  5. Sett dt (tidsintervallet mellom to etterfølgende rammer) for å sikre riktig forskyvning av partikkelen. De raskeste partikler skal flytte om 5 til 10 piksler mellom begge bildene.
  6. Start opptak flyten. Sett programvare for å skaffe 100 par av bildene, 5 ms fra hverandre. Utfør trinn 5.4, 5.5 og 5.6 for alle difskjellige RBC-suspensjoner og for ulike skjærhastigheter.
    MERK: Flere detaljer om metodikken er gitt i studiet av Pitts og Fenech 20.
  7. Bearbeide opptakene ervervet ved hjelp krysskorrelasjonen metoden med bildebehandlingsprogrammer.
    NB: Denne består av discretizing paret av bilder til små vinduer med forutbestemt størrelse (basert på fluidstrømning, og tidsintervallet er valgt av brukeren) kalt korrelasjonsvinduer, og som følge av forskyvning av partiklene i hvert vindu.
    1. Først avgjøre om bildene ervervet krever pre-behandling (inkludert bakgrunnen subtraksjon, "base-klipping" 21 eller bilde overlappende 22,23) for bedre databehandling.
    2. Deretter velger størrelse korrelasjonsvinduet og form, samt av prosentandelen av overlappende bilder. En detaljert studie ble utført av Pitts et al. 24 for å bestemme optimale parametere og bilde pre-behandling teknikker for blodflyt i forskjellige kanalkonfigurasjoner. Uttrykke resultatene som en gjennomsnittlig hastighet feltet beregnes fra 100 bildeparene og feil Root Mean Square (RMS) i hastighet.
  8. Trekke ut et hastighetsprofil ved kanalutløpet, fra de behandlede data som er vist i figur 7. For en bedre profil, gjennomsnittlig hastighetsfeltet på plass.
    MERK: Stolpene som utgjør hastighetsprofilen tilsvarer korrelasjonsvindusstørrelsen valgt i forhold til kanalbredden. RMS-feil i hastighet er også vist i figur 7, som representerer feilen i den eksperimentelle hastighetsestimering.
  9. Slå av laseren når alle målinger og behandling utføres ,. Stenge ned alle komponentene i systemet: programvare, kameraer, flytte scenen, datamaskiner og laser.
  10. For å beregne skjærhastighet, først oppdage og anslå blod tykkelse i microchannel basert på høy hastighet kameraet opptaket. For dette formålet, gjennomsnittlig altrammene i den spesifikke opptak for å få et bakgrunnsbilde av videoen. Avgrense blodet lag (som vist i figur 8 for RBC-suspensjoner som strømmer på 10 ul / time når den suspenderes i 5%, 10% og 15% hematokrit). Innhent hastighetsverdien for den tilsvarende blod lagtykkelse og beregne skjærhastighet ved å dividere hastigheten verdien av blodet lagtykkelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på to-fluidstrømning i den doble Y-microchannel er vist i figur 2 for humane RBC-er opphengt på 5%, 10% og 15% hematokritt, og strømmer på 10 mL / t. Figur 3 viser forskjellen i samlede størrelse når strømningen i kanalen reduseres fra 10 pl / time til 5 pl / t for en hematocrit på 10%. Dette gir en kvalitativ forestilling om størrelsen på aggregatene ved å variere hematokritt, og skjærhastigheten. Figur 5 følger forskyvningen av fire humane RBC-aggregater, for tre påfølgende rammer, som gir et kvalitativt mål på kameraets bildefrekvens som kreves og kvalitativ oppfatningen av aggregater innenfor hver ramme. I figur 5, blir de små aggregater (med 8 eller mindre estimerte RBC) er vist i blått, mens mellom aggregater (som strekker seg 9-30 beregnet RBCs) og store aggregater (større enn 30 beregnet RBC) er vist i henholdsvis grønt og rødt.

figur 7, hvor de røde, blå og grønne kurver representerer hastighetsprofilene for de røde blodceller suspendert ved 5%, 10% og 15% hematokritt hhv. RMS-feil i hastighets, vises også i figur 7 for hver RBC-suspensjon, er forholdsvis liten i forhold til hastighetsverdier, noe som indikerer at presisjonen av hastighetsmålinger, og følgelig skjærhastigheter. Grensesnitt stedene er betegnet som "E" og er vist som heltrukne linjer på samme figur.

De tilsvarende skjærhastigheter for de forskjellige RBC-suspensjoner (basert på hastighetsprofiler og blodsjikttykkelsen) er vist i tabell 1. De gjennomsnittlige samlede størrelse bestemt for hver av RBC-suspensjoner, basert på bildeprosesseringsmetode for å finne område av RBC aggregatene, er vist i figur 9, som en funksjonsion av den tilsvarende skjærhastighet. Et eksempel på fordeling av prosentandelen av RBCs innen hvert aggregat er vist i figur 6. De samlede størrelser er representert som et estimert antall RBC i aggregatene.

Figur 1
Figur 1. Doble Y-microchannel konfigurasjon og oppføring væsker. Blod inn i første filial på Q = 2 mL / t mens PBS entrer den andre grenen på Q = 8 mL / t. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Humant RBC-suspensjonen ved forskjellige hematokrit. Figuren representerer fanget bilde i humane RBC-suspensjoner som flyter på Q = 10 ul / time ved (A) 5% (B)10% og (C) 15% hematokritt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Humant RBC-suspensjonen ved forskjellige strømningshastigheter. Figuren representerer fanget bilde i humane røde blodceller suspendert ved 10% hematokrit H strømmer (A) Q = 10 mL / time og (B) Q = 5 ul / t. Trykk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Flytskjema av bildebehandlingsprogrammet som brukes for tilslag deteksjon. Trinnene vist beskriver den grunnleggende metode som brukes. Kvaliteten av bildet er forbedret for å være c onverted til et binært bilde. Aggregatene blir oppdaget og merket i henhold til deres størrelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. RGB-fargestoffer og netto bevegelse av flere humane RBC aggregater for tre påfølgende rammer. Figuren viser netto bevegelse av fire aggregater detektert i tre påfølgende rammer ved (A) t = 0 msek, (B) t = 60 msek og (C) t = 120 ms. De store aggregater (> 30 beregnet RBC), middels tilslag (9-30 estimerte RBC) og små aggregater (<8 beregnet RBC) er vist i henholdsvis rødt, grønt og blått. Hvert av aggregatene detekterte er merket med en svart sirkel._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. RBC samlet størrelsesfordeling for 10% H RBC-suspensjon for ulike strømningsrater. Aggregat størrelsesfordeling for blodprøver suspendert ved 10% H, flyter på Q = 10 og 5 mL / t. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 7
Figur 7. hastighetsprofil for sammenligning forskjellige hematokrit. Er de hastighetsprofiler er vist for RBC-er i plasma suspendert i 5% H (rød), 10% H (blå), 15% H (grønn), og simulering 19 (heltrukket linje) for 120 x 60 um dobbelt Y-microchannel med Q = 10 mL / time. Grensesnittet posisjon er betegnet med E foreksperimenter. De tilsvarende RMS feil av de ulike hastighetsprofiler vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Bildet bakgrunnen for de ulike RBC-suspensjoner og avgrensning av blodet tykkelse. Figuren viser avgrensningen av blod tykkelse av RBC-suspensjoner strømmer på 10 mL / t suspendert på (A) 5%, (B ) 10% og (C) 15% H. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figure ni. Gjennomsnittlig aggregatstørrelser som en funksjon av de tilsvarende skjærhastigheter. Resultatene er oppnådd for de ulike RBC-suspensjoner strømmer på Q = 10 mL / time ved 5% (A), 10% (B) og 15% H (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hematokrit Strømningshastighet (ul / hr) Skjærhastighet (sek -1)
5% 10 11.02
5% 5 5,36
10% 10 8.17
10% 5 4,47
15% 10 7,41
15% 5 2.51

Tabell 1. skjærrate verdier for ulike blodstrøm tilfeller. Er skjærhastigheten verdiene oppnådd ved å bruke μPIV data og bildebehandling resultater for ulike RBC-suspensjoner med 5%, 10% og 15% H, flyter på Q = 10 mL / t og Q = 5 ul / time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved hjelp av foreliggende metode, er det mulig å analysere kvalitativt og kvantitativt RBC aggregater under forskjellige strømningsforhold og hematocrits. For vellykket testing og samlet deteksjon, er det avgjørende å finne riktig hastighetsforholdet mellom de to væskene på microchannel oppføring. Dette forhold er meget viktig for å oppnå et optimalt blod lagtykkelse hvor hastighetsprofilen er kvasi-lineær 19.

En annen viktig faktor for vellykket testing er en god bildekvalitet. Faktisk, siden metoden er basert på bildebehandlingen, er det svært viktig å ha en kontrast mellom bildet bakgrunnen (væsken inne i kanalen), og partiklene som skal påvises. Her, som vist på figurene 2 og 3, idet partiklene synes å være mørkere enn bakgrunnen, som hjelper i aggregatet deteksjon. Den viktigste parameter for å vurdere for bildebehandling teknikken er threshold verdi. Derfor, basert på kontrasten oppnådde det er viktig å velge den optimale terskelverdi, hvor alle aggregatene vil bli tatt i betraktning, slik som vist i figur 5. Den foreliggende bildesegmentering, anvendt i denne studien, er mye brukt for celle detektering og telling 25- 27. Hvis kvaliteten på bildet ikke er som ønsket, og en global terskelverdi ikke er hensiktsmessig, kan man bruke en annen algoritme for å bestemme den optimale terskelverdi, for eksempel Otsu metode 28 eller en adaptiv terskling metode (discretizing bildet og å skaffe en lokal terskelverdi for hver diskretisert vindu).

En annen faktor å ta hensyn til er skalafaktoren for en riktig konvertering fra piksler til um.

Bruker riktig omregningsfaktor, kan man bestemme diameteren og tykkelsen på ett RBC som vil tjene til å avgjøre den samlede størrelsesfordeling (basert på estimert number av RBC i hvert aggregat). Avhengig av retningen av aggregatene, riktig beregne arealet på en RBC (frontal eller fra siden). Som nevnt i § 4 (trinn 4.4.1), er det viktig å finne den riktige kameraet eksponeringstid og bildefrekvensen for å sikre at de dynamiske egenskapene til aggregatene er fanget mellom hver påfølgende ramme. Denne verdi er basert på strømningshastigheten brukt ved ervervelsen av målingene. Flere andre faktorer må tas i betraktning når anskaffe resultatene med μPIV system og er omtalt tydelig i studiet av Pitts og Fenech 20.

Metodikken ble testet med hell på flere RBC-suspensjoner strømmer på ulike hematokrit. Imidlertid, på grunn av begrensningen av bildebehandling teknikk og mangel på kontrast mellom bilde og bakgrunn aggregatene, er det vanskelig å detektere RBC aggregater for høyere hematocrits (fra 20% til 45%). Faktisk som nevnttidligere, er bildekvaliteten avgjørende for denne metoden.

Ved hjelp av denne protokollen, kan de RBC aggregerte størrelser måles i et kontrollert microfluidic enhet, og dermed er det mulig å få informasjon om RBC aggregering dynamisk i mikrosirkulasjonen og få de RBC aggregerte størrelser for en rekke fysiologiske skjærhastigheter. Det er også mulig å utfylle numeriske og eksperimentelle studier av blod reologi og forholde de aggregerte størrelser og atferd til kliniske og patologiske studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada. Microfabrication ble utført med støtte fra McGill nanoverktøy Microfab anlegget ved McGill University og Institutt for elektronikk ved Carleton University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
  2. Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
  3. Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
  4. Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
  5. Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
  6. Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
  7. Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
  8. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
  9. Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
  10. Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
  11. Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
  12. Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
  13. Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
  14. Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
  15. Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
  16. Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
  17. Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
  18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
  19. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
  20. Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
  21. Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
  22. Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
  23. Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
  24. Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
  25. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
  26. Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
  27. Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
  28. Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).

Tags

Bioteknologi Røde blodceller aggregering mikrosirkulasjonen MicroFluidics micro partikkel bilde velocimetry blod reologi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

Kontrollert mikrofluid Miljø for Dynamic Gransking av røde blodceller Aggregation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter