Abstract
عالية الجودة سرطان المبيض المصلي (HGSC)، وسبب الانبثاث البريتوني واسعة النطاق، لا يزال لديهم التكهن سيئة للغاية؛ أقل من 30٪ من النساء على قيد الحياة بعد 5 سنوات من التشخيص. الثرب هو الموقع المفضل لتكوين ورم خبيث HGSC. وعلى الرغم من أهمية السريرية لهذا المكروية، ومساهمة من الثرب الأنسجة الدهنية لتطور سرطان المبيض لا تزال الكافي في. الدهنية ثربية غير عادي لأنه يحتوي على هياكل تعرف باسم البقع حليبي، والتي تتألف من B، T، والخلايا القاتلة الطبيعية، الضامة، والخلايا الاصلية المحيطة أعشاش كثيفة من الأوعية الدموية. البقع حليبي تلعب دورا رئيسيا في وظائف فيزيولوجية من الثرب، وهي مطلوبة من أجل التوازن البريتوني. لقد أثبتنا أن البقع حليبي أيضا تعزيز المبيض سرطان الاستعمار النقيلي من الدهنية البريتوني، خطوة رئيسية في تطوير الانبثاث البريتوني. نحن هنا وصف نهج ضعنا لتقييم وتحديد المواقع حليبي في نصيبitoneal الدهنية ودراسة مساهمة الوظيفية للخلية سرطانية في المبيض الاستعمار النقيلي من الأنسجة الثرب على حد سواء في الجسم الحي وخارج الحي. هذه الأساليب قابلة للتعميم على نماذج الماوس وخطوط الخلايا إضافي، مما يمكن دراسة المبيض تشكيل الانبثاث سرطان من توطين الأولي من الخلايا لهياكل بقعة حليبي لتطوير الانبثاث البريتوني واسعة النطاق.
Introduction
وخلافا لمعظم الأورام الصلبة، الانبثاث من الدرجة العالية سرطان المبيض المصلي (HGSC) تقتصر على التجويف البريتوني 1. وبالتالي، يمكن أن العلاجات البريتوني فعالة يحتمل أن تكون مراقبة أو استئصال HGSC. حاليا، وهو النهج العلاجي هو معيار cytoreduction الجراحية جنبا إلى جنب مع العلاج الكيميائي 1-3. للأسف، فإن الغالبية العظمى من المرضى تجربة وتستسلم لمضاعفات تكرار المرض. وتشير هذه الإحصاءات الكئيبة على الحاجة إلى تحسين فهم الاستعمار النقيلي، العملية التي الخلايا السرطانية توطين ل، والاستفادة، وتتكاثر داخل أنسجة المضيف لتشكيل النقائل 2.
الثرب هو موقع أوائل فضل من HGSC ورم خبيث 4-7. خلافا لغيرها الدهنية البريتوني، الأنسجة الدهنية الثرب تحتوي هياكل المناعي غير العادية المعروفة باسم البقع حليبي، والتي تحتوي على B، T، والخلايا القاتلة الطبيعية والضامة، والتي تلعب دورا رئيسيا في homeos البريتونيtasis 8،9. بالإضافة إلى وظائفها الفسيولوجية، وجدنا أن البقع حليبي تلعب دورا نشطا في سرطان المبيض الاستعمار المنتشر 4. في المقايسات الانبثاث التجريبية، SKOV3ip.1، CaOV3، وHeyA8 (الإنسان) وID8 (الفئران، C57BL / 6) خلايا سرطان المبيض بسرعة موطن البقع حليبي، مما يشير إلى أن الخلايا تتجه نحو عاملا الكيميائي تفرز. ومن المثير للاهتمام، وسرطان الخلايا لا يستعمر الدهنية البريتوني تفتقر البقع حليبي (أي الغدد التناسلية والدهون الرحم) 4.
من أجل تحديد الآليات التي تنظم حليبي بقعة الاستعمار، قمنا الأمثل نماذج طعم أجنبي التي تمكن من استجواب الأحداث الخلوية والجزيئية على مدار الساعة من الاستعمار المنتشر 4. وهناك ميزة معينة من النهج الموصوفة هنا هو التركيز على بنية الأنسجة وظيفة، والتي تمكن المستخدمين لاختبار الفرضيات في متكاملة في الجسم الحي وخارج الحي نماذج مetastatic (4،10) الاستعمار. بمقارنة توطين الخلايا السرطانية ونمو في مستودعات الدهون البريتوني التي تحتوي على أي أو تفتقر إلى البقع حليبي، تمكن الباحثون من اختبار المساهمة النسبية (ق) من الخلايا الشحمية والخلايا داخل البقع حليبي إلى السكن والنمو التدريجي للخلايا سرطان المبيض في الأنسجة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم إيواء جميع الفئران وصيانتها والموت الرحيم وفقا ل(IACUC) المبادئ التوجيهية المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وتحت إشراف مركز جامعة الثروة الحيوانية شيكاغو.
1. الحيوانات إعداد الدراسات التجريبية
- تسمح الحيوانات حتى يتأقلم في السكن الجديد والبيئة، للتعافي من آثار الفسيولوجية المحتملة النقل والمناولة.
ملاحظة: هذه التقنية التالية تنطبق على جميع السلالات المتاحة تجاريا من الفئران. عدد الحيوانات لاستخدامها في تجربة تعتمد على تصميم الدراسة وينبغي أن يتم التشاور مع من إحصائي.
2. تحديد وعزل البريتوني الدهون مستودعات.
- الموت ببطء الحيوانات عبر CO 2 جرعة زائدة وطريقة المادية الثانوي لتأكيد الوفاة.
- كما حصاد مستودعات الدهون البريتوني يشكل استئصال الأعضاء الداخلية (طريقة الثانوي)، يا أماهكه شق خط الوسط على مقربة من الحليمات الإربي من خلال الجدار البريتوني لفضح الأعضاء الداخلية (الشكل 1A).
- لالثرب الدهون (OM)، فضح مجمع ثربية / البنكرياس من خلال توسيع الطحال من التجويف البريتوني مع ملقط (الشكل 1C). الإفراج الثرب من البنكرياس والطحال وتقليم عن كثب كافة الاتصالات الأنسجة. تأكد من أن أي نسيج البنكرياس المتبقية يتم استئصاله 4.
- لفات الغدد التناسلية (GF)، استخدم ملقط لرفع الدهون الغدد التناسلية المحيطة المبيضين والمكوس عن طريق قطع الاتصالات الأنسجة (الشكل 1A ر righ العلوي) 4.
- لالرحم الدهون (UF)، استخدام ملقط لرفع الدهون الرحم المحيطة قرون الرحم والمكوس عن طريق قطع الاتصالات الأنسجة (الشكل 1A أسفل اليمين) 4.
- لالمساريقي الدهون (MF)، وقطع تقاطع بين الأمعاء الدقيقة والبواب. استخدام ملقط لقبضة بحزم نهاية خالية منالأمعاء الدقيقة، وببطء "قشر" بعيدا عن الدهون المساريقي. الافراج عن الدهون المساريقي من جذورها المساريقي باستخدام مقص تشريح (الشكل 1A اليسرى السفلى) 4.
- لSplenoportal الدهون (SF)، ورفع النهاية البعيدة من الطحال باستخدام ملقط لفضح الفرقة الدهنية رقيقة من النسيج الذي يربط بين نقير الطحال في البنكرياس. استئصال الدهون splenoportal عن طريق الإفراج عن أول مرة من البنكرياس، وبعد ذلك بعناية تشريح أنه من الطحال (الشكل 1B) 4.
3. التبانة بقعة تحديد عن طريق تلطيخ بالغيمزا
- المكوس ثروب (راجع الخطوة 2.3) من C57BL / 6 الفئران وإصلاح في 5٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في 4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة (O / N).
- لالبارافين تضمين الأنسجة ثابتة، واختيار القالب الذي يتناسب مع حجم الأنسجة. صب البارافين المنصهر من الخزان البارافين لملء القالب. فتح كاسيت واستخدام الحارة لمركز دراسات السياسات الأوروبية، ونقل الأنسجة في القالب.
- توجيه بعناية الأنسجة أثناء البارافين التضمين لإنتاج المقاطع الطولية. وضع الكاسيت النسيج المسمى على صب والصحافة ثابتا في مكانه. السماح القالب لتبرد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- قطع الأجزاء المتسلسلة (4 ميكرون سميكة) من البارافين الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) كتلة الأنسجة. ضع شريحة precleaned تحت أبواب مثل الشريط من نسيج يأتي قبالة كتلة البارافين.
- متسلسل قسم الثرب كله؛ جمع وصمة عار كل قسم ثالث لبالغيمزا صمة عار (راجع 3.6). السماح للشريحة زجاجية مع أقسام للهواء الجاف، ويفضل O / N في RT. الشرائح المجففة جاهزة للتثبيت. وصمة عار على القسم الأول لالهيماتوكسيلين ويوزين للمقارنات على الشرائح بالغيمزا الملون.
- Deparaffinize الشرائح من قبل اثنين من متتابعة حضانات 5 دقائق في الزايلينات. ترطيب الشرائح من قبل اثنين من حضانات متتابعة في ما يلي: الإيثانول بنسبة 100٪، و 95٪ من الإيثانول، وأخيرا الاستفادة واثالثا.
- اتخاذ الاحتياطات الكافية لتجنب الشرائح من التجفيف. تنفيذ جميع الخطوات في RT.
- تماما تزج الشرائح في جرة Coplin تحتوي على 5٪ بالغيمزا الحل (ث / ت أعدت في مياه الحنفية)، واحتضان لمدة 4 دقائق على RT. شطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة 60 ثانية، والهواء الجاف وجبل مع ساترة باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة.
- صورة الشرائح ملطخة باستخدام الماسح الضوئي الشريحة بأكملها وعملية مع برنامج الشركة المصنعة. تحديد حجم البقعة حليبي في الأقسام الثرب بالغيمزا الملطخة باستخدام برنامج يماغيج 4.
4. الانتشار وإعداد خلايا سرطان المبيض في الجسم الحي وخارج الحي الدراسات
- قبل الدافئة 15 مل من نمو الخلايا المتوسطة إلى 37 درجة مئوية في حمام الحرارة. إعداد الأنسجة بحجم مناسب قارورة الثقافة (على سبيل المثال، 75 سم مساحتها 2 السطح) من خلال وضع العلامات مع اسم خط الخلية، رقم المرور، وتاريخ والشخص الذي أعد الأوراق المالية المجمدة، وتاريخوالشخص الذي يذوب / طلاء الخلايا.
ملاحظة: في الدراسات الانبثاث هذه المعلومات التفصيلية هي الحاسمة، موعدا لتجميد أسفل وعدد مرور يمكن أن تؤثر على النمط الظاهري النقيلي. - باستخدام بيئة معقمة من غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية، ماصة 10 مل من المتوسط في قارورة الثقافة T-75. إزالة قارورة من الخلايا من نظام النيتروجين السائل وتحقق التسمية لتأكيد نوع من الخلايا. ذوبان الجليد قارورة واحدة فقط من الخلايا في وقت واحد من قبل ارتفاع درجات الحرارة في 37 درجة مئوية حمام الحرارة.
- باستخدام تقنية معقمة، ماصة 1X10 6 إذابة الخلايا في قارورة الثقافة. ضع قارورة في الحاضنة للسماح للخلايا لنعلق. صخرة بلطف القارورة ذهابا وإيابا لتشكيل تعليق خلية موحد.
- ضع قارورة في الأنسجة حاضنة الثقافة والمحافظة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 البيئة. يسمح للخلايا التمسك O / N.
- وسائل الاعلام نضح، ويحل مع وسائط النمو قبل تحسنت جديدة. ضع قارورة في الحاضنة وجميعخلايا آه لتنمو. مراقبة نمو الخلايا يوميا عن طريق التفتيش البصري كل 2-3 أيام باستخدام مجهر مقلوب. استخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية لخلايا مرور عند بلوغه 70-80٪ التقاء.
ملاحظة: لفحوصات التجريبية حصاد الخلايا عند 70٪ التقاء للتأكد من أن الخلايا تتكاثر بنشاط. - نضح مستنبت وشطف مع 10 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS). نضح PBS وإضافة 0.25٪ التربسين / EDTA (2-3 مل ل75 سم مساحة 2)، واحتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تأكيد بصريا أن الخلايا قد فصل وإضافة حجم مساو من متوسط النمو، وماصة بلطف خلايا صعودا وهبوطا للحصول على تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن متوسط النمو يحتوي المصل لأنه يثبط نشاط التربسين. إعداد ما لا يقل عن 2- 4 أضعاف خلايا أكثر من العدد المطلوب لتجربة معينة للتعويض عن فقدان الخلايا خلال الخطوات اللاحقة - تحديد النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة فيتعليق عبر التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة باستخدام عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي.
ملاحظة: هنا، فقط استخدام الاستعدادات الخلية التي ≥ 96٪ من خلايا قابلة للتطبيق. - نقل تعليق خلية من القارورة إلى أنبوب مخروطي 50 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي 5 دقائق في 1100 x ج في 4 درجة مئوية.
- نضح طاف و resuspend الخلية بيليه في برنامج تلفزيوني إلى تركيز الخلايا 2x10 6 لكل مل.
5. حقن داخل الصفاق من الخلايا
ملاحظة: في تجاربنا، يتم التعامل مع الفئران في تدفق الهواء الصفحي أو الوزراء للسلامة الأحيائية داخل منشأة حاجز لدينا من أجل الحد من خطر التعرض للمرض، من أجل إثبات هذه التقنية بشكل واضح، وأجريت الإجراءات في شريط الفيديو المرافق في مختبر معتمد للعمل الحيوانية. هذا أسلوب معين لا يتطلب الحيوانات لتكون تحت التخدير. تحت البروتوكولات المعتمدة، تنفيذ هذا TECHNIQرق في الحيوانات الحية. استخدام سلالات من الفئران المناسبة لهذه الدراسة. على سبيل المثال: استخدام المناعة، الفئران عارية athymic لدراسة الإنسان خلايا سرطان المبيض (SKOV3ip.1، وHeyA8) الاستعمار. استخدام مناعيا C57BL / 6 الفئران لدراسة الماوس خلايا سرطان المبيض (ID8) الاستعمار.
- تحميل 500 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة في حقنة وضعت في العقيمة توج 25 G الإبرة. وهذا يقلل قص الخلية قبل الحقن.
- اختيار الماوس من قبل القفا من الرقبة وعقد ذيل باستخدام النخيل والسبابة وإصلاح الساق الخلفية اليسرى بين الحلبة والاصبع الصغير (عند ضبط النفس والفأر مع اليد اليسرى).
ملاحظة: لتفادي أعضاء البطن المؤلم، وكبح جماح الماوس بشكل جيد بحيث لا يمكن أن تتحرك خلال الحقن. - تخيل خط عبر البطن ما فوق الركبتين، وتحديد نقطة على الجانب الأيمن للحيوان وعلى مقربة من خط الوسط. نقطة الدخول هي الجمجمة لوسطي قليلامن الحلمة الماضية.
ملاحظة: إدخال الإبرة على الجانب الأيمن الماوس، يتجنب الأعور ويقلل من خطر ثقب الأمعاء 11. - ادخال الإبرة في المنطقة الجانبية السفلية من البطن الفئران على عمق حوالي 0.5 سم. سحب على المكبس للتأكد من أن الإبرة لم يتغلغل أحد الأوعية الدموية أو أجهزة البريتوني أخرى.
- إذا كان يستنشق أي سائل التخلص من حقنة (والعينة) 11. A نضح الأخضر والبني أو الأصفر يشير اختراق الإبرة في الأمعاء أو المثانة، على التوالي.
- حقن العينة باستخدام بطيئة، وضغط ثابت. سحب الإبرة والعودة الماوس لقفصه. لا خلاصة حقنة قبل التخلص منها في حاوية الأدوات الحادة.
- الفئران التضحية عبر CO 2 الخنق واستئصال الأعضاء الحيوية في نقطة زمنية محددة حقن آخر.
6. درب التبانة بقعة الاستعمار في الجسم الحي
- Quantitaنشوئها توطين الخلايا السرطانية إلى بقع حليبي باستخدام التدفق الخلوي
- عزل مخازن الدهون البريتوني من الفئران (كما هو موضح في الخطوة 2،3-2،7) حقن الموسومة fluorescently الخلايا السرطانية والأنسجة مكان المباشرة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- لهذا الأسلوب معينة، الوزن مباراة كل الأنسجة الدهنية لالثرب. الأنسجة نقل لفصل 5 مل أنابيب تحتوي على 1.5 مل من مصل خالية DMEM و 0.1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري. الأنسجة تجمع تحصد من ثلاثة الفئران مستقلة لضمان عائد كاف من الخلايا للالتدفق الخلوي.
- أنسجة اللحم المفروم باستخدام مقص جراحي وإضافة 1.5 مل من مصل خالية DMEM تحتوي على 0.4٪ (ث / ت) كولاجيناز أولا احتضان تعليق الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع خلط التناوب.
- وكخطوة اختيارية، مما تنأى الأنسجة عن طريق المضغ. في هذه الحالة، نقل تعليق الأنسجة كولاجيناز إلى كيس microstomacher، عجن لمدة 10 دقيقة على الأقل، وتناوب التوجهمن أكياس بعد 5 دقائق.
- مرشح العينات من خلال مرشح شبكة من النايلون (60 ميكرون المسام) لإزالة الحطام أكبر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل جزء طاف.
- resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني جنبا إلى جنب مع 900 ميكرولتر من ACK العازلة تحلل واحتضانها في RT لمدة 1 دقيقة. خلايا الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
- resuspend الكرية الخلية في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. تصفية العينات خلال 60 ميكرومتر شبكة النايلون المسام لضمان تعليق خلية واحدة. شطف تصفية مع 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- Quantitate عدد الخلايا الموسومة fluorescently في السكان باستخدام تدفق عداد الكريات مجهزة ليزر الأصفر والأخضر 561 نانومتر، ونانومتر 585/15 نانومتر ممر الموجة مرشح. تعيين بوابة للخلايا tdTomato إيجابي على أساس تحليل الخلايا الأبوية و / أو ضوابط السلبية المناسبة 4.
- الكميات الانبثاث والمجهري
- عند نقطة النهاية التجريبية المطلوبة (ق)، وعزل، وعلى الفور وضع الأنسجة في وسائل الإعلام التثبيت المناسب. إصلاح عينات أكبر، مثل الغدد التناسلية سليمة والرحم، ومستودعات الدهون المساريقي في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية. إصلاح عينات أصغر (ثربي والدهون splenoportal، وكذلك حكمه أنسجة الرحم والدهون المساريقي) في 5٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في 4 درجة مئوية لمدة 2-16 ساعة.
- بدلا من ذلك، والمفاجئة تجميد الأنسجة عن طريق وضعها في وسط تجميد مثل أكتوبر وانخفاض في كمية مناسبة من النيتروجين السائل.
- نقل ثابتة الأنسجة إلى 70٪ من الإيثانول وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التضمين في البارافين. تضمين والأنسجة العملية كما هو موضح في 3.2 و 3.3.
- استخدام القسم H & E الملون لتقييم الأنسجة لوجود أو عدم وجود النقائل المجهرية (أي مجموعات من 50 خلية). تأكيد ركان وجود النقائل المجهرية بطريقة الثانوية مثل وصمة عار IHC لcytokeratin 18/08 للكشف عن خلايا سرطان المبيض.
- عند نقطة النهاية التجريبية المطلوبة (ق)، وعزل، وعلى الفور وضع الأنسجة في وسائل الإعلام التثبيت المناسب. إصلاح عينات أكبر، مثل الغدد التناسلية سليمة والرحم، ومستودعات الدهون المساريقي في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية. إصلاح عينات أصغر (ثربي والدهون splenoportal، وكذلك حكمه أنسجة الرحم والدهون المساريقي) في 5٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في 4 درجة مئوية لمدة 2-16 ساعة.
7. درب التبانة بقعة الاستعمار فيفو السابقين
- تهيئة الظروف الثقافة الأساسية خارج الحي الجهاز ثربية
- وضع كل الثرب إلى واحد إدراج لوحة الثقافة ومكان داخل بئر واحدة من اثني عشر بشكل جيد لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 500 ميكرولتر من بورصة دبي للطاقة وسائل الإعلام / F12 تحتوي على 20٪ FCS. الحفاظ على الثقافات الجهاز عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ بيئة ل24 إلى 48 ساعة و / أو نقاط زمنية إضافية. استخدام ثلاثة ثروب المستقلة (عينات من ثلاث نسخ) لكل حالة (على سبيل المثال، نوع الوسائط / نقطة زمنية).
- لتأكيد سلامة الأنسجة في النهاية التجريبية، إصلاح وعينات العملية كما هو موضح في الخطوة 3. عد الاصحاء الخلايا الشحمية الميتة على H & E أقسام يمكن تقييم سلامة الأنسجة. ما لا يقل عن 120 ~ خلايا منمطلوب العينات البيولوجية 5 إلى صياغة مئوية من الأنسجة الحية الحالية 10.
- لقياس وظيفة الأنسجة، مكان ثروب (ن = 3) في آبار منفصلة من 24 لوحة جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من بورصة دبي للطاقة وسائل الإعلام / F12 مع 20٪ FCS. السماح ثروب لحالة وسائل الإعلام في 37 ° C في CO 2 5٪ بيئة لمدة 24 ساعة، ثم قم بإزالة 250 ميكرولتر للاستخدام في IL-6 ELISA مقايسة 10.
- فيفو السابقين ثقافة مشتركة من الثرب الفأر مع خلايا SKOV3ip.1-GFP
- تنمو وإعداد الخلايا الموسومة fluorescently كما هو موضح في قسم 4 و resuspend بتركيز 2 × 10 6 خلايا لكل مل.
- تطبيق ~ 6 ميكرولتر من لاصق الأنسجة لغشاء إدراج الثقافة والسماح لها الهواء الجاف. غسل غشاء مرتين مع الماء المعقم لإزالة أية مواد لاصقة المفرط. الهواء الجاف الأغشية تحت غطاء الصفحي.
- استئصال بعناية ثروب وإرفاقه memb المغلفة لاصقةRANE باستخدام ملقط معقم. تسمح الأنسجة التمسك الغشاء لمدة 1 دقيقة قبل إضافة وسائل الإعلام. إضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية على رأس كل الثرب في كل إدراج الثقافة. ملء المنطقة المحيطة غرفة transwell مع 2.5 مل من بورصة دبي للطاقة / F-12 10.
- احتضان ثروب مع تعليق خلية لمدة 6 ساعات في 37 ° C في CO 2 5٪ بيئة. إزالة بعناية ويغسل ثروب مع ~ 10 مل من برنامج تلفزيوني. تصور الفلورسنت بؤر الخلايا السرطانية باستخدام نظام ملائم التصوير الفلورسنت 10.
- عزل مخازن الدهون البريتوني من الفئران (كما هو موضح في الخطوة 2،3-2،7) حقن الموسومة fluorescently الخلايا السرطانية والأنسجة مكان المباشرة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد ونسيجية فحص البريتوني الدهون مستودعات
تشريح تشريحي الإجمالي يسمح بتحديد أربعة من المصادر الأولية خمسة من الدهون البريتوني (الشكل 1A). تتحرك في اتجاه عقارب الساعة من مركز أعلى هي: الثرب (OM، ورد) تقع على المعدة والطحال، والدهون الغدد التناسلية (GF) المحيطة المبيض الأيسر (اوف)، والدهون الرحم (UF) تعلق على قرون الرحم (اه) ومساريق (MY) تعلق على الأمعاء الدقيقة (سي). يشار إلى المبيض (اوف)، قرن الرحم (اه)، والأمعاء الدقيقة (سي) كنقاط مرجعية. الدهون splenoportal (SP) يحيط الشريان الطحال ويربط نقير الطحال إلى الشريان الزلاقي (الشكل 1B). وأخيرا، يتم إرفاق الثرب إلى المعدة والبنكرياس (الشكل 1C). ويظهر الهيكل الإجمالي والحجم النسبي لهذه الأنسجة في الشكل 1D. الفحص النسيجي من الالأنسجة ه تبين أن splenoportal والدهون ثربية يحتوي على حليبي بقعة [MS] هياكل في محيط الأنسجة، وتحيط بها الخلايا الشحمية [A]. الرحم، الغدد التناسلية، والدهون المساريقي لا (الشكل 1E).
تحديد بقعة حليبي باستخدام بالغيمزا تلطيخ
لتمكين المقارنة بين محتوى بقعة حليبي الشامل بين سلالات مختلفة الماوس، وحجم البقعة حليبي ومنطقة موجودة في ثروب فرد كان quantitated باستخدام أسلوب الرواية. كما هو موضح في الطرق، تم بناء "جبل كله الرقمية" من ثروب بواسطة تلطيخ كل القسم الثالث من الأنسجة في بالغيمزا حل 5٪ والتقاط الصور من الأنسجة الملون (الشكل 2A). تظهر بقع حليبي عن المناطق تلطيخ الأزرق الداكن (الشكل 2B). وأكد على هوية هذه المناطق على شكل بقع حليبي في مسلسل أقسام كل من H & E تلطيخ وIHC للخلايا إيجابية لCD45، وهو علامة لمفاوية المشتركة (
التقييم الكمي والنوعي للاستعمار سرطان الثرب
ووضعت تدفق أسلوب يستند الخلوي في ترتيب ل quantitate عدد الخلايا السرطانية موجودة في مستودعات الدهنية بعد الحقن داخل الصفاق. هذا البروتوكول هو مفيد خاصة لدراسة الخطوات الاستعمار في وقت مبكر من عملية النقيلي. على سبيل المثال، في الشكل 3A، تم إعداد الخلايا ID8-tdTomato وحقن داخل الصفاق إلى C57BL / 6 الفئران. في 7 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة)، تم حصاد الأجهزة الدهنية وفصلها إلى وحيدة الخلية تعليق كما هو موضح في طرق. عدد tdTomato مLLS كان كميا باستخدام التدفق الخلوي (3A الشكل، يسار). أظهر الثرب بزيادة ما يقرب من 12 أضعاف في عدد من الأحداث tdTomato إيجابية، نسبة إلى PBS- حقن الضوابط (الشكل 3A، يمين)، ولكن كانت هناك زيادة كبيرة في الاستعدادات خلية من الدهون الغدد التناسلية، والدهون الرحم، أو مساريق . وأظهر نهج نوعي تكميلي يستند IHC أيضا أنه بعد 7 أيام الملكية الفكرية حقن الخلايا SKOV3ip.1، وقد لوحظت الآفات الخلايا السرطانية مماثلة في كل من الدهون ثربية وsplenoportal (الشكل 3B). IHC لالبشري عموم cytokeratin (PAN-CK) يؤكد وجود الخلايا السرطانية داخل البقع حليبي. وأكد خصوصية IHC تلطيخ باستخدام عنصر تحكم مفتش للأجسام المضادة لعموم cytokeratin (الشكل 3B). تم تقييم ID8 الاستعمار سرطان المبيض مستودعات الدهون البريتوني باستخدام C57BL / 6 الفئران في 7 نقطة في البوصة. الآفات الخلايا السرطانية كبيرة في البقع حليبي كل من الثرب والدهون splenoportal خارجاصطف. وشوهدت مجموعات صغيرة من الخلايا السرطانية في بعض الأحيان في مستودعات الدهون الأخرى، كما هو موضح في أقحم لوحة. وهكذا، يمكن للمرء الوصول إلى كل العدد النسبي والمكان من الخلايا داخل نسيج معين.
فيفو مقايسة لدراسة الاستعمار سرطان المبيض البقع حليبي
من أجل معالجة أوجه القصور في ظروف في الجسم الحي مع الحفاظ على تكوين الأنسجة والهندسة المعمارية، ونحن الأمثل نهج فيفو السابقين لدراسة المبيض الاستعمار الخلايا السرطانية للأنسجة الثرب. الأنسجة الثرب كلها رفعه من الفئران بنجاح مثقف خارج الحي لدراسة التفاعل سرطان المبيض مع وجود بقع حليبي. وكانت المصنفة خلايا SKOV3ip.1-GFP على فيفو السابقين الأنسجة الثرب مثقف والحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. كانت خلايا الفلورسنت GFP إيجابية واضحة في بؤر سرية في كل من خارج الحي والحية (الشكل 4A). في إطار كل الظروف، والتحقق النسيجي باستخدام H & E تلطيخ أكد توطين الخلايا السرطانية إلى بقع حليبي (الشكل 4B). وصمة عار التأكيدي باستخدام cytokeratin وصمة عار على الخلايا السرطانية أظهرت وجود بؤر الخلايا السرطانية داخل البقع حليبي (الشكل 4C). تدل هذه البيانات على جدوى استخدام خارج الحي النهج للدراسات القائم على آلية لتكمل النتائج في الجسم الحي.
الشكل 1. المواقع والهياكل النسبية للمستودعات الدهنية البريتوني الرئيسية. (A) تشريح تشريحي الإجمالي تظهر الموقع النسبي أربعة من المصادر الأولية خمسة من الدهون البريتوني. الثرب (OM، ورد)، والدهون الغدد التناسلية (GF)، والدهون الرحم (UF)، مساريق(MY)، مبيض (اوف)، وتظهر قرون الرحم (اه)، والأمعاء الدقيقة (سي) (B) الدهون Splenoportal (SP؛ ورد). كشفها بواسطة رفع الطحال مع ملقط (C) والثرب الماوس يظهر تشريح. خالية من البنكرياس لتحسين التصور D: أحجام وهياكل الدهون البريتوني المستأصل النسبية. يظهر مساريق تعلق على جذر المساريقي. تقييم E. نسيجية من الدهون البريتوني لوجود بقع حليبي (A) الخلايا الشحمية، (MS) نقطة حليبي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. النهج القائم على بالغيمزا لقياس البقع حليبي في الأنسجة الثرب. (A)؛ صورة قسم من الثرب كله ملطخة بالغيمزا. مسلسل أقسام الأنسجة الثرب تقييمها من قبل: (B) تلطيخ بالغيمزا. يشار إلى البقع حليبي مع السهام السوداء (C) H & E تلطيخ؛ و، (D) IHC باستخدام مكافحة CD45 الأجسام المضادة للتعرف على الخلايا الليمفاوية داخل هيكل بقعة حليبي. شريط المقياس هو نفسه بالنسبة BD ويدل 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. خلايا سرطان المبيض استعمار تفضيلي الدهون البريتوني الذي يحتوي البقع حليبي. تحليل تدفق cytometric من الثرب (OM)، الرحم الدهون (UF)، والدهون الغدد التناسلية (GF)، ومساريق (MY) تحصد من الفئران في 7 نقطة في البوصة من ID8- خلايا tdTomato (يسار). وتعرض البياناتمع زيادة أضعاف تغيير الخلايا tdTomato-صالحهم بشكل ايجابي على الفئران PBS حقن (يمين). أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للمتوسط. ** يدل ف <0.01 مقارنة مع الضوابط PBS (B) فحص الأنسجة من قبل كل من الأنسجة القياسية ويظهر IHC الاستعمار مماثل من البقع حليبي في كل من الثرب والدهون splenoportal (بعد حقن الخلايا 1x10 6 SKOV3ip.1 في الفئران عارية). تم تقييم المقاطع التي كتبها H & E تلطيخ. وجود الظهارية وأكد (السرطان) الخلايا داخل الآفات من خلال الكشف IHC من cytokeratin باستخدام عموم cytokeratin (PAN-CK) الأجسام المضادة. IHC باستخدام نمط إسوي الأجسام المضادة مفتش لعموم cytokeratin تم استخدامه كجهاز تحكم عن تلطيخ خصوصية. شريط المقياس هو نفسه بالنسبة لجميع الصور ويدل 100 ميكرون (C) تقييم ID8 الاستعمار سرطان المبيض مستودعات الدهون البريتوني في C57BL / 6 الفئران في 7 نقطة في البوصة. يرجى النقرهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. خارج الحي استعمار خلايا سرطان المبيض إلى الثرب. الأعمدة تمثل مقارنة بين الظروف التجريبية الثلاث التي تبين ثروب السذاجة (يسار)، ثروب من الفئران 6 ساعات بعد الحقن الملكية الفكرية من 1 × 10 6 خلايا SKOV3ip.1 (في الوسط) وثروب مع SKOV3ip.1-GFP استعمرت تحت فيفو السابقين الشروط (يمين). ثروب السذاجة (فارغ)، المستعمر ثروب التي كتبها SKOV3ip.1-GFP من المجراة فحص (مرفق في الجسم الحي) أو ثروب مستعمرة من قبل SKOV3ip.1-GFP في السابق الظروف والثقافة الجسم الحي (مرفق المجراة سابقا). التصوير مضان من ثروب كامل لGFP يظهر نمط الاستعمار مماثل لكل من في الجسم الحي وخارج الحي المقايسات (A). H & E تلطيخ أقسام المسلسلوثروب من لوحة A يؤكد وجود الخلايا السرطانية مترجمة إلى البقع حليبي (B). Cytokeratin لخلايا سرطان المبيض بالتحقق من H & E تلطيخ (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطوير علاجات لاستهداف خلايا منتثرة يتطلب فهم الآلية الاستعمار المنتشر، فإن الخطوة الأولى الحاسمة في تطور مرض البريتوني. لمعالجة هذه القضايا ونحن التقرير النهج التي يمكن استخدامها لتبين كيف تكوين الأنسجة فريد الثرب والهندسة المعمارية تعزيز المبيض سرطان الاستعمار النقيلي. السمات المميزة لنهجنا هي: 1) التركيز على الأحداث في وقت مبكر في عملية الاستعمار. 2) مقارنة حليبي مستودعات تحتوي على الفور والدهنية ناقصة؛ 3) توفر تقنية استنساخه ل quantitate حجم بقعة حليبي في الأنسجة. 4) توفر مكملة في الجسم الحي وخارج الحي النهج لتقييم المبيض الاستعمار الخلايا السرطانية من الهياكل بقعة حليبي.
في هذه الدراسات أدركنا أن المحققين كثيرا ما يجهل مكان وجود الثرب الماوس وجود ليرة سوريةlenoportal الفرقة الدهون، والتي هي بمثابة المصدر الثاني للحليبي التي تحتوي على بقعة الدهون البريتوني. على الرغم من أن الأساليب المذكورة هنا تمكن دراسات من الخطوات في الاستعمار المنتشر، إلا أنها توفر "لقطات" من هذه العمليات، وليس تقييم الاستعمار في الوقت الحقيقي. إذا ما اتبعت بشكل مناسب، يجب البروتوكولات كما هو موضح تسفر عن نتائج استنساخه لمجموعة من المحققين. حاسمة لنجاح هذه التقنيات هي: 1) تحديد وتشريح خارج أنسجة معينة الدهنية البريتوني كما التلوث أنواع الأنسجة الأخرى سوف تحرف البيانات الكمية التي تم الحصول عليها من التدفق الخلوي. و2) تنفيذ سلالات مناسبة من الفئران المعدلة وراثيا للدراسة في السؤال. وتجدر الإشارة إلى أنه ينبغي تحديد المساق الوقت لخطوط الخلايا الفردية. تجريبيا لأنها تعتمد على مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك معدل انتشار، والوقت لاتخاذ الورم النقيلي وإمكانات.
بالإضافة إلى تشريح INTERActions من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض راسخة والمكروية من الثرب التي تعتبر مهمة لتكوين ورم خبيث، والتقنية الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم إمكانية الخبيثة من خطوط الخلايا المشتقة سريريا أن ألخص التعديلات الجزيئية في وقت مبكر من سرطان داخل الظهاري الأنبوبي المصلية في خمل قناة فالوب 12-17. على الرغم من أن الطريق لتطور الجزيئي لهذه الآفات في الظهور، وهناك حاجة في الدراسات المجراة لتحديد الأهمية البيولوجية من تغييرات محددة. مكملة في الجسم الحي وخارج الحي المقايسات يمكن استخدامها لتقييم خطوات محددة في الاستعمار النقيلي من الأنسجة الثرب من قبل هذه خطوط الخلايا نموذج السلائف استقاها معلومات من الدراسات قد يكون المفتاح لتوليد الفرضيات العلاجية وتصميم المزيد من الدراسات قبل السريرية.
الآليات التي تتحكم في تحديد الاستعمار المنتشر قد تمكن الوقايةأو السيطرة على تشكيل ورم خبيث. على سبيل المثال، النساء الذين هم في خطر متزايد للإصابة بسرطان المبيض 18-22 (أي شركات جينات BRCA1 أو BRCA2 الطفرة) في كثير من الأحيان الخضوع لقائي البوق و المبيض للحد من خطر الإصابة بمرض الصفاق 23،24. للأسف، لا يزال المرضى غالبا ما تتطور HGSC نظرا لنمو الخلايا السرطانية في المبيض الحالية داخل الثرب ومواقع أخرى المنتشر في وقت الجراحة. تحديد العوامل التي تعرقل المكروية الأنسجة الثرب يمكن أن يمنع سرطان توطين الخلية و / أو النمو داخل الثرب. من المحتمل أن تستخدم هذه الأساليب في تركيبة مع العوامل العلاجية التي تستهدف خلايا سرطان المبيض لمنع تشكيل ورم خبيث أو قمع إعادة نمو السرطان (بعد debulking الجراحي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
- Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
- Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
- Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
- Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
- Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. The omentum. World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).
- Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
- Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
- Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
- Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
- Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
- Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
- Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
- Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
- Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
- Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
- Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
- Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
- Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
- King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
- Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
- Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
- Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
- Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).
