Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

Published: October 14, 2015 doi: 10.3791/52721
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 4,5, 1
1Section of Urology, Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Pathology, Robert Wood Johnson Medical School, 3Campbell Family Institute for Breast Cancer Research, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 4Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, Campbell Family Institute for Breast Cancer Research, Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, University Health Network, 5Departments of Medicine, Pharmacology, and Cancer Biology, Duke University Medical Center

Abstract

בדרגה גבוהה לסרטן השחלות הצפק (HGSC), הגורם לגרורות הצפק נרחבות, ממשיכה להיות פרוגנוזה גרועה מאוד; פחות מ -30% מהנשים בחיים 5 שנים לאחר האבחון. Omentum הוא אתר מועדף של היווצרות גרורה HGSC. למרות החשיבות הקלינית של מייקרו-סביבה זו, התרומה של רקמת שומן omental להתקדמות סרטן השחלות נותרת understudied. שומן Omental יוצא דופן בכך שהוא מכיל מבנים הידועים ככתמים חלביים, המורכבים מB, T, ותאי NK, מקרופאגים, ותאים המקיפים את הקנים צפופים של כלי דם. כתמי החלב לשחק תפקיד מפתח בפונקציות הפיזיולוגיות של omentum, אשר נדרשות להומאוסטזיס הצפק. הראינו כי כתמים חלביים גם לקדם התישבות השחלות סרטן גרורתי של שומן הצפק, צעד מפתח בפיתוח של גרורות הצפק. כאן אנו מתארים את הגישות שפיתחנו כדי להעריך ולכמת כתמים חלביים לitoneal שומן וללמוד התרומה הפונקציונלית שלהם לקולוניזציה גרורתית תאים סרטניים בשחלות של רקמות omental שני in vivo לשעבר vivo. גישות אלה הן להכליל לדגמים נוספים עכבר ושורות תאים, ובכך לאפשר את חקר היווצרות גרורות סרטן השחלות מלוקליזציה ראשונית של תאים למבני מקום חלביים להתפתחות של גרורות הצפק נרחבות.

Introduction

שלא כמו רוב הגידולים מוצקים, גרורות מסרטן בדרגה גבוהה השחלות הצפק (HGSC) מוגבלות לחלל הצפק 1. לפיכך, טיפולי הצפק יעילים עלולים לשלוט או לחסל HGSC. נכון לעכשיו, גישה טיפולית סטנדרטית היא cytoreduction כירורגית בשילוב עם כימותרפיה 1-3. למרבה הצער, הרוב המכריע של מטופלים חווים ולהיכנע לסיבוכים של הישנות מחלה. סטטיסטיקה העגומה אלה מראה את הצורך בהבנה משופרת של קולוניזציה גרורתית, התהליך שבו תאי הסרטן בתרגום ל, לנצל, ולהתרבות בתוך רקמות מארח כדי ליצור גרורות 2.

Omentum הוא אתר מוקדם המועדף HGSC גרורות 4-7. שלא כמו שומן הצפק אחר, רקמת שומן omental מכילה מבנים חיסוניים חריגים ידועים ככתמים חלביים, המכילים B, T, ותאי NK ומקרופאגים, אשר ממלאים תפקידי מפתח בhomeos הצפקtasis 8,9. בנוסף לפונקציות הפיזיולוגיות שלהם, מצאנו כי כתמים חלביים למלא תפקיד פעיל בקולוניזציה גרורתית סרטן השחלות 4. במבחני גרורות ניסיוניים, SKOV3ip.1, CaOV3, וHeyA8 (אדם) וID8 (עכברי; C57BL / 6) תאי סרטן השחלות במהירות הביתה לכתמים חלביים, המצביע על כך שהתאים לנוע לעבר גורם chemotactic מופרש. מעניין לציין, תאי סרטן לא ליישב שומן הצפק חסר כתמים חלביים (כלומר, האשכים ושומן רחם) 4.

על מנת לזהות מנגנוני ויסות קולוניזציה מקום חלבי, יש לנו מודלים מותאמים xenograft המאפשרים החקירה של אירועים תאיים ומולקולריים במהלך קולוניזציה גרורתית 4 הזמן. יתרון ספציפי של הגישות המתוארות במסמך זה דגש על ארכיטקטורה ותפקוד רקמות, המאפשר למשתמשים לבחון השערות במשולבות במלואו ובמודלי vivo לשעבר vivo של מטר4,10 קולוניזציה etastatic. על ידי השוואת לוקליזציה של תאי הסרטן וגידול במחסנים שומן הצפק אשר גם להכיל או חסרי כתמים חלביים, חוקרים יכולים לבדוק את תרומתו היחסית (ים) של תאי שומן ותאים בתוך כתמים חלביים ללינה והצמיחה ההדרגתית של תאי סרטן השחלה ברקמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים שוכנו, מתוחזק ומורדם בהתאם להנחיות מוסדיות טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) ותחת פיקוחו של אוניברסיטת שיקגו בעלי החיים מרכז משאבים.

1. בעלי חיים הכנה ללימודים ניסויי

  1. לאפשר חיות להסתגל לסביבה חדשה ודיור, להתאושש מהשפעות פיזיולוגיות אפשריות של תחבורה וטיפול.
    הערה: הטכניקה הבאה היא ישימה לכל הזנים הזמינים המסחרית של עכברים. מספר בעלי החיים שישמשו לניסוי תלוי בעיצוב המחקר וצריך להיעשות בהתייעצות מסטטיסטיקאי.

2. זיהוי ובידוד של מאגרי שומן הצפק.

  1. להרדים בעלי חיים באמצעות מנת יתר של CO 2 ושיטה פיזית משנית כדי לאשר מוות.
  2. כמחסני שומן הצפק קציר מהווה הסרת איברים פנימית (שיטה משנית), תואר שניke חתך קו האמצע קרוב לגבשושיות מפשעתי דרך קיר הבטן לחשוף את האיברים הפנימיים (איור 1 א).
  3. לOmental השומן (OM), לחשוף את הלבלב המורכב / omental ידי הרחבת הטחול מחלל הצפק עם מלקחיים (איור 1C). שחרר omentum מהלבלב והטחול על ידי זמירה מקרוב את כל חיבורי הרקמות. ודא שכל רקמת לבלב שנותרה הוא נכרת 4.
  4. לאשכי השומן (GF), להשתמש במלקחיים כדי להרים את שומן האשכים המקיף את השחלות ובלו על ידי חיתוך חיבורי רקמות (t העליון righ איור 1 א) 4.
  5. לרחם השומן (UF), להשתמש במלקחיים כדי להרים את שומן הרחם מקיף את קרן הרחם ובלו על ידי חיתוך חיבורי רקמות (איור 1 א ימני תחתון) 4.
  6. לmesenteric השומן (MF), לחתוך את הצומת בין המעי הדק והשוער. שימוש במלקחיים לתוקף אחיזת הקצה החופשי שלמעי דק, ולאט לאט "קליפה" זה מהשומן mesenteric. שחרר את שומן mesenteric משורש mesenteric באמצעות מספריים לנתח (איור 1 א השמאלי תחתון) 4.
  7. לSplenoportal השומן (SF), להרים את הקצה הדיסטלי של הטחול באמצעות מלקחיים לחשוף את להקת השומן הדק של רקמת חיבור hilum של הטחול ללבלב. בלו שומן splenoportal ידי השחרור הראשון אותו מהלבלב, ולאחר מכן בזהירות לנתח אותו מהטחול (איור 1) 4.

3. החלב ספוט זיהוי באמצעות Giemsa מכתים

  1. omenta בלו (ראה שלב 2.3) מעכברי C57BL / 6 ולתקן ב5% ניטראלי שנאגרו פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות (O / N).
  2. לפרפין הטבעת הרקמות קבועות, לבחור תבנית שמתאימה לגודל של הרקמות. יוצקים פרפין המותך ממאגר הנפט כדי למלא את התבנית. פתח את הקלטת ושימוש חם לפטריות לבנות, להעביר את הרקמה לתוך התבנית.
    1. כוון את הרקמות בזהירות במהלך פרפין הטבעה לייצר סעיפים אורך. מניחים את קלטת רקמות שהכותרת מעל דפוס ולחץ בחוזקה במקום. לאפשר העובש להתקרר במשך לפחות 30 דקות.
  3. לחתוך קטעי סדרתי (4 מיקרומטר עבים) מפרפין-קבוע פורמלין מוטבע גוש רקמה (FFPE). מקום שקופית precleaned תחת הסעיפים כמו הסרט של רקמה יורד בלוק פרפין.
  4. סדר סעיף כל omentum; לאסוף ולהכתים כל חלק שלישי לצביעה גימזה (ראה 3.6). לאפשר שקופיות זכוכית עם הסעיפים לאוויר יבש, רצוי O / N ב RT. מגלשות יבשות מוכנות לקיבעון. להכתים את הסעיף הראשון לhematoxylin ו eosin להשוואות לשקופיות Giemsa מוכתמים.
  5. Deparaffinize השקופיות על ידי שני incubations 5 דקות רציפות בxylenes. רעננות שקופיות על ידי שני incubations רציף בפעולות הבאים: אתנול 100%, 95% אתנול, ולבסוף ברז water.
    1. לנקוט באמצעי זהירות נאותה כדי למנוע את השקופיות מייבוש. לבצע את כל הפעולות בRT.
  6. לחלוטין לטבול את השקופיות בצנצנת Coplin המכילה 5% פתרון Giemsa (w / v מוכן במים ברז) ודגירה של 4 דקות ב RT. יש לשטוף את השקופיות במים ברז למשך 60 שניות, אוויר יבש והר עם coverslip באמצעות תקשורת הרכבה.
  7. תמונת השקופיות המוכתמות באמצעות סורק שקופיות שלם ותהליך עם תוכנה של יצרן. לכמת את הנפח החלבי נקודה בסעיפי omental הצבעוניים Giemsa באמצעות תוכנת ImageJ 4.

4. רביה והכנת תאי סרטן השחלות בvivo לשעבר vivo מחקרים

  1. 15 מיליליטר טרום חם של מדיום גידול תא עד 37 מעלות צלזיוס באמבט חום. הכן בקבוק תרבות רקמה בגודל מתאים (למשל, אזור 2 משטח 75 סנטימטרים) על ידי תיוג עם שמו של קו התא, מספר מעבר, תאריך ומי שהכין את המניה הקפואה, ואת התאריךואדם שמפשיר / ציפוי התא.
    הערה: במחקרים של גרורות מידע מפורט כזה הוא חיוני, כמועד הקפאה למטה ומספר מעבר יכול להשפיע על הפנוטיפ גרורתי.
  2. שימוש בסביבת סטרילית של מכסה המנוע הבטיחות הביולוגי, פיפטה 10 מיליליטר של מדיום לתוך בקבוק תרבות T-75. הסר בקבוקון של תאים ממערכת החנקן הנוזלית ולבדוק את התווית כדי לאשר את סוג התא. להפשיר רק אחד בקבוקון של תאים בכל פעם על ידי התחממות 37 ° C אמבט חום.
  3. באמצעות טכניקה סטרילית, פיפטה 1x10 6 מופשר תאים לתוך בקבוק התרבות. מניחים את הבקבוק בחממה כדי לאפשר לתאים לצרף. נער בעדינות את הבקבוק קדימה ואחורה כדי ליצור השעיה תא אחידה.
    1. הנח בקבוק בתרבית רקמת חממה ולשמור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% הסביבה CO 2. לאפשר לתאים לדבוק O / N.
  4. תקשורת לשאוב, ולהחליף עם תקשורת צמיחה מחוממת מראש טרי. מניחים את הבקבוק בחממה וכלתאי ow לגדול. צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה ויזואלית כל 2-3 ימים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. להשתמש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטי לתאי מעבר עם הגיע מפגש 70-80%.
    הערה: מבחני ניסיוניים לקצור את התאים בנקודת מפגש 70% כדי להבטיח שתאים באופן פעיל מתרבים.
  5. לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט סטרילי (PBS). לשאוב PBS ולהוסיף 0.25% טריפסין / EDTA (2 עד 3 מיליליטר לשטח 75 סנטימטר 2) דגירה 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מבחינה ויזואלית לאשר כי התאים מנותקים ולהוסיף נפח שווה של מדיום גידול, ובעדינות פיפטה תאים למעלה ולמטה כדי לקבל השעיה תא בודדת.
    הערה: זה קריטי, כי מדיום הגידול מכיל סרום כפי שמנטרל טריפסין. הכן לפחות 2 עד 4-לקפל יותר תאים מהמספר דרוש לניסוי נתון, כדי לפצות על אובדן של תאים בשלבים הבאים
  6. לקבוע את אחוז תאי קיימא בהשעיה באמצעות assay הרחקת trypan הכחול באמצעות hemacytometer או דלפק תא אוטומטי.
    שים לב: כאן, השתמש רק בהכנות תא שבי ≥ 96% מתאי קיימא.
  7. מעבירים את ההשעיה התא מהבקבוק לצינור חרוטי 50 מיליליטר. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב1,100 XG, ב 4 מעלות צלסיוס
  8. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב PBS לריכוז של 2x10 6 תאים לכל מיליליטר.

5. הזרקה של תאי Intraperitoneal

הערה: בניסויים שלנו, עכברי מטופלים בזרימת אוויר למינרית או ארון בטיחות ביולוגית במתקן המחסום שלנו, במטרה לצמצם את הסיכון לחשיפת הפתוגן, כדי להדגים את הטכניקה הזו באופן ברור, הנהלים בווידאו הנלווה נערכו במעבדה המאושרת לעבודה של בעלי חיים. טכניקה מיוחדת זו אינה דורשת חיות להיות תחת הרדמה. תחת פרוטוקולים שאושרו, לבצע techniq זהUE בבעלי חיים. השתמש בזנים מתאימים של עכברים במחקר זה. לדוגמא: להשתמש בעכברי מדוכאי חיסון, athymic בעירום לחקר תא סרטן השחלות אנושי (SKOV3ip.1, וHeyA8) קולוניזציה; להשתמש C57BL / 6 עכברים עם מערכת חיסון למחקר של תאי סרטן השחלות קולוניזציה עכבר (ID8).

  1. עומס 500 μl של ההשעיה התא הבודד לתוך המזרק ולשים במחט סטרילית כתרים 25 G. הפעולה זו מפחיתה את תא גז לפני ההזרקה.
  2. בחר את העכבר על ידי בעורפו של הצוואר ולהחזיק את הזנב באמצעות הכף והאצבע ולתקן את הרגל האחורית השמאלית בין הטבעת לאצבע קטנה (כאשר העכבר מאופק עם יד השמאל).
    הערה: כדי להימנע מאברי בטן טראומה, לרסן את העכבר כל כך טוב שהוא לא יכול לזוז במהלך ההזרקה.
  3. תארו לעצמכם קו רוחב הבטן ממש מעל הברכיים, ולאתר נקודה בצד ימין של החיה וקרובה לקו האמצע. נקודת הכניסה היא גולגולת ולמעט המדיאליהפטמה האחרונה.
    הערה: החדרת המחט בצד הימין של העכבר תמנע את cecum ומפחית את הסיכון לניקוב המעיים 11.
  4. הכנס את המחט באזור התחתון של הבטן לרוחב של העכברים לעומק של כ -0.5 סנטימטר. למשוך בחזרה על הבוכנה כדי לאשר שהמחט לא חדרה כלי דם או איברים אחרים הצפק.
    1. אם כל נוזל להישאף להשליך את המזרק (ומדגם) 11. לשאוב ירקרק-חום או צהוב מציין חדירת מחט לתוך המעיים או בשלפוחית ​​השתן, בהתאמה.
  5. להזריק המדגם באמצעות לחץ איטי ויציב. למשוך את המחט ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה. אל לסכם מזרק לפני הרשות במכל חדים.
  6. עכברי קורבן באמצעות CO 2 מחנק והסרת איברים חיוני בנקודות זמן ספציפיות לפרסם הזרקה.

6. קולוניזציה מקום החלב בvivo

  1. Quantitation של לוקליזציה של תאי סרטן לכתמים חלביים באמצעות cytometry זרימה
    1. לבודד מחסני שומן הצפק מעכברים (כמתואר בשלב 2.3-2.7) הוזרק מתויג fluorescently תאי סרטן ורקמות מקום מיידיים בPBS קר כקרח.
      1. לטכניקה זו בפרט, משקל התאמה כל רקמות שומן שומן לomentum. העברת רקמות להפריד 5 מיליליטר צינורות המכילים 1.5 מיליליטר של סרום ללא DMEM ושל 0.1% (w / v) אלבומין בסרום שור. רקמות בריכה שנקטפו משלושה עכברים עצמאיים כדי להבטיח תשואה מספקת של תאים לcytometry זרימה.
    2. רקמות בשר טחון באמצעות מספריים כירורגיות ולהוסיף 1.5 מיליליטר של הסרום ללא DMEM המכיל 0.4% (w / v) collagenase I. דגירה ההשעיה רקמות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב סיבובי.
      1. כצעד אופציונאלי, נוסף לנתק רקמה על ידי לעיסה. במקרה זה, להעביר את ההשעיה רקמות collagenase לשקית microstomacher, ללעוס במשך 10 דקות על נמוך, מסתובב האורינטציהשל השקיות לאחר 5 דקות.
    3. דגימות סינון דרך מסנן רשת ניילון (60 מיקרומטר נקבובית) כדי להסיר שאריות גדולות יותר. איסוף תאים באמצעות צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקים את חלק supernatant.
    4. Resuspend התא גלולה בשל PBS 100 μl בשילוב עם 900 μl של חיץ תמוגה ACK ולדגור על RT דקות 1. תאי צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות וזורקי supernatant.
      1. Resuspend התא גלולה ב250 μl של PBS קר כקרח. סנן את הדגימות באמצעות רשת ניילון נקבובית 60 מיקרומטר כדי להבטיח השעיה תא בודדת. יש לשטוף את המסנן עם 250 μl של PBS קר כקרח.
    5. לכמת את מספר התאים מתויגים fluorescently באוכלוסייה באמצעות cytometer זרימה מצויד בליזר צהוב-ירוק-561 ננומטר וננומטר 585/15 ננומטר מסנן bandpass. הגדר את השער לתאי tdTomato-חיובי המבוססים על ניתוח של תאי הורים ו / או בקרות שליליות מתאימות 4.
    6. Quantitation של גרורות מיקרוסקופיות ומקרוסקופיים
      1. בנקודת הסיום הרצוי הניסיונית (ים), לבודד, ומייד למקם את הרקמות בתקשורת הקיבעון המתאימה. תקן דגימות גדולות יותר, כגון האשכים שלמים, רחם, ומחסני שומן mesenteric ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין למשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. תקן דגימות קטנות (omental ושומן splenoportal, כמו גם שווי רקמות של רחם ושומן mesenteric) ב 5% ניטראלי שנאגרו פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2-16.
        1. לחלופין, הצמד להקפיא רקמות על ידי הצבת אותם במדיום הקפאה כגון OCT ושחרר לכמות מתאימה של חנקן נוזלי.
      2. העברה קבועה רקמות לאתנול 70% ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד ההטבעה בפרפין. שבץ ורקמות תהליך כפי שתואר ב3.2 ו -3.3.
        1. השתמש בסעיף H & E המוכתמת להעריך רקמות לנוכחות או עדר של גרורות מיקרוסקופיות (כלומר, אשכולות של 50 תאים). אשר לאהוא הנוכחות של גרורות מיקרוסקופיות בשיטה משנית כגון כתם IHC לcytokeratin 8/18 כדי לזהות תאי סרטן השחלות.

    7. החלב ספוט התיישבות Ex Vivo

    1. הקמת תנאי תרבות הבסיסיות vivo לשעבר איבר omental
      1. מניחים כל omentum להוספת צלחת תרבות אחת ומקום בתוך היטב אחד של צלחת תרבית רקמת עשר היטב המכילה 500 μl של תקשורת / F12 DME FCS המכילה 20%. לשמור על תרבויות איבר על 37 מעלות צלזיוס בסביבת 5% CO 2 במשך 24 עד 48 שעות ו / או נקודות זמן נוספות. להשתמש בשלוש omenta העצמאי (דגימות בשלושה עותקים) לכל מצב (למשל, סוג תקשורת / נקודת זמן).
      2. כדי לאשר את תקינות רקמות בנקודתי הקצה הניסיונית, לתקן ודגימות תהליך כפי שמתואר בשלב 3. ספירה בריאה לעומת adipocytes נמקים בסעיפי H & E יכולה להעריך שלמות רקמות. מינימום של 120 ~ תאים מ5 דגימות ביולוגיות נדרש לגבש אחוז רקמת חיה כיום 10.
      3. כדי למדוד תפקוד רקמות, omenta המקום (n = 3) בבארות נפרדות של צלחת 24 היטב המכילה 500 μl של תקשורת / F12 DME עם FCS 20%. לאפשר omenta להתנות את התקשורת על 37 מעלות צלזיוס בסביבת 5% CO 2 למשך 24 שעות, ולאחר מכן להסיר 250 μl לשימוש בELISA assay IL-6 10.
    2. שיתוף תרבות vivo לשעבר של omentum העכבר עם תאי SKOV3ip.1-GFP
      1. לגדול ולהכין תאים מתויגים fluorescently כאמור בסעיף 4 וגלול בריכוז של 2 × 10 6 תאים למ"ל.
      2. החל ~ 6 μl של דבק רקמות הקרום של להכניס את התרבות ולאפשר לו אוויר יבש. לשטוף את הממברנה פעמיים עם מים סטריליים כדי להסיר כל דבק מוגזם. אוויר יבש הקרומים מתחת למכסת מנוע למינרית.
      3. בלו בזהירות את omenta ולצרף אותו לmemb המצופה הדבקהRANE באמצעות מלקחיים סטרילית. לאפשר לרקמות לדבוק בקרום 1 דקות לפני הוספת תקשורת. הוסף 500 μl של ההשעיה התא זה על גבי זה omentum בכל הכנס תרבות. מלא סביב תא transwell האזור עם 2.5 מיליליטר של DME / F-12 10.
      4. דגירה omenta עם השעיה תא במשך 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס בסביבת CO 2 של 5%. מוציא בזהירות ולשטוף את omenta עם ~ 10 מיליליטר של PBS. דמיינו מוקדי תאי סרטן ניאון באמצעות מערכת הדמיה ניאון מתאימה 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זיהוי ובדיקה היסטולוגית מאגרי שומן הצפק

נתיחה אנטומיים גולמית מאפשרת זיהוי של ארבעה מחמשת המקורות העיקריים של שומן הצפק (איור 1 א). נע בכיוון השעון מהמרכז העליון הם: omentum (OM; התווה) ממוקם על הבטן והטחול, שומן האשכים (GF) המקיף את השחלה השמאלית (OV), שומן הרחם (UF) שצורף לקרני הרחם (אה) ולפדר (שלי) מחובר למעי הדק (SI). השחלה (OV), קרן רחם (אה), ובמעי הדק (SI) מצוינות כנקודתי התייחסות. שומן splenoportal (SP) מקיף את עורק הטחול ומחבר את hilum של הטחול לעורק צליאק (איור 1). לבסוף, omentum מחובר לקיבה והלבלב (איור 1 ג). המבנה הגולמי והגודל יחסי של רקמות אלה מוצגים באיור 1D. בדיקה היסטולוגית של הרקמות דואר מראה כי splenoportal ושומן omental לכלול מבנים חלביים נקודה [MS] בפריפריה הרקמה, מוקפים adipocytes []; רחם, האשכים, ושומן mesenteric לא (1E איור).

זיהוי נקודת החלב באמצעות Giemsa מכתים

כדי לאפשר ההשוואה של תוכן מקום חלבי הכולל בין זנים שונים עכבר, חלבי נקודת נפח ושטח נוכחי בomenta פרט ונרשמת בשיטה חדשנית. כפי שתואר בשיטות, "הר שלם דיגיטלי" של omenta נבנה על ידי צביעת כל חלק שלישי של רקמה בפתרון 5% Giemsa ולכידת תמונות של הרקמות המוכתמות (איור 2 א). כתמי החלב יופיעו כאזורים מכתימים בצבע כחול כהה (איור 2). זהותם של האזורים אלה ככתמים חלביים אושרה בסעיפים סדרתי על ידי שתי צביעת H & E וIHC לתאים חיוביים לCD45, סמן הלימפוציטים נפוצים ( אל et 4, תמונות (איור 2 א) לוקטו ועובדו לבנייה "הר שלם דיגיטלי", שלאחר מכן יכול לשמש כדי לחשב את הנקודה החלבית אזור הנפח ובomenta הבודד.

הערכה כמותית ואיכותית של קולוניזציה הסרטן של omentum

שיטה מבוססת cytometry זרימה פותחה על מנת לכמת את מספר תאי הסרטן נמצאים במחסני שומן לאחר הזרקת intraperitoneal. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כדי ללמוד את צעדי התישבות מוקדמות של התהליך גרורתי. לדוגמא, באיור 3 א, תאי ID8-tdTomato הוכנו והזריקו intraperitoneally לעכברי C57BL / 6. בשעת 7 ימים לאחר הזרקה (dpi), איברי השומן נקצרו וניתקו לתוך השעיה תא בודד כמתואר בשיטות. מספר לסה"נ tdTomatoLLS היה לכמת באמצעות cytometry זרימה (איור 3 א, משמאל). Omentum הראה עלייה של כ 12-פי במספר האירועים tdTomato-חיוביים, יחסית לPBS- הזריק בקרות (איור 3 א, ימין), אבל לא היה גידול משמעותי בהכנות תא משומן האשכים, שומן רחם, או לפדר . גישה מבוססת IHC איכותי משלימה גם הראתה כי 7 ימים לאחר הזרקת ה- IP של תאי SKOV3ip.1, נגעי תאי הסרטן דומים נצפו גם בשומן omental וsplenoportal (איור 3). IHC לפאן-cytokeratin האנושי (פאן-CK) מאשר את נוכחותם של תאי סרטן בתוך הכתמים החלביים. הספציפיות של צביעת IHC אושרו באמצעות שליטת IgG לנוגדן פאן-cytokeratin (איור 3). קולוניזציה סרטן השחלות ID8 של מחסני שומן הצפק הוערכה באמצעות C57BL עכברים / 6 בשעת 7 dpi. נגעי תאי הסרטן גדולים בכתמים החלביים של שני omentum ושומן splenoportal בחוץבשורה. אשכולות קטנים של תאי הסרטן נראו מדי פעם במחסנים שומן אחרים, כפי שמודגמים בהבלעת הפנל. לפיכך, אחד יכול לגשת הן את המספר והמיקום של תאים ביחס בתוך רקמה נתון.

assay vivo לשעבר ללמוד קולוניזציה סרטן השחלות של כתמים חלביים

כדי להתמודד עם המגבלות של תנאי in vivo, תוך שמירה על הרכב ומבנה רקמה, אנו מותאמים גישת vivo לשעבר ללמוד קולוניזציה תאים סרטניים בשחלות של רקמות omental. רקמות omental כל נכרת מן העכברים בהצלחה בתרבית לשעבר vivo ללמוד אינטראקציה סרטן השחלות עם כתמים חלביים. תאי SKOV3ip.1-GFP היו זורעים על vivo לשעבר רקמות omental התרבותית ונשמרו על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה של 6 שעות. תאי ניאון GFP החיובי היו גלויים במוקדים דיסקרטי בשני vivo לשעבר וin vivo (איור 4 א). תחת שני התנאים, אימות היסטולוגית באמצעות הצביעה H & E אישרה לוקליזציה של תאי סרטן לכתמים חלביים (איור 4). כתם מאשרים באמצעות כתם cytokeratin לתאי הסרטן הראה הנוכחות של מוקדי תאי הסרטן בתוך הכתמים החלביים (איור 4C). נתונים אלה מראים את הכדאיות של שימוש vivo לשעבר מתקרבת ללימודים מבוססי מנגנון כדי להשלים את ממצאי in vivo.

איור 1
איור 1. מקומות ומבנים יחסי של מחסני שומן הצפק העיקריים. נתיחה אנטומיים גולמית המראה את המיקום היחסי של ארבעה מחמשת המקורות העיקריים של שומן הצפק (). Omentum (OM; התווה), שומן האשכים (GF), שומן רחם (UF), לפדר(שלי), השחלה (OV), קרנות רחם (אה), ומעי דק (SI) מוצגות שומן Splenoportal (SP; התווה) (ב). נחשף על ידי הרמת הטחול עם מלקחיים (C) omentum העכבר הראה גזור. חופשי מהלבלב כדי לשפר את ההדמיה D:. גדלים ומבנים של שומן הצפק נכרת יחסית; לפדר מוצג מחובר לשורש mesenteric. הערכת א היסטולוגית של שומן הצפק לנוכחותם של כתמים חלביים adipocytes (), (MS) מקום חלבי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. גישה מבוססת Giemsa לכימות כתמים חלביים ברקמת omental. (); תמונה של קטע השלם omentum מוכתם Giemsa. סעיפים סידוריים של רקמת omental הוערכו על ידי: צביעה (B) Giemsa; כתמים חלביים מצוינים עם חצים שחורים (ג) H & E מכתימה.; , ו( ד) IHC באמצעות נוגדן אנטי CD45 לזהות ימפוציטים בתוך מבנה המקום החלבי. סרגל קנה המידה הוא אותו לBD ומציין 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
3. תאי סרטן השחלות איור מעדיפים ליישב שומן הצפק המכיל כתמים חלביים. Cytometric זרימת מנתח של omentum (OM), שומן רחם (UF), שומן האשכים (GF), ולפדר (שלי) שנקטפו מן העכברים ב 7 dpi של ID8- תאי tdTomato (משמאל). הנתונים מוצגיםכמתקפל שינוי גידול של תאים tdTomato-postive על עכברים שהוזרקו-PBS (מימין). ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן של הממוצע. ** מציין p <0.01 בהשוואה לקבוצת ביקורת PBS. בחינה (B) של רקמות על ידי שתי היסטולוגיה סטנדרטית וIHC תערוכות קולוניזציה הדומה של כתמים חלביים בשני omentum ושומן splenoportal (לאחר ההזרקה של 1x10 6 תאים SKOV3ip.1 לעכברים עירום). סעיפים הוערכו על ידי צביעת H & E. נוכחותם של תאי אפיתל (סרטן) בנגעים אושרו על ידי זיהוי IHC של cytokeratin באמצעות פאן-cytokeratin נוגדן (פאן-CK). IHC באמצעות נוגדן אלוטיפ IgG לפאן-cytokeratin שימש כביקורת למכתימה סגוליות. סרגל קנה המידה הוא זהה עבור כל התמונות ומציין 100 מיקרומטר. (ג) הערכה של קולוניזציה סרטן השחלות ID8 של מחסני שומן הצפק בC57BL עכברים / 6 בשעת 7 dpi. אנא לחץכאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
קולוניזציה איור 4. vivo לשעבר של תאי סרטן השחלות לomentum. העמודות מייצגות השוואה של שלושה תנאי הניסוי מראים omenta הנאיבי (משמאל), הזרקת ההודעה IP omenta מעכברים 6 שעות של 1 x 10 6 תאי SKOV3ip.1 (במרכז) וomenta עם SKOV3ip.1-GFP יישב בתנאי vivo לשעבר (מימין). omenta נאיבי (בלנק), יישב omenta ידי SKOV3ip.1-GFP מassay in vivo (קובץ מצורף in vivo) או omenta יישב על ידי SKOV3ip.1-GFP בתנאי תרבות לשעבר vivo (קובץ מצורף vivo לשעבר). הדמיה של הקרינה omenta כל לGFP מציגה דפוס התישבות דומה לשני in vivo ומבחני vivo לשעבר (). צביעת H & E סעיפים סידוריים שלomenta מפנל מאשר את נוכחותם של תאי הסרטן מקומיים לכתמים החלביים (B). Cytokeratin לתאי סרטן השחלות מאמת צביעת H & E (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתוח של טיפולים למקד תאים הפיצו דורש הבנה מכניסטית של קולוניזציה גרורתית, הצעד הראשון הקריטי בהתפתחות של מחלה הצפק. כדי לטפל בבעיות אלה אנו מדווחים גישות שניתן להשתמש כדי להבחין איך הרכב של omentum ייחודי רקמה והאדריכלות לקדם קולוניזציה גרורתית סרטן השחלות. מאפיינים של הגישה שלנו הם: 1) הדגש על אירועים בתחילת תהליך ההתיישבות; 2 השוואה) של מחסנים המכילים מקום ושומן הלקוי חלביים; 3) זמינות של טכניקה לשחזור לכמת חלבי נקודת נפח ברקמות; 4 זמינות) של משלים in vivo לשעבר vivo גישות להעריך קולוניזציה תאים סרטניים בשחלות של מבני מקום חלביים.

בביצוע מחקרים אלו הגענו למבינים שחוקרים לעתים קרובות אינם מודעים למיקום של omentum העכבר ואת קיומה של spלהקת lenoportal שומן, המשמשת כמקור שני של שומן הצפק המכיל מקום חלבי. למרות הטכניקות המתוארות במסמך זה מאפשרים לימודים של צעדים בקולוניזציה גרורתית, הם מציעים רק "תמונות" של תהליכים אלה, ולא הערכה של התישבות בזמן אמת. אם אחרי כראוי, כפי שתואר בפרוטוקולים אמורים להניב תוצאות לשחזור למגוון של חוקרים. קריטי להצלחה של טכניקות אלה הן: 1) זיהוי ולנתח את רקמות שומן הצפק ספציפיות כמו זיהום על ידי סוגים אחרים רקמות יהיה להטות נתונים כמותיים המתקבלים מcytometry הזרימה; ו 2) יישום הזנים מתאימים של עכברים הטרנסגניים לחקר בשאלה. יש לציין כי המחקרים כמובן הזמן צריכים להיקבע לשורות תאים בודדות. באופן אמפירי כזה תלוי במגוון גורמים, כולל שיעור התפשטות, זמן לקחת את גידול ואת הפוטנציאל גרורתי.

בנוסף לביתור Interactions של קווים מבוססים היטב השחלות תא סרטני ומייקרו-סביבת omental כי הם חשובים להיווצרות גרורה, הטכניקה המתוארת במסמך זה יכול לשמש גם כדי להעריך את הפוטנציאל הממאיר של שורות תאים נגזרו קליני כי לשחזר שינויים מולקולריים בתחילת קרצינומה intraepithelial תובל הצפק ב מולה של החצוצרות 12-17. למרות שמסלול להתקדמות המולקולרית של נגעים אלה מתפתח, יש צורך במחקרים vivo כדי לקבוע את המשמעות הביולוגית של שינויים ספציפיים. משלים בvivo ומבחני vivo לשעבר יכול לשמש כדי להעריך את הפעולות ספציפיות בקולוניזציה גרורתית של רקמת omental על ידי שורות תאי מבשר מודל כזה המידע שלוקט ממחקרים עשויים להיות מפתח לדור של השערות טיפוליות והעיצוב של ניסויים פרה-קליניים נוספים.

מנגנוני זיהוי השולטים קולוניזציה גרורתית עשויים לאפשר המניעהאו שליטה של ​​היווצרות גרורה. לדוגמא, נשים שנמצאות בסיכון מוגבר לפתח סרטן השחלות 18-22 (כלומר, נושאות המוטציה BRCA1 או BRCA2 גן) לעתים קרובות לעבור כריתת שחלות מניעתית salpingo-מנת להפחית את הסיכון להתפתחות מחלת הצפק 23,24. למרבה הצער, לעתים קרובות חולים עדיין לפתח HGSC בשל תולדה של תאי סרטן השחלות הנוכחיים בתוך omentum ואתרים גרורתי אחרים בזמן הניתוח. זיהוי של סוכנים שלשבש microenvironment רקמת omental יכול למנוע לוקליזציה סרטן תאים ו / או צמיחה בתוך omentum. גישות כגון העלולות לשמש בשילוב עם תרופות טיפוליות המתמקדות בתאי סרטן השחלות כדי למנוע היווצרות גרורה או לדכא צמיחה מחודשת סרטן (לאחר debulking כירורגית).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Tools Fine Science Tools NA
Geimsa Fluka/Sigma Aldrich 48900
5% Formalin Sigma HT501320
DMEM Corning 10-013-CV
Trypsin Gibco 25200-056
PBS Corning 21-040-CV Without calcium and Magnesium
26 gauge needle BD 329652
BSA Sigma A7906
Collagenase Worthington LS004196
Stomacher Seward Labsystems Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag Stomacher Lab Systems BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Millicell culture plate insert Millipore PICM01250
Cell-Tak Corning 354240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
  2. Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
  3. Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
  4. Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
  5. Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. The omentum. World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).
  6. Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
  7. Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
  8. Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
  9. Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
  10. Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
  11. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
  12. Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
  13. Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
  14. Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
  15. Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
  16. Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
  17. Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
  18. Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
  19. Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
  20. King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
  21. Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
  22. Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
  23. Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
  24. Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).

Tags

רפואה גיליון 104 כתמים חלביים omentum סרטן השחלות שומן הצפק גרורות ניסיוניות קולוניזציה גרורתית
<em>In vivo לשעבר vivo</em> גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnan, V., Clark, R., Chekmareva, … More

Krishnan, V., Clark, R., Chekmareva, M., Johnson, A., George, S., Shaw, P., Seewaldt, V., Rinker-Schaeffer, C. In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose. J. Vis. Exp. (104), e52721, doi:10.3791/52721 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter