Abstract
Alto grau de câncer de ovário seroso (HGSC), a causa de metástases peritoniais generalizados, continua a ter um prognóstico extremamente pobre; menos do que 30% das mulheres estão vivos 5 anos após o diagnóstico. O omento é um local preferido de formação de metástases HGSC. Apesar da importância clínica desta microambiente, a contribuição de tecido adiposo omental a progressão do câncer de ovário foram pouco estudados. Adiposo omental é incomum, pois contém estruturas conhecidas como manchas esbranquiçadas, que são compostos de B, T e células NK, macrófagos e células progenitoras que cercam ninhos densas da vasculatura. Manchas leitosas desempenham um papel fundamental nas funções fisiológicas do omento, que são necessários para a homeostase peritoneal. Nós mostramos que manchas esbranquiçadas também promover o cancro do ovário de colonização metastática adiposo peritoneal, um passo fundamental para o desenvolvimento de metástases peritoniais. Aqui nós descrevemos as abordagens que desenvolvemos para avaliar e quantificar manchas esbranquiçadas em poritoneal adiposo e estudar a sua contribuição funcional para células de cancro do ovário metastático colonização de tecidos omental tanto in vivo como ex vivo. Estas abordagens são generalizáveis a obter modelos de ratinho e linhas celulares, permitindo, assim, o estudo da formação de metástases do cancro do ovário de localização inicial de células de estruturas local leitoso para o desenvolvimento de metástases generalizadas peritoneais.
Introduction
Ao contrário da maioria de tumores sólidos, as metástases de cancro do ovário seroso de alto grau (HGSC) estão limitados a cavidade peritoneal 1. Assim, as terapias eficazes peritoneal poderia controlar ou erradicar HGSC. Atualmente, uma abordagem terapêutica padrão é citorredução cirúrgica combinada com quimioterapia 1-3. Infelizmente, a grande maioria dos pacientes experimentam e sucumbir a complicações de recorrência da doença. Estas estatísticas sombrias mostram a necessidade de uma melhor compreensão da colonização metastática, o processo pelo qual as células cancerosas para localizar, utilizar e proliferar dentro de tecidos do hospedeiro para formar metástases 2.
O omento é um site de início preferido de HGSC metástase 4-7. Ao contrário de outros peritoneal adiposo, o tecido adiposo omental contém estruturas invulgares imunes conhecidas como manchas leitosas, que contêm B, T, e células NK e macrófagos, os quais desempenham papéis fundamentais na homeos peritoneaistasis 8,9. Além de suas funções fisiológicas, descobrimos que manchas esbranquiçadas desempenhar um papel ativo no câncer de ovário colonização metastática 4. Em ensaios de metástases experimentais, SKOV3ip.1, CaOV3, e HeyA8 (humano) e ID8 (murino; C57BL / 6) células de câncer de ovário rapidamente de casa para manchas esbranquiçadas, sugerindo que as células estão se movendo em direção a um factor quimiotáctico segregado. Curiosamente, as células cancerosas não colonizar adiposo peritoneal sem manchas esbranquiçadas (ou seja, gonadal e gordura uterino) 4.
A fim de identificar os mecanismos que regulam a colonização mancha leitosa, que têm modelos de xenoenxerto optimizado que permitem a interrogação de eventos celulares e moleculares ao longo do curso tempo da colonização metastático 4. Uma vantagem específica das abordagens aqui descritas é sua ênfase na arquitetura e função do tecido, o que permite aos usuários para testar hipóteses em totalmente integrado in vivo e ex vivo modelos de m4,10 colonização etastatic. Ao comparar a localização de células de câncer e crescimento em depósitos de gordura peritoneal que quer contenham ou não possuem manchas esbranquiçadas, os pesquisadores podem testar a contribuição relativa (s) de adipócitos e células dentro de manchas esbranquiçadas à apresentação e progressivo crescimento de células de câncer de ovário em tecidos fisiologicamente relevantes.
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Protocol
Todos os ratos foram alojados, mantidos e sacrificados de acordo com a Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações e sob a supervisão da Universidade de Chicago animal Resource Center.
1. Os animais que preparam para estudos experimentais
- Permitir que os animais se adapte à nova habitação e meio ambiente, para se recuperar de potenciais efeitos fisiológicos de transporte e manuseio.
Nota: A técnica seguinte é aplicável a todas as estirpes de ratinhos disponíveis comercialmente. O número de animais a serem utilizados para um experimento é dependente do desenho do estudo e deve ser feito com consulta a partir de um estatístico.
2. identificação e isolamento de peritoneais gordos depósitos.
- Eutanásia animais por sobredosagem de CO 2 e um método físico para confirmar a morte secundária.
- Como depósitos de gordura peritoneal colheita constitui remoção de órgãos internos (método secundário), make uma incisão na linha média próximo da papila inguinal através da parede peritoneal para expor os órgãos internos (Figura 1A).
- Para a gordura omental (OM), exponha o complexo omental / pâncreas através do alargamento do baço a partir da cavidade peritoneal com uma pinça (Figura 1C). Solte omento do pâncreas e baço aparando de perto todas as conexões de tecido. Assegure-se que qualquer tecido pancreático remanescente é excisado 4.
- Para o Fat gonadal (GF), utilize uma pinça para levantar a gordura gonadal que envolve os ovários e impostos especiais de consumo, cortando conexões de tecido (Figura 1A superior righ t) 4.
- Para o Fat uterina (UF), utilize uma pinça para levantar a gordura uterina que envolve os cornos uterinos e impostos especiais de consumo, cortando conexões de tecido (Figura 1A inferior direito) 4.
- Por gordura mesentérica (MF), corte da junção entre o intestino delgado e o piloro. Utilize uma pinça para segurar com firmeza a extremidade livre doo intestino delgado, e lentamente "casca" que distância a partir da gordura mesentérica. Solte a gordura mesentérica a partir da raiz mesentérica usando tesouras de dissecção (Figura 1A inferior esquerdo) 4.
- Para a gordura Splenoportal (SF), levantar a extremidade distal do baço utilizando um fórceps para expor a banda de tecido gordo fina que liga o hilo do baço para o pâncreas. Excisar o splenoportal gordura por primeiro libertando-o do pâncreas, e, em seguida, cuidadosamente dissecando a partir do baço (Figura 1B) 4.
3. Láctea Identificação Ponto Usando Coloração Giemsa
- Excise omentos (Passo 2.3) a partir de ratinhos C57BL / 6 e fixar em 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 16 horas (S / N).
- Para inclusão em parafina do tecido fixado, escolher um molde que é adequado para o tamanho do tecido. Pour parafina fundida a partir do reservatório de parafina para encher o molde. Abra a gaveta e utilizando quente paraceps, transferir o tecido para dentro do molde.
- Orientar cuidadosamente os tecidos durante a parafina para produzir cortes longitudinais. Coloque a cassete de tecido marcado através da moldagem e pressione com firmeza no lugar. Permitir que o molde para esfriar por pelo menos 30 min.
- Corte cortes seriados (4 mm de espessura) da parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) bloco de tecido. Coloque um slide precleaned sob as seções como a fita de tecido sai do bloco de parafina.
- Serially seção inteira do omento; coletar e manchar a cada terceira seção para Giemsa (vide 3.6). Permitir que a lâmina de vidro com as secções para ar seco, de um modo preferido O / N à temperatura ambiente. Lâminas secas estão prontos para fixação. Manchar a primeira seção de hematoxilina e eosina para comparações com lâminas Giemsa manchadas.
- Desparafinar os slides por dois seqüenciais 5 min incubações em xilenos. Rehidratar lâminas por duas incubações sequenciais no seguinte: etanol a 100%, etanol a 95%, e finalmente toque water.
- Tomar as precauções adequadas para evitar os slides da secagem. Execute todas as etapas na RT.
- Imergir completamente as lâminas em um frasco Coplin contendo solução de Giemsa 5% (w / v preparada em água da torneira) e incubar durante 4 minutos à temperatura ambiente. Lavar as lâminas em água da torneira durante 60 segundos, o ar seco e montar com lamela usando a mídia de montagem.
- Imagem lâminas coradas usando um scanner de slides inteira e processo de software com o fabricante. Quantificar o volume mancha leitosa nas seções omentais corados pelo Giemsa usando software ImageJ 4.
4. Propagação e Preparação de células do cancro do ovário para in vivo e ex vivo Estudos
- Pré-aquecer a 15 ml de meio de crescimento de células a 37 ° C num banho de calor. Preparar um frasco de cultura de tecidos de tamanho adequado (por exemplo, 75 centímetros área de superfície 2) por meio de rotulagem com o nome da linha celular, número de passagens, a data ea pessoa que elaborou o estoque congelado, ea dataea pessoa que está descongelando / plaqueamento das células.
Nota: Em estudos de metástase tais informações detalhadas é crucial, como a data de congelamento para baixo e número passagem pode afetar o fenótipo metastático. - Usando o ambiente estéril do exaustor de segurança biológica, pipeta de 10 ml de meio em frasco de cultura T-75. Remover um frasco de células a partir do sistema de azoto líquido e verificar o rótulo para confirmar o tipo de célula. Descongele apenas um frasco de células em um momento de aquecimento no 37 ° C banho de calor.
- Utilizando uma técnica estéril, pipeta 1x10 6 células descongeladas para o balão de cultura. Colocar o balão na incubadora para permitir que as células para anexar. Agite suavemente o frasco para trás e para formar uma suspensão de células uniforme.
- Colocar o balão de cultura de tecidos na incubadora e manter a 37 ° C em 5% de CO 2 ambiente. Permitir que as células aderem O / N.
- Aspirar media, e substituir por meio de crescimento pré-aquecido fresco. Colocar o balão na incubadora e tudoow células a crescer. Monitorizar o crescimento celular por dia por inspecção visual a cada 2-3 dias utilizando um microscópio invertido. Utilize as técnicas padrão de cultura de células para células de passagem, ao atingir 70-80% de confluência.
Nota: Para os ensaios experimentais colher as células a 70% de confluência para assegurar que as células estão a proliferar activamente. - Aspirar o meio de cultura e lavar com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Aspirar PBS e adicionar 0,25% de tripsina / EDTA (2 a 3 ml de uma área 75 cm2 de superfície) e incubar 5 minutos a 37 ºC. Visualmente confirmar que as células foram destacadas e adicionar um volume igual de meio de crescimento, e suavemente para cima e para baixo pipetar células para se obter uma suspensão de célula única.
Nota: É crítico que o meio de crescimento conter soro, uma vez que inactiva a tripsina. Preparar pelo menos 2 a 4 vezes mais células do que o número exigido para uma dada experiência para compensar a perda de células durante as etapas subsequentes - Determinar a percentagem de células viáveis nasuspensão através de ensaio de exclusão de azul de tripano utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
Nota: aqui, utilizar apenas preparações de células em que ≥ 96% das células são viáveis. - Transferir a suspensão de células a partir do frasco para um tubo cónico de 50 ml. Células de pelotas por centrifugação 5 min a 1100 xg, a 4 o C.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em PBS até uma concentração de 2x10 6 células por ml.
5. injeção intraperitoneal de Células
Nota: Em nossos experimentos, os ratos são tratados de fluxo de ar laminar ou gabinete de biossegurança dentro de nossa unidade de barreira, a fim de limitar o risco de exposição a patógenos, Para demonstrar essa técnica de forma clara, os procedimentos no vídeo que acompanha foram realizados em um laboratório aprovado para o trabalho animal. Esta técnica não exige especial os animais estar sob anestesia. Sob protocolos aprovados, executar esta technique em animais vivos. Use estirpes adequadas de camundongos para o estudo. Por exemplo: usar imunocomprometidos, ratos pelados atímicos para o estudo de células de cancro do ovário humano (SKOV3ip.1, e HeyA8) colonização; usar imunocompetentes camundongos C57BL / 6 para o estudo de rato células de cancro do ovário (ID8) colonização.
- Carga de 500 ul da suspensão de células individuais dentro da seringa e colocar na agulha estéril tapado 25 G. Isto reduz o cisalhamento de células antes da injecção.
- Escolha o mouse para cima pela nuca do pescoço e segurar o rabo usando a palma eo dedo indicador e fixar a perna esquerda entre o anel eo dedo mínimo (quando o mouse é contido com a mão esquerda).
Nota: Para evitar órgãos abdominais traumatizantes, restringir o mouse bem para que ele não pode se mover durante a injecção. - Imagine uma linha que atravessa abdômen logo acima dos joelhos, e localizar um ponto no lado direito do animal e perto da linha média. O ponto de entrada é craniana e ligeiramente medialdo último bocal.
Nota: Inserir a agulha no lado direito do rato evita o ceco e reduz o risco de perfurar o intestino 11. - Insira a agulha na região lateral inferior do abdómen dos ratos a uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Puxar para trás o êmbolo para confirmar que a agulha não penetrou num vaso sanguíneo ou outros órgãos peritoneais.
- Se o fluido é aspirado para descartar a seringa (e amostra) 11. Um aspirado marrom-esverdeada ou amarela indica a penetração da agulha para o intestino ou bexiga, respectivamente.
- Injectar a amostra usando, pressão lenta e constante. Retire a agulha e retornar o mouse para sua gaiola. Não reaproveite seringa antes da eliminação em recipiente apropriado.
- Camundongos sacrifício via asfixia com CO2 e remoção de órgãos vitais em momentos específicos após a injecção.
6. Láctea colonização local In vivo
- Quantitàção de localização de células de cancro de manchas leitosas utilizando citometria de fluxo
- Isolar depósitos de gordura peritoneais a partir de ratinhos (como descrito no passo 2.3 - 2.7) injectados com células cancerosas com a etiqueta fluorescente e tecidos lugar imediatas em PBS gelado.
- Para esta técnica particular, peso-match todos os tecidos adiposo gordura para omento. Tecidos de transferência para separar tubos de 5 ml contendo 1,5 ml de DMEM isento de soro e 0,1% (w / v) de albumina de soro bovino. Piscina tecidos colhidos de três ratinhos independentes para assegurar um rendimento suficiente de células para citometria de fluxo.
- Tecidos tritura usando tesouras cirúrgicas e adicionar 1,5 ml de DMEM isento de soro contendo 0,4% (w / v) de colagenase I. Incubar a suspensão de tecido a 37 ° C durante 30 min com agitação rotativa.
- Como passo opcional, ainda dissociar o tecido por mastigação. Neste caso, a transferência da suspensão de tecido-colagenase para um saco microstomacher, mastigar durante 10 min em baixo, girando a orientaçãodos sacos após 5 min.
- Amostras filtrar através de um filtro de malha de nylon (60 de poro) para remover os detritos maiores. Recolher as células através de centrifugação a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar a fracção de sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento celular em 100 ul de PBS combinado com 900 ul de tampão de lise ACK e incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar células a 250 xg por 5 min e elimine o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento celular em 250 ul de PBS gelado. Filtrar as amostras através de uma malha de nylon de 60 um de poro para assegurar suspensão de células individuais. Lavar o filtro com 250 ul de PBS gelado.
- Quantificar o número de células marcadas por fluorescência da população utilizando um citómetro de fluxo equipado com um laser de amarelo-verde 561 nm e um / 15 nm, filtro de banda 585 nm. Defina a porta para as células tdTomato-positivos com base na análise de células parentais e / ou controlos negativos adequados 4.
- A quantificação de metástases microscópico e macroscópico
- No ponto final experimental desejada (s), isolar, e colocar imediatamente tecidos nos meios de fixação apropriados. Fix amostras maiores, tais como gonadal intacta, uterino, e depósitos de gordura mesentéricos em 10% de formalina tamponada neutra para 48 h a 4 ° C. Fix amostras mais pequenas (e gordura omental splenoportal, bem como os equivalentes de tecido uterino e de gordura mesentérica) em 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 2-16 h.
- Alternativamente, pressão congelar tecidos, colocando-os em um meio de congelamento, como outubro e cair em uma quantidade adequada de nitrogênio líquido.
- Transferência de tecidos para armazenamento de etanol e 70% fixado a 4 ° C até ser embutido em parafina. Incorporar e tecido processo como descrito em 3.2 e 3.3.
- Utilizar a secção corada com H & E para avaliar os tecidos quanto à presença ou ausência de metástases microscópicos (isto é, conjuntos de 50 células). Confirme tele presença de metástases microscópicas por um método secundário, como uma mancha de IHC para cytokeratin 18/8 para detectar células de câncer de ovário.
- No ponto final experimental desejada (s), isolar, e colocar imediatamente tecidos nos meios de fixação apropriados. Fix amostras maiores, tais como gonadal intacta, uterino, e depósitos de gordura mesentéricos em 10% de formalina tamponada neutra para 48 h a 4 ° C. Fix amostras mais pequenas (e gordura omental splenoportal, bem como os equivalentes de tecido uterino e de gordura mesentérica) em 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 2-16 h.
7. Láctea Mancha Colonização Ex Vivo
- Estabelecimento de ex vivo de órgãos omental condições básicas de cultura
- Colocar cada omento numa única pastilha e placa de cultura lugar dentro de um poço de uma placa de cultura de tecido de doze poços contendo 500 uL de DME meio / F12 contendo 20% de FCS. Manter culturas de órgãos a 37 ° C em ambiente de CO2 a 5% durante 24 a 48 h e / ou pontos de tempo adicionais. Use três omentos independente (amostras em triplicado) para cada condição (por exemplo, tipo de mídia / ponto de tempo).
- Para confirmar a integridade dos tecidos nas extremidades experimentais, corrigir e amostras do processo, tal como descrito no Passo 3. Contando saudável contra adipócitos necróticas nas secções H & E podem avaliar a integridade do tecido. Um mínimo de ~ 120 células de5 amostras biológicas é necessário formular uma percentagem de tecido vivo 10 presente.
- Para medir a função do tecido, o local omentos (n = 3) em poços separados de uma placa de 24 poços contendo 500 ul de meios DME / F12 com 20% de FCS. Permitir omentos para condicionar os meios de comunicação a 37 ° C em ambiente de CO2 a 5% durante 24 h, e depois remover 250 ul para uso num ensaio ELISA de IL-6 10.
- Ex vivo de co-cultura do omento rato com células SKOV3ip.1-GFP
- Crescer e preparar células fluorescente tag como descrito na seção 4 e ressuspender a uma concentração de 2 x 10 6 células por ml.
- Aplicar ~ 6 ul de o adesivo de tecido para a membrana da lâmina de cultura e permitir que o ar seco. Lava-se a membrana duas vezes com água esterilizada para remover qualquer excesso de adesivo. Air secar as membranas sob uma capa laminar.
- Extirpar cuidadosamente o omentos e anexá-lo ao memb revestida com adesivorane usando uma pinça estéril. Permitir que o tecido de aderir à membrana durante 1 min antes de se adicionar meios de comunicação. Adicionar 500 ul da suspensão de células no topo de cada omento em cada inserção de cultura. Preencher a área em torno da câmara de Transwell com 2,5 ml de meio DME / F-12 10.
- Incubar omentos com suspensão de células durante 6 horas a 37 ° C em ambiente de CO2 a 5%. Cuidadosamente remover e lavar o omentos com ~ 10 ml de PBS. Visualize focos de células de câncer fluorescente usando um sistema de imagem fluorescente apropriado 10.
- Isolar depósitos de gordura peritoneais a partir de ratinhos (como descrito no passo 2.3 - 2.7) injectados com células cancerosas com a etiqueta fluorescente e tecidos lugar imediatas em PBS gelado.
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Representative Results
Identificação e histológica Exame de Peritoneal Fat Depots
A dissecção anátomo bruta permite a identificação de quatro das cinco fontes primárias de gordura peritoneal (Figura 1A). Movendo no sentido horário a partir do topo centro são: o omento (OM; delineado) localizado sobre o estômago e baço, a gordura gonadal (GF) em torno do ovário esquerdo (ov), a gordura uterino (UF) ligado às cornos uterinos (uh) e o mesentério (MEU), fixada no intestino delgado (SI). O ovário (ov), corno uterino (uh), e do intestino delgado (si) são indicados como pontos de referência. A gordura splenoportal (SP) circunda a artéria esplênica e liga o hilo do baço à artéria celíaca (Figura 1B). Finalmente, o omento está ligado ao estômago e pâncreas (Figura 1C). A estrutura grosseira e tamanho relativo destes tecidos é mostrada na Figura 1D. O exame histológico do the tecidos mostra que splenoportal e gordura omental conter leitoso local [MS] estruturas na periferia do tecido, rodeado por adipócitos [A]; uterina, gonadal, e gordura mesentérica não (Figura 1E).
Milky identificação local utilizando Giemsa Coloração
Para possibilitar a comparação de conteúdo global local leitoso entre diferentes linhagens de camundongos, o volume local e área leitoso presente em omentos indivíduo foi quantificada utilizando um novo método. Tal como descrito em Métodos, um "conjunto de montagem digitais" do omentos foi construído por coloração cada terceira secção de tecido numa solução de Giemsa 5% e a captação de imagens dos tecidos corados (Figura 2A). Manchas esbranquiçadas aparecem como regiões de coloração azul escuro (Figura 2B). A identidade destas regiões como manchas leitosas foi confirmada em cortes seriados por ambos H & E e IHQ para as células positivas para CD45, um marcador de linfócito comum (
Avaliação quantitativa e qualitativa da colonização câncer de omento
Um método baseado em citometria de fluxo foi desenvolvido a fim de quantificar o número de células cancerosas presentes em depósitos de tecido adiposo após injecção intraperitoneal. Este protocolo é especialmente útil para estudar medidas de colonização iniciais do processo metastático. Por exemplo, na Figura 3A, as células ID8-tdTomato foram preparadas e injectadas intraperitonealmente em ratinhos C57BL / 6. Aos 7 dias pós-injecção (dpi), os órgãos adiposo foram recolhidas e dissociadas numa suspensão de células individuais como descrito nos Métodos. O número de tdTomato cells foi quantificada por citometria de fluxo (Figura 3A, esquerda). O omento mostrou um aumento de aproximadamente 12 vezes no número de eventos tdTomato-positivos, em relação ao PBS injectados controlos (Figura 3A, à direita), mas não houve aumento significativo em preparações de células a partir da gordura das gónadas, gordura uterina, ou mesentério . Uma abordagem qualitativa complementar à base de IHC também mostrou que 7 dias após a injecção ip de células SKOV3ip.1, lesões celulares de cancro comparáveis foram observados tanto em gordura omental e splenoportal (Figura 3B). IHC para pan-citoqueratina humana (pan-CK) confirma a presença de células cancerosas dentro das manchas esbranquiçadas. A especificidade da coloração IHC foi confirmada utilizando uma IgG de controlo para o anticorpo pan-citoqueratina (Figura 3B). ID8 colonização do cancro do ovário de depósitos de gordura peritoneal foi avaliada utilizando murganhos C57BL / 6 a 7 ppp. Lesões de células do cancro grandes nas manchas esbranquiçadas, tanto do omento e gordura splenoportal estão foraalinhado. Pequenos grupos de células cancerosas foram ocasionalmente observados em outros depósitos de gordura, tal como ilustrado na inserção do painel. Assim, pode-se aceder a ambos o número relativo de células e localização dentro de um determinado tecido.
Ex ensaio in vivo para estudar a colonização do cancro do ovário de manchas esbranquiçadas
A fim de resolver as limitações de condições in vivo, mantendo a composição do tecido e arquitetura, otimizamos uma abordagem ex vivo para estudar a colonização de células de cancro do ovário de tecidos omentais. Tecidos omentais inteiras excisados de ratinhos com sucesso são cultivadas ex vivo para estudar a interação do cancro do ovário com manchas esbranquiçadas. Células SKOV3ip.1-GFP foram semeadas sobre os tecidos ex vivo omental cultivadas e mantidas a 37 ° C durante um período de 6 h. Células fluorescentes positivas para GFP em focos eram visíveis discreto tanto em ex vivo e in vivo (Figura 4A). Em ambas as condições, verificação histológico utilizando coloração de H & E confirmou a localização de células de câncer de manchas esbranquiçadas (Figura 4B). Mancha de confirmação usando cytokeratin mancha para as células cancerosas mostrou a presença de focos de células de câncer dentro das manchas esbranquiçadas (Figura 4C). Estes dados demonstram a possibilidade de utilizar abordagens ex vivo para estudos baseados em mecanismos para complementar os resultados in vivo.
Figura 1. As posições relativas e as estruturas principais de depósitos adiposos peritoneais. (A) A dissecção anátomo bruto que mostra a localização relativa dos quatro das cinco fontes primárias de gordura peritoneal. O omento (OM; delineado), gordura gonadal (GF), gordura uterino (UF), mesentério(MEU), ovário (OV), cornos uterinos (UH), e intestino delgado (SI) são mostradas (B) de gordura Splenoportal (SP; descrito). Exposto, levantando o baço com uma pinça (C) O omento rato mostrado dissecados. livre do pâncreas para melhorar a visualização D:. tamanhos e estruturas de gordura peritoneal extirpado relativa; mesentério é mostrado ligado à raiz do mesentério. E. avaliação histológica de gordura peritoneal para a presença de manchas esbranquiçadas (A) adipócitos, (MS) local leitoso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. abordagem baseada-Giemsa para quantificar manchas esbranquiçadas no tecido omental. (UMA); Imagem da seção de todo omento coradas com Giemsa. Cortes seriados de tecido omental avaliadas por: coloração (B) Giemsa; manchas leitosas são indicadas com setas pretas (C) coloração de H & E.; e, (D) IHC utilizando o anticorpo anti-CD45 para identificar linfócitos dentro da estrutura de mancha leitosa. A barra de escala é a mesma para BD e denota 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. As células de câncer de ovário colonizar preferencialmente gordura peritoneal que contém manchas esbranquiçadas. Análise de citometria de fluxo de omento (OM), gordura uterino (UF), gordura gonadal (GF), e mesentério (MY), colhidas a partir de ratinhos em 7 dpi de ID8- células tdTomato (esquerda). Os dados são apresentadoscomo fold-change aumento de células tdTomato-postive sobre ratos injectados com PBS (direita). As barras de erro indicam o erro padrão da média. ** Indica p <0,01 em comparação com controlos de PBS. (B) Exame de tecidos por ambos histologia padrão e IHC mostra colonização comparável de manchas esbranquiçadas em ambos omento e gordura splenoportal (após a injeção de 1x10 6 células SKOV3ip.1 em ratinhos nus). As secções foram avaliadas por coloração H & E. A presença de células epiteliais (células cancerosas) dentro das lesões foi confirmado por detecção de IHC cytokeratin usando um pan-citoqueratina (pan-CK) anticorpo. IHC utilizando um anticorpo de isotipo de IgG para pan-citoqueratina foi usada como um controlo para a especificidade da coloração. A barra de escala é a mesma para todas as imagens e denota 100 mm. (C) Avaliação da colonização ID8 cancro do ovário de depósitos de gordura peritoneal em camundongos C57BL / 6 a 7 dpi. Por favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Ex vivo colonização de células de cancro do ovário para o omento. As colunas representam uma comparação das três condições experimentais que mostram omentos naïve (à esquerda), omentos de camundongos 6 horas após a injecção ip de 1 x 10 6 células SKOV3ip.1 (centro) e omentos com SKOV3ip.1-GFP colonizada ex vivo sob condições (à direita). Omentos Naïve (Branco), omentos colonizada por SKOV3ip.1-GFP do ensaio in vivo (anexo in vivo) ou omentos colonizada por SKOV3ip.1-GFP em condições de cultura ex vivo (anexo ex vivo). Imagens de fluorescência de todo omentos para GFP mostra padrão semelhante para a colonização in vivo e ex vivo, os ensaios (A). H & E coloração de cortes seriados deomentos a partir do painel A confirma a presença de células cancerosas localizadas nas manchas leitosas (B). Cytokeratin para células de cancro do ovário valida a H & E coloração (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O desenvolvimento de terapias para direccionar células disseminadas requer uma compreensão mecanicista da colonização metastático, o primeiro passo crítico no desenvolvimento da doença peritonial. Para tratar dessas questões que relatamos abordagens que podem ser usadas para discernir como composição do tecido exclusivo do omento e arquitetura promover o cancro do ovário colonização metastática. Características distintivas da nossa abordagem são: 1) o foco em eventos precoces no processo de colonização; 2) comparação dos depósitos contendo spot e adiposas deficiente leitoso; 3) disponibilidade de uma técnica reprodutível para quantificar o volume mancha leitosa nos tecidos; 4) a disponibilidade do complemento in vivo e ex vivo abordagens para avaliar a colonização de células do cancro do ovário de estruturas local leitosas.
Na condução dos estudos chegamos a perceber que pesquisadores freqüentemente não estão cientes da localização do omento do mouse e da existência do splenoportal banda de gordura, o que serve como uma segunda fonte de gordura láctea peritoneal contendo local. Embora as técnicas aqui descritas permitir estudos de passos na colonização metastático, que só oferecem "instantâneos" de estes processos, e não de avaliação de colonização em tempo real. Se seguido de forma adequada, como os protocolos descritos devem produzir resultados reprodutíveis para uma variedade de investigadores. Fundamental para o sucesso dessas técnicas são: 1) Identificar e dissecando a tecidos adiposos peritoneal específicas como a contaminação por outros tipos de tecidos, distorcem dados quantitativos obtidos a partir de citometria de fluxo; e 2) Implementação de estirpes adequadas de camundongos transgênicos para o estudo em questão. Deve notar-se que os estudos de curso de tempo deve ser determinada para linhas de células individuais. Empiricamente, pois depende de uma variedade de fatores, incluindo a taxa de proliferação, hora de tomar tumor e ocorrência de metástases.
Além dissecando a interaCÇÕES de linhas celulares de cancro do ovário bem estabelecidos e o seu microambiente omental que são importantes para a formação de metástases, a técnica aqui descrita pode também ser utilizada para avaliar o potencial maligno de linhas celulares derivadas clinicamente que recapitulam alterações moleculares iniciais em carcinomas intraepiteliais tubária serosas na fímbrias das trompas de falópio 12-17. Embora uma via para a progressão destas lesões molecular está a emergir, em estudos in vivo são necessários para determinar a significância biológica de alterações específicas. Complementar in vivo e ex vivo ensaios podem ser utilizados para avaliar a colonização em passos específicos do tecido omental metastático de tais linhas de células de modelo precursor informação adquirida a partir de estudos pode ser a chave para a geração de hipóteses terapêuticos e a concepção de novos estudos pré-clínicos.
Identificando os mecanismos que controlam a colonização metastático pode permitir a prevençãoou o controlo de formação de metástases. Por exemplo, as mulheres que estão em maior risco de desenvolver câncer de ovário 18-22 (ou seja, portadores da mutação BRCA1 ou BRCA2), muitas vezes submetidos a profilático salpingooforectomia para reduzir o risco de desenvolver a doença peritoneal 23,24. Infelizmente, os pacientes muitas vezes ainda desenvolver HGSC devido ao crescimento de células de câncer de ovário presentes no omento e outros sítios metastáticos no momento da cirurgia. Identificação de agentes que rompem o tecido omental microambiente poderia impedir a localização de células de cancro e / ou o crescimento dentro do omento. Tais abordagens poderiam potencialmente ser usado em combinação com agentes terapêuticos que têm como alvo células de cancro do ovário para prevenir a formação de metástases ou suprimir o crescimento do cancro (depois citorredução cirúrgica).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
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