Abstract
고급 장 액성 난소 암 (HGSC)는 광범위한 복막 전이의 원인은 매우 불량한 예후를 계속; 여성의 적은 수의 30 % 이상 5 년 진단 후 생존. 그물막은 HGSC 전이 형성의 바람직한 위치이다. 이 미세 환경의 임상 적 중요성에도 불구하고, 난소 암의 진행에 대망 지방 조직의 기여도는 파악 하였다 남아있다. 이 혈관의 밀도가 둥지를 둘러싼 우유, B, T 구성되어 관광 명소, 그리고 NK 세포, 대 식세포 및 전구 세포로 알려진 구조를 포함한다는 점에서 대망 지방은 이례적인 일이다. 밀키 명소 복막 항상성에 필요한 대망의 생리적 기능에 중요한 역할을한다. 우리는 우유 반점도 복막 지방의 난소 암 전이성 식민지, 복막 전이의 개발에 중요한 단계를 촉진하는 것으로 나타났습니다. 여기에서 우리는 접근 방식은 우리가 평가하고 당에 우유 명소를 정량화하기 위해 개발 된 기술지방을 itoneal 및 생체 내 및 생체 외 모두 대망 조직의 난소 암 세포 전이 식민지에 자신의 기능 기여를 공부합니다. 따라서 이러한 접근법은 광범위한 복막 전이 개발 밀키 스폿 구조로 세포의 초기 위치 파악에서 난소 암 전이 형성의 연구를 가능하게 마우스 모델 세포주를 추가로 일반화된다.
Introduction
대부분의 고형 종양과는 달리, 고급 장 액성 난소 암 (HGSC)에서 전이는 복강 1로 제한됩니다. 따라서, 효과적인 복막 치료는 잠재적으로 제어하거나 HGSC을 근절 할 수있다. 현재, 표준 치료 방법은 화학 요법 1-3 결합 외과 cytoreduction이다. 불행하게도, 환자의 대부분은 경험과 질병 재발의 합병증에 굴복. 이러한 실력 통계 전이성 콜로니의 이해를 향상에 대한 요구를 표시, 처리되는 암세포는 활용하고, (2) 전이를 형성하는 호스트 조직 내 증식 지역화.
대망는 HGSC 전이 4-7의 바람직한 초기 사이트입니다. 다른 복막 지방 달리, 장간막 지방 조직은 복막 homeos있는 중요한 역할을하는 B, T 및 NK 세포 및 대식 세포를 포함하는 유백색의 반점으로 알려진 특이한 면역 구조를 포함TASIS 8,9. 자신의 생리적 기능에 더하여, 우리는 우유 빛 반점이 난소 암 전이 식민 4에 적극적인 역할을한다는 것을 발견했다. 빠르게 홈 우유 명소 난소 암 세포, 세포가 분비 화성 인자쪽으로 이동하는 것을 제안, 실험 전이 분석, SKOV3ip.1, CaOV3 및 HeyA8 (인간)과 ID8 (C57BL / 6 쥐)에서. 흥미롭게도, 암 세포는 우유 반점 (즉, 성선 및 자궁 지방) 4 부족 복막 지방을 식민지화하지 않습니다.
유백색 스폿 정착 조절 메커니즘을 파악하기 위해, 우리는 전이성 콜로니 4 시간 과정을 통해 세포 및 분자 사건의 심문을 가능 이종 이식 모델을 최적화하고있다. 여기에 기술 된 방법의 구체적인 장점은 완전히 생체 내에서 통합 및 m의 생체 모델에서 사용자가 가설을 테스트 할 수 있습니다 조직의 구조와 기능에 대한 강조이다etastatic 식민지 4,10. 포함 또는 유백색 스폿 부족하거나 복막 지방 저장소에 암세포 지역화 및 성장을 비교함으로써, 연구자들은 숙박과 생리 관련 조직의 난소 암 세포의 점진적인 성장 밀키 스폿 내의 지방 세포와 세포의 상대적 기여도 (들)을 시험 할 수있다.
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Protocol
모든 마우스는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 시카고 동물 자원 센터의 대학의 감독하에 따라, 보관 유지 안락사시켰다.
실험 연구 1. 준비 동물
- 동물 운송 및 취급의 잠재적 인 생리 학적 효과를 복구하는, 새로운 주택 및 환경에 적응하도록 허용합니다.
참고 : 다음 기술은 마우스의 모든 시판 균주에 적용 가능하다. 실험에 사용되는 동물의 수는 연구 설계에 의존하고 통계로부터 상담 끝나야한다.
2. 식별 및 복막 지방 종점의 분리.
- 이산화탄소 과다 복용과 사망을 확인하는 보조 물리적 방법을 통해 동물을 안락사.
- 수확 복막 지방 저장소와 같은 내부 장기의 제거 (보조 방법), 엄마 구성KE 내부 장기 (그림 1A)를 노출하는 복막 벽을 통해 사타구니 유두에 가까운 중간 선 절개.
- 대망 지방 (OM)의 경우, 집게 (그림 1C)로 복강에서 비장을 확장하여 대망 / 췌장 복잡한 노출됩니다. 밀접하게 모든 조직 연결을 트리밍하여 췌장 및 비장에서 대망을 놓습니다. 남아있는 췌장 조직이 4 절제되어 있는지 확인합니다.
- 생식소 지방 (GF)의 경우, 조직의 연결 (그림 1A 상단에 적합한 올바른 T) (4)를 절단하여 난소와 소비세를 둘러싼 성선 지방을 들어 올려 집게를 사용합니다.
- 자궁 지방 (UF)의 경우, 조직의 연결을 절단하여 자궁 뿔과 소비세를 둘러싼 자궁 지방 들어 올려 집게를 사용하여 (그림 1A를 오른쪽) 4.
- 장간막 지방 (MF)를 들면, 소장과 유문 간의 접합을 잘랐다. 집게 단단히 그립의 끝을에 사용소장하고 멀리 장간막 지방에서 천천히 "껍질". 해부 가위를 사용하여 장간막 루트에서 장간막 지방 릴리스 (그림 1A 왼쪽) 4.
- Splenoportal 지방 (SF)의 경우, 췌장, 비장의 폐문 연결 조직의 얇은 지방산 밴드를 노출하는 집게를 사용하여 비장의 선단을 들어. 먼저 비장에서 해부 조심스럽게 다음 췌장에서 해제,에 의해 splenoportal 지방 소비세 (그림 1B) 4.
김사 염색을 사용하여 3. 밀키 스팟 확인
- 소비세 omenta C57BL / 6 마우스에서 16 시간 동안 4 ° C (O / N)에서 5 % 중성 포르말린에 고정 (2.3 단계를 참조하십시오).
- 고정 된 조직을 파라핀 매립 들어, 조직의 크기에 적합한 몰드를 선택한다. 주형을 채우기 위해 파라핀 저장소로부터 용융 파라핀을 붓는다. 카세트를 열고 따뜻한 사용CEPS, 금형에 조직을 전송합니다.
- 신중 종단면을 생산 중에 매립 파라핀 조직의 방향. 제자리에서 성형 및 프레스를 통해 표시된 조직 카세트를 놓습니다. 곰팡이가 적어도 30 분 동안 냉각 시키십시오.
- 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 블록에서 (4 μm의 두께) 시리얼 부분을 잘라. 조직의 리본 파라핀 블록 떨어져 온다 섹션에서 미리 세정 슬라이드를 놓습니다.
- 직렬 섹션 전체 대망; 수집 김사 얼룩 (3.6 참조)에 대한 모든 세 번째 섹션을 얼룩. 실온에서 O / N 바람직하게는, 공기 건조에 섹션으로 유리 슬라이드를 허용합니다. 말린 슬라이드 고정을위한 준비가되어 있습니다. 김사 염색 슬라이드에 비교를 위해 헤 마톡 실린 및 에오신에 대한 첫 번째 섹션 얼룩.
- 자일 렌에서 두 개의 연속 5 분 배양하여 슬라이드를 Deparaffinize. 다음의 두 개의 연속 배양에 의해 슬라이드를 재수 : 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 마지막 WA를 탭터.
- 건조에서 슬라이드를 방지하기 위해 적절한 조치를 취하십시오. 실온에서 모든 단계를 수행합니다.
- 완전 5 % 김사 솔루션을 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 담그고 실온에서 4 분 동안 품어 (수돗물에서 제조 된 V / W). 공기 건조, 60 초 동안 수돗물에 슬라이드를 씻어 설치 미디어를 사용하여 coverslip에 마운트.
- 이미지 제조 업체 소프트웨어와 전체 슬라이드 스캐너 및 프로세스를 사용하여 염색 슬라이드. ImageJ에 소프트웨어 (4)를 사용하여 김사 염색 대망 섹션의 우유 자리 볼륨을 정량화.
생체 내 및 생체 외 연구 난소 암 세포의 4. 전파 및 준비
- 열 욕조에 37 ° C의 세포 성장 매체의 사전 따뜻한 15 ml의. 세포주, 통로 번호, 날짜 및 동결 스톡을 제조하는 사람의 이름, 날짜 표시하여 적절한 크기의 조직 배양 플라스크 (예를 들어, 75cm 2 표면적)을 제조와 사람 세포를 도금 / 해동 누가.
주의 : 아래 동결 통로 번호 날짜 전이성 표현형에 영향을 미칠 수 있기 때문에 전이의 연구에서, 이러한 상세한 내용은, 매우 중요하다. - 생물학적 안전 후드, 피펫 T-75 배양 플라스크에 배지 10 ㎖의 멸균 환경을 사용. 액체 질소 시스템에서 셀의 유리 병을 제거하고 세포 유형을 확인하기 위해 라벨을 참조. 37 ° C 열 욕에서 예열하여 한번에 하나의 셀의 바이 얼을 해동.
- 멸균 기법을 사용하여, 피펫 1 × 6은 배양 플라스크에 세포를 해동. 세포 부착 할 수 있도록 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다. 부드럽게 균일 한 세포 현탁액을 형성 앞뒤로 플라스크를 흔들어.
- 조직 문화 인큐베이터에서 플라스크를 놓고 CO 2 환경 5 %에서 37 ℃로 유지한다. 세포는 O / N을 준수하도록 허용합니다.
- 대기음 매체는 신선한 사전 예열 성장 용지로 교체합니다. 인큐베이터 모두에 플라스크를 배치유동 세포는 성장한다. 거꾸로 현미경을 사용하여 2-3 일마다 육안 검사에 의해 매일 세포의 성장을 모니터링합니다. 70-80% 합류 통로에 도달하면 세포 표준 세포 배양 기술을 사용한다.
참고 : 실험 분석은 세포가 활발하게 확산되는 것을 보장하기 위해 70 %의 합류에 세포를 수확. - 배양 배지를 흡인하고 멸균 인산 완충 식염수 10 ㎖ (PBS)로 헹군다. 대기음 PBS 및 0.25 % 트립신 / EDTA (75cm 2 표면적 2-3 ml)에 추가하고 37 ºC에서 5 분 동안 배양한다. 시각 세포가 분리 된 것을 확인하고 성장 배지의 동일한 양을 추가하고 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득 상하 세포를 피펫.
참고 : 그것은 트립신을 불 활성화로 성장 배지는 혈청을 포함하는 것이 중요하다. 후속 단계에서 세포의 손실을 보상하기 위해 소정의 실험에 필요한 수보다 많은 세포를 4 배 이상 -2- 준비 - 생존 세포의 백분율을 결정hemacytometer 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 트리 판 블루 배제 분석을 통해 서스펜션.
참고 : 여기에, 단지 세포의 ≥ 96 %가 생존하는 세포 제제를 사용합니다. - 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 플라스크에서 세포 현탁액을 전송. 4 O ℃에서 1,100 XG에서 5 분 원심 분리하여 펠렛 세포
- 상등액을 흡인하고 용액 당 2 × 106 세포의 농도로 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁.
세포의 5 복강 내 주사
실험에서, 마우스는 분명히이 기술을 설명하기 위해, 병원체 노출 위험을 제한하기 위해 우리의 배리어 시설 내의 층류 또는 바이오 캐비닛 처리 첨부 영상 절차 승인 실험실에서 수행 하였다 : 참고 동물의 작업. 이 특별한 기술은 마취로 동물을 필요로하지 않습니다. 승인 된 프로토콜에 따라,이 techniq을 수행살아있는 동물에 UE. 이 연구를 위해 쥐의 적절한 균주를 사용합니다. 예를 들어 인간의 난소 암 세포 (SKOV3ip.1 및 HeyA8) 식민지의 연구 면역, 무 흉선 누드 마우스를 사용; 마우스 난소 암 세포 (ID8) 식민지의 연구 면역 C57BL / 6 마우스를 사용합니다.
- 로드 (500) 주사기로 단일 세포 현탁액의 μL 및 멸균 덮인 25 G 바늘에 넣어. 이 주입하기 전에 셀 전단을 줄일 수 있습니다.
- 목의 목덜미에 의해 마우스를 들고 손바닥과 집게 손가락을 사용하여 꼬리를 잡고 링 (마우스를 왼손으로 억제) 새끼 손가락 사이의 왼쪽 뒷다리를 해결.
참고 :으로 충격을 복부 장기를 피가 주입하는 동안 이동할 수 있도록 잘 마우스를 억제하기. - 바로 무릎 위 복부에 걸쳐 라인을 상상하고, 동물의 오른쪽에있는 점을 찾아 중간 선 부근에 있습니다. 항목의 점에 두개골 약간 내측입니다마지막으로 젖꼭지의.
참고 : 마우스의 오른쪽에있는 바늘을 삽입하는 맹장을 방지하고 장 (11)을 천공의 위험을 줄일 수 있습니다. - 약 0.5 cm의 깊이로 쥐의 복부의 하부 측면 부분에 바늘을 삽입합니다. 바늘이 혈관 또는 다른 복막 기관에 침투되지 않았 음을 확인하기 위해 플런저를 다시 잡아 당깁니다.
- 유체가 흡입하는 경우 주사기 (샘플) (11)를 폐기합니다. - 녹색 갈색 또는 노란색 흡인 각각 장 또는 방광에 바늘 침투를 나타냅니다.
- 느리고, 지속적인 압력을 사용하여 샘플을 주입. 바늘을 철회하고 케이지에 마우스를 반환합니다. 날카로운 물건 용기에 처분하기 전에 주사기를 정리해하지 마십시오.
- 특정 시점에서의 CO 2 질식 및 중요한 기관의 제거를 통해 희생 마우스는 주사를 게시합니다.
생체 6. 밀키 자리 식민지
- Quantita우유 명소 암 세포 현지화의 기 흐름 세포 계측법을 사용하여
- (단계 2.3에 설명 된대로 - 2.7) 마우스에서 복막 지방 저장소를 분리은 찬란 주사 얼음처럼 차가운 PBS에 암 세포와 즉각적인 장소 조직 태그.
- 이 특정 기술의 경우, 체중 경기 대망의 모든 지방 지방 조직. 전사 조직은 무 혈청 DMEM 1.5 ml의 0.1 % (w / v)의 소 혈청 알부민을 함유하는 5 ㎖ 튜브를 분리하는 것. 3 개의 독립적 인 생쥐에서 수확 풀 조직은 유동 세포 계측법에 대한 세포의 충분한 수율을 보장합니다.
- 수술 용 가위를 이용하여 추가 민스 조직 (/ V W)는 콜라게나 I. 회전 혼합하면서 30 분 동안 37 ℃에서 조직 현탁액을 부화 0.4 %를 함유하는 무 혈청 DMEM 1.5 ml의.
- 선택적인 단계로, 더 저작으로 조직을 끊을. 이 경우에, 회전 방향을, 낮은 10 분간으로 저작, microstomacher 가방에 콜라게나 조직 현탁액을 전송할5 분 후 가방.
- 나일론 메쉬 필터 (60 μm의 기공)을 통해 필터 샘플은 큰 이물질을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에서 원심 분리를 통해 세포를 수집하여 상청액 분획을 폐기.
- ACK 용해 완충액 900 μL와 결합 PBS 100 ㎕에 세포 펠렛을 재현 탁하고 1 분 동안 RT에서 배양한다. 250 XG에 원심 분리기 세포 5 분 동안 상층 액을 버린다.
- 빙냉 PBS 250 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 60 μm의 세공 나일론 메쉬를 통해 샘플을 필터링. 얼음처럼 차가운 PBS 250 μL와 필터를 씻어.
- 사이토 561 nm의 옐로우 - 그린 레이저를 구비 한 흐름 및 585 ㎚ / 15 nm의 대역 통과 필터를 이용하여 인구 형광 태그 된 세포의 수를 정량. 부모의 세포 및 / 또는 적절한 음성 대조군 (4) 분석을 기반으로 tdTomato 양성 세포에 대한 게이트를 설정합니다.
- 현미경과 거시적 인 전이의 정량
- 원하는 실험 엔드 포인트 (들)에서 분리, 즉시 적절한 고정 매체에 조직을 배치합니다. 이러한 그대로 성선, 자궁, 4 ℃에서 48 시간 동안 10 % 중성 포르말린에 장간막 지방 저장소와 같은 더 큰 샘플을 수정합니다. 2-16 시간 동안 4 ° C에서 5 % 중성 완충 포르말린에 (자궁 및 장간막 지방의 대망과 splenoportal 지방뿐만 아니라 조직에 상응하는) 작은 샘플을 수정합니다.
- 대안 적으로, 스냅 10월 같은 동결 배지에 넣어서 조직을 냉동 및 액체 질소의 적당량으로 드롭.
- 전송 파라핀에 삽입 할 때까지 4 ° C에서 70 % 에탄올 및 저장에 조직을 고정. 3.2 및 3.3에 기술 된 바와 같이 삽입 및 공정 조직.
- 미세 전이의 유무에 대한 조직을 평가하기 위해 H & E 염색 섹션을 사용하여 (즉, 셀 (50)의 클러스터). T 확인그는 이러한 cytokeratin 8/18에 대한 IHC 얼룩 등의 보조 방법으로 미세 전이의 존재는 난소 암 세포를 탐지한다.
- 원하는 실험 엔드 포인트 (들)에서 분리, 즉시 적절한 고정 매체에 조직을 배치합니다. 이러한 그대로 성선, 자궁, 4 ℃에서 48 시간 동안 10 % 중성 포르말린에 장간막 지방 저장소와 같은 더 큰 샘플을 수정합니다. 2-16 시간 동안 4 ° C에서 5 % 중성 완충 포르말린에 (자궁 및 장간막 지방의 대망과 splenoportal 지방뿐만 아니라 조직에 상응하는) 작은 샘플을 수정합니다.
7. 밀키 스팟 식민지 전의 VIVO
- 기본 생체 대망 장기 배양 조건 확립
- 20 % FCS를 포함 DME / F12 매체의 500 μl를 포함하는 열두 웰 조직 배양 플레이트 잘 하나에서 하나의 문화 판의 삽입과 장소에 각각의 대망을 놓습니다. 24 ~ 48 시간 및 / 또는 추가 시점에 대한 5 % CO 2의 환경에서 37 ° C에서 기관 배양 물을 유지한다. 각 조건 (예를 들어, 미디어 타입 / 시점)에 대한 3 개의 독립적 인 omenta (세중 샘플)를 사용합니다.
- 조직의 무결성을 평가할 수 H & E 부분에 괴사 지방 세포에 비해 건강한 계산 3 단계에 설명 된대로 수정하고 프로세스 샘플, 실험 엔드 포인트에서 조직의 무결성을 확인합니다. 에서의 최소 ~ 120 세포생물학적 시료 5 10 본 살아있는 조직의 비율을 수립 할 필요가있다.
- 조직 기능, 20 % FCS와 DME / F12 매체의 500 μl를 포함하는 24 웰 플레이트의 별도의 우물에서 장소 omenta을 (N = 3)를 측정합니다. omenta 24 시간 동안 5 % CO 2 환경에서 37 ° C에서 미디어를 조정 할 수 있도록 허용하고 IL-6 ELISA 분석 (10)에 사용하기 위해 250 μl를 제거합니다.
- SKOV3ip.1-GFP 세포와 마우스 복막의 생체 공존 배양
- 성장과 ml의 당 2 × 10 6 세포의 농도 섹션 4에 resuspend에 설명 된대로 찬란 태그 세포를 준비합니다.
- 문화 삽입의 막에 조직 접착제 ~ 6 μl를 적용하고 공기 건조에 있습니다. 과도한 접착제를 제거하기 위해 멸균 물을 두 번 막 씻으십시오. 공기 층류 후드 아래에있는 세포막을 건조.
- 조심스럽게 omenta을 절제하고, 접착제 코팅 MEMB에 첨부RANE 멸균 집게를 사용. 조직이 이전에 미디어를 추가로 1 분 동안 멤브레인을 준수하도록 허용합니다. 각 배양 인서트의 각 대망의 상부에 세포 현탁액 500 μl를 추가. DME / F-12 (10) 2.5 mL로 트랜스 웰 챔버 주위를 채 웁니다.
- 5 % CO 2의 환경에서 37 ℃에서 6 시간 동안 세포 현탁액 omenta 배양한다. 조심스럽게 제거하고 PBS ~ 10 ㎖를 가진 omenta을 씻는다. 적절한 형광 이미징 시스템 10을 이용하여 형광 암세포 병소를 시각화.
- (단계 2.3에 설명 된대로 - 2.7) 마우스에서 복막 지방 저장소를 분리은 찬란 주사 얼음처럼 차가운 PBS에 암 세포와 즉각적인 장소 조직 태그.
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Representative Results
복막 지방 종점의 식별 및 조직 학적 검사
총 해부학 적 절개는 복막 지방 (그림 1A)의 다섯 가지 주요 자료의 네 식별 할 수 있습니다. 상단 중앙에서 시계 방향으로 이동 : 대망 (OM, 설명) (어) 왼쪽 난소 (OV), 자궁 지방 (UF)가 자궁 뿔에 연결된 주변 위장과 비장, 성선 지방 (GF) 위에 위치 및 장간막는 (내) 소장 (SI)에 연결합니다. 난소 (OV), 자궁 (어), 소장 (SI)를 참조 점으로 표시됩니다. splenoportal 지방 (SP)는 비장 동맥을 둘러싸고 복강 동맥 (그림 1B)에 비장의 폐문을 연결합니다. 마침내 대망은 위와 췌장 (도 1C)에 부착된다. 이들 조직의 총 구조 및 상대 크기는도 1d에 도시되어있다. 제의 조직 학적 검사를전자 조직 splenoportal과 대망 지방이 지방 세포 [A]로 둘러싸인 조직 주변에서 우유 지점 [MS] 구조를 포함하고 있음을 보여줍니다; 자궁, 성선 및 장간막 지방은하지 않습니다 (그림 1E).
김사 염색을 사용하여 밀키 자리 식별
다른 마우스 균주, 우유 지점 볼륨과 개인 omenta에 존재하는 영역 사이의 전체 우유 자리 콘텐츠의 비교를 가능하게하는 새로운 방법을 사용하여 정량 하였다. 방법에서 설명한 바와 같이, omenta의 "디지털 전체 산"은 5 % 김사 용액 조직의 매 세 번째 부분을 염색 조직 염색 (도 2A)의 화상을 촬영하여 구성 하였다. 밀키 반점은 어두운 청색 (그림 2B)을 오염 지역으로 나타납니다. 우유 반점이 지역의 정체성은 CD45, 공통의 림프구 마커 (양성 세포 모두 H & E 염색과 IHC에 의해 직렬 섹션에서 확인되었다
대망의 암 식민지의 양적 및 질적 평가
유동 세포 계측법 기반 방법은 복강 내 주사 후 지방 저장소에 존재하는 암세포의 수를 정량하기 위하여 개발되었다. 이 프로토콜은 전이 과정의 초기 정착 단계를 공부에 특히 유용합니다. 예를 들어,도 3a에, ID8-tdTomato 셀 제조하고 C57BL / 6 마우스에 복강 내 주사. 7 일 포스트 분사 수 (dpi)에, 지방 기관 수확 및 방법에서 설명한 바와 같이 단일 세포 현탁액 내로 해리. tdTomato 가전의 수LLS 유동 세포 계측법 사용하여 정량 하였다 (그림 3A, 왼쪽). 그물막은 tdTomato 양성 이벤트의 수가 약 12 배의 증가를 보여 주었다, PBS-상대적 대조군 (오른쪽도 3a 등)를 주입하지만, 생식선 지방, 자궁 지방 또는 장간막에서 세포 제제의 유의 한 증가는 없었다 . 상보 질적 IHC 기반 접근법은 또한 7일 SKOV3ip.1 셀의 IP 주입 후, 비교 가능한 암 세포 병변 모두 장간막 지방 및 splenoportal (도 3B)에서 관찰 된 것으로 나타났다. IHC는 인간 cytokeratin 팬 (PAN-CK) 미국 유백색 스팟 내 암 세포의 존재를 확인한다. IHC 염색의 특이성은 팬 cytokeratin 항체 (그림 3B)에 대한 IgG의 컨트롤을 사용하여 확인 하였다. 복막 지방 저장소의 ID8 난소 암 식민지 7 dpi로 C57BL / 6 마우스를 사용하여 평가 하였다. 대망과 splenoportal 지방 모두의 우유 관광 명소 큰 암 세포 병변은 밖으로줄 지어. 삽입 패널에 도시 된 바와 같이 암 세포의 작은 클러스터는 때때로 다른 지방 저장소에 보였다. 따라서, 하나의 주어진 조직 내의 상대적인 세포 수 및 위치 모두에 액세스 할 수있다.
생체 분석은 우유 빛 반점의 난소 암 식민지를 공부
조직 조성물 및 구조를 유지하면서 생체 조건의 한계를 해결하기 위해, 우리는 장간막 조직의 난소 암 세포 집락을 연구 생체 외 방법을 최적화. 마우스에서 적출 항목의 대망 조직이 성공적으로 우유 관광 명소와 난소 암의 상호 작용을 연구하는 생체 전 배양. SKOV3ip.1-GFP 세포는 생체 외에서 배양 된 장간막 조직에 접종하고 6 시간 동안 37 ℃로 유지 하였다. GFP 양성 형광 세포는 모두 생체 외 및 생체 내에서 신중 초점에서 볼 수 있었다 (그림 4A). 두 조건에서, H & E 염색을 이용하여 조직 학적 검증은 우유 빛 반점 (그림 4B)에 암 세포의 지역화를 확인했다. 암세포 cytokeratin 염색을 이용하여 확증 얼룩이 유백색 스폿 (도 4C) 내에서 암세포의 병소의 존재를 보여 주었다. 이러한 데이터는 생체 사용의 가능성이 생체 내 연구 결과를 보완하기 위해 메커니즘 기반 연구에 대한 접근 방식을 보여줍니다.
그림 1. 주요 복막 지방 저장소의 상대적 위치 및 구조. (A) 복막 지방의 다섯 가지 주요 자료의 네 가지의 상대적 위치를 보여주는 총 해부학 해부. 대망 (OM, 설명), 성선 지방 (GF), 자궁 지방 (UF), 장간막(내), 난소 (OV), 자궁 뿔 (어), 작은 창자가 (SI) 표시됩니다 (B) Splenoportal 지방 (SP, 설명). 집게로 비장을 들어 올려 노출 (C) 표시 마우스 대망 해부. 시각화를 향상시키기 위하여, 췌장으로부터 자유로운 D :. 상대적인 크기 및 적출 복막 지방 구조; 장간막이 장간막 루트에 부착 된 표시됩니다. 우유 지점 (A) 지방 세포의 존재에 대한 복막 지방의 E. 조직 학적 평가, (MS) 유백색 자리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대망 조직에 우유 지점을 정량화 2. 김사 기반 접근 방식을 그림. (A); 김사 염색 전체 대망의 섹션의 이미지. 평가 장간막 조직 직렬 섹션 (B) 김사 염색; 우유 빛 반점은 검은 색 화살표로 표시됩니다 (C) H & E 염색.; 와, (D) IHC는 우유 스팟 구조 내에서 림프구를 식별하기 위해 항 CD45 항체를 사용하여. 스케일 바는 BD에 대해 동일 및 100 ㎛이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 난소 암 세포는 우선적으로 우유 지점을 포함 복막 지방을 식민지화. 유세포가 ID8- 7 dpi로 대망 (OM) 마우스에서 수확, 자궁 지방 (UF), 성선 지방 (GF), 및 장간막 (내) 분석 tdTomato 세포 (왼쪽). 데이터 제시PBS 주입 쥐 (오른쪽) 이상 tdTomato-에 postive 세포의 배 변화의 증가로. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. ** 모두 표준 조직 학적으로 조직의 (B) 시험. PBS 컨트롤에 비해 P <0.01를 나타내고 IHC는 대망과 (누드 마우스에 1 × 6 SKOV3ip.1 세포의 주입 후) splenoportal 지방 모두에서 우유 반점의 비교 식민지를 보여줍니다. 섹션은 H & E 염색으로 평가 하였다. 상피의 존재는 내 병변 (암) 세포 cytokeratin 팬 (PAN-CK) 항체를 사용 cytokeratin IHC의 검출에 의해 확인 하였다. 팬 cytokeratin 대한 IgG의 이소 타입 항체를 사용하여 IHC 염색은 특이성을위한 대조군으로 사용 하였다. 스케일 바는 모든 이미지에서 동일하며 100 ㎛이다. 7 dpi 해상도에서 C57BL / 6 마우스의 복강 지방 저장소의 ID8 난소 암 식민지의 (C) 평가. 를 클릭하십시오여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
난소 암 세포의 그림 4. 예 생체 식민지가 대망합니다. 열이 순진한 omenta (왼쪽) 1 × 6 SKOV3ip.1 세포, 마우스의 omenta 6 시간 후 IP 주입 (센터)를 보여주는 세 가지 실험 조건의 비교를 나타낸다 및 SKOV3ip.1-GFP와 omenta는 생체 조건 (오른쪽)에서 식민지. omenta (생체 첨부) 체외 배양 조건에 SKOV3ip.1-GFP의 식민지 생체 내 시험 (생체 내에서 첨부 파일) 또는 omenta에서 SKOV3ip.1-GFP의 식민지 (빈) 순진 omenta. GFP에 대한 전체 omenta의 형광 이미징 (A) 생체 내 및 생체 분석 모두 비슷한 식민지 패턴을 보여줍니다. 직렬 섹션의 H & E 염색패널로부터 omenta은 유백색 스폿 (B)에 국소 암 세포의 존재를 확인한다. 난소 암 세포에 대한 Cytokeratin은 H & E 염색 (C)를 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
파종 세포를 표적으로하는 치료법의 개발은 전이성 식민지의 기계론의 이해, 복막 질환의 개발에 중요한 첫 번째 단계가 필요합니다. 우리가 대망의 독특한 조직 조성 및 구조는 난소 암, 전이성 콜로니를 촉진하는 방법을 식별하는 데 사용할 수있는 방법을보고하는 이러한 문제를 해결하기. 우리의 접근 방식의 구별 기능은 다음과 같습니다 식민지화 과정에서 초기 이벤트 1) 초점; 우유 자리 함유하고 부족한 지방 창고 2) 비교; 3) 재현 기술의 가용성은 조직에서 우유 자리 볼륨을 정량하는 단계; 생체 내 생체 보완 및 4) 가용성은 유백색 현장 구조의 난소 암 세포 식민지를 평가하기 위해 접근한다.
이 연구를 수행에서 우리는 연구자가 자주 마우스 대망의 위치와 SP의 존재를 인식하지 못하고 있음을 깨닫게되었다우유 자리 함유 복막 지방의 두 번째 소스로 제공 lenoportal 지방 밴드. 설명 된 기술은 여기에서 전이성 식민지에서 단계의 연구를 가능하게하지만, 그들은 단지 이러한 프로세스의 "스냅 샷", 그리고 실시간으로 식민지의 평가를 제공합니다. 적절하게 다음 경우 설명 된대로 프로토콜은 연구자의 범위에 재현 가능한 결과를 산출한다. 이러한 기술의 성공에 중요한은 다음과 같습니다 : 1) 식별 및 유동 세포 계측법에서 얻은 정량적 인 데이터를 왜곡 할 다른 조직 유형에 의한 오염으로 특정 복막 지방 조직을 해부; 2) 문제의 연구를위한 형질 전환 마우스의 적절한 변형을 구현. 이것은 시간 과정 연구 개별 세포주에 대해 결정되어야한다는 것을 주목해야한다. 경험적는 증식 속도, 종양 및 전이성 인출 전위 시간을 포함한 다양한 요인에 따라 달라있다.
INTERA 해부 이외에전이의 형성에 중요한 노포 난소 암 세포주 및 그들의 대망 미세 환경의 ctions는, 본 명세서에 기재된 기술은 또한 액성 난관 상피내 암종 초기 분자 변형 요점을 되풀이 임상 유래 세포주 악성 가능성을 평가할 수있다 나팔관 12-17의 fimbriae. 이들 병변의 진행을위한 분자 통로가 대두되고 있으나, 생체 내 연구는 특정 변형의 생물학적 중요성을 결정하기 위해 필요하다. 생체 내 및 생체 내 분석 상보은 정보 치료 가설의 생성 및 추가 전임상 연구의 설계에 중요 할 수있다 연구로부터 수집 이러한 모델 전구체 세포주 장간막 조직 전이성 콜로니의 특정 단계를 평가하기 위해 사용될 수있다.
전이성 콜로니를 식별하는 제어 메커니즘 예방을 가능하게 할 수있다또는 전이 형성의 제어. 예를 들어, 난소 암 18-22 개발을위한 높은 위험에있는 여성은 (즉, BRCA1 또는 BRCA2 유전자 돌연변이 캐리어)는 종종 복막 23,24 질병에 걸릴 위험을 감소시키는 예방 난소 난관 절제술을 겪는다. 불행히도, 환자들은 여전히 인해 복막 수술시 다른 사이트 내에 존재 전이성 난소 암 세포의 생장에 HGSC을 개발한다. 복막 내 암 세포 지역화 및 / 또는 성장을 방지 할 수 대망 조직의 미세 환경을 방해 에이전트의 식별. 이러한 접근법은 잠재적으로 전이 형성을 방지하거나 (수술 용적 축소 후) 암 재성장을 억제하는 난소 암 세포를 표적 치료제와 병용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
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