Abstract
Høyverdig serøs eggstokkreft (HGSC), årsaken til utbredte peritoneal metastaser, fortsetter å ha en ekstremt dårlig prognose; færre enn 30% av kvinnene er i live 5 år etter diagnose. Omentum er en foretrukket område av HGSC metastasedannelse. Til tross for den kliniske viktigheten av dette mikromiljøet, bidraget av omental fettvev til eggstokkreft progresjon forblir studerte. Oment adipose er uvanlig ved at den inneholder strukturer som er kjent som melkeaktige flekker, som består av B, T og NK-celler, makrofager, og progenitor-celler som omgir tett reder av vaskulatur. Melkeaktige flekker spille en nøkkelrolle i de fysiologiske funksjoner av omentum, som er nødvendig for peritoneal homeostase. Vi har vist at melkeaktige flekker også fremme eggstokkreft metastatisk kolonisering av peritoneal adipose, et viktig steg i utviklingen av peritoneal metastaser. Her beskriver vi tilnærminger vi utviklet for å vurdere og kvantifisere melkeaktige flekker i peritoneal adipose og studere deres funksjonelle bidrag til ovarian cancer metastatisk celleKolonIserIngen av omentfaktorene vev både in vivo og ex vivo. Disse tilnærmingene er generaliseres til ytterligere musemodeller og cellelinjer, noe som muliggjør undersøkelse av kreft i eggstokkene metastasedannelsen fra innledende lokalisering av celler til melaktig punktstrukturer til utvikling av utbredte peritoneale metastaser.
Introduction
I motsetning til de fleste solide svulster, er metastaser fra høyverdig serøs eggstokkreft (HGSC) begrenset til bukhulen en. Dermed kunne effektive peritoneal terapier potensielt kontrollere eller utrydde HGSC. Foreløpig er en standard terapeutisk tilnærming kirurgisk cytoreduksjon kombinert med kjemoterapi 1-3. Dessverre, det store flertallet av pasientene opplever og bukke for komplikasjoner av sykdommen tilbakefall. Disse dystre statistikken viser behovet for bedre forståelse av metastatisk kolonisering, prosessen der kreftceller lokalisere til, bruke og spre innenfor verts vev til å danne metastaser 2.
Omentum er et foretrukket tidlig stedet HGSC metastase 4-7. I motsetning til andre peritoneal adipose, inneholder omental fettvev uvanlige immun strukturer kjent som melkeaktige flekker, som inneholder B, T og NK-celler og makrofager, som spiller nøkkelroller i peritoneale homeostasis 8,9. I tillegg til sine fysiologiske funksjoner, fant vi at melkeaktige flekker spille en aktiv rolle i eggstokkreft metastatisk kolonisering fire. I eksperimentelle metastase analyser, SKOV3ip.1, CaOV3, og HeyA8 (human) og ID8 (murine; C57BL / 6) eggstokkreft celler raskt hjem til melkeaktige flekker, noe som tyder på at cellene beveger seg mot et utskilt kjemotaktisk faktor. Interessant, har kreftceller ikke kolon peritoneal adipose mangler melkeaktige flekker (dvs. gonadale og livmor fett) 4.
For å identifisere mekanismene som regulerer melkeaktig sted kolonisering, har vi optimalisert xenograft modeller som gjør at avhøret av cellulære og molekylære hendelser over tid løpet av metastatisk kolonisering 4. En spesiell fordel av de tilnærminger som er beskrevet her er dens vekt på vev arkitektur og funksjon, som gjør det mulig å teste hypoteser i fullt integrert in vivo og ex vivo modeller av metastatic kolonisering 4,10. Ved å sammenligne kreftcelle lokalisering og vekst i peritoneal fettdepoter som enten inneholder eller mangler melkeaktige flekker, kan etterforskerne teste relative bidraget (r) av adipocytter og celler innenfor melkeaktige flekker til losji og progressive veksten av eggstokkreft celler i fysiologisk relevante vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble plassert, vedlikeholdes og avlives i henhold til Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer og under tilsyn av University of Chicago Animal Resource Center.
1. Klar Dyr for eksperimentelle studier
- Tillate dyr å akklimatisere seg til nye boliger og miljø, for å komme seg fra potensielle fysiologiske virkningene av transport og håndtering.
Merk: Følgende teknikken er gjeldende for alle kommersielt tilgjengelige stammer av mus. Antall dyr som skal brukes til et eksperiment er avhengig av studiedesign og bør gjøres med konsultasjon fra en statistiker.
2. Identifisering og isolering av Peritoneale fett depoter.
- Avlive dyr via CO 2 overdose og en sekundær fysisk metode for å bekrefte dødsfallet.
- Som høsting peritoneal fettdepoter utgjør indre organ fjerning (sekundær metode), make et et midtlinjesnitt i nærheten av lyske papiller gjennom peritoneal veggen for å eksponere de indre organer (figur 1A).
- For omentfettet (OM), utsett omental / bukspyttkjertel kompleks ved å utvide milten fra bukhulen med tang (figur 1C). Slipp omentum fra bukspyttkjertelen og milten ved tett trimming alle vev tilkoblinger. Påse at eventuelle gjenværende pankreasvevet skjæres ut fire.
- For gonader Fat (GF) Bruk pinsett til å løfte gonadesystemet fett rundt eggstokkene og avgiftsdirektoratet ved å kutte vev tilkoblinger (Figur 1A øvre hø t) 4.
- For Livmor Fat (UF) Bruk pinsett til å løfte livmor fett rundt livmor horn og avgiftsdirektoratet ved å kutte vev forbindelser (figur 1A nederst til høyre) 4.
- For mesentrialfett (MF), kuttet forbindelsen mellom tynntarmen og pylorus. Bruk pinsett til fast grep den frie enden avtynntarmen, og sakte "skrelle" den bort fra mesentrialfett. Slipp mesentrialfett fra mesenteriske roten ved hjelp dissekere saks (figur 1A nederst til venstre) 4.
- For Splenoportal Fett (SF), løfter den distale ende av milten med tang for å utsette den tynne bånd av fettvevet som forbinder hilum av milten til bukspyttkjertelen. Eksisere splenoportal fett ved først å frigjøre den fra bukspyttkjertelen, og deretter forsiktig dissekere det fra milten (figur 1B) 4.
3. Milky Spot Identifikasjon Bruke Giemsa Farging
- Avgifts omenta (se trinn 2.3) fra C57BL / 6-mus og feste i 5% nøytral bufret formalin ved 4 ° C i 16 timer (O / N).
- For parafin embedding fast vev, velge en form som passer for størrelsen på vev. Helle smeltet parafin fra parafinbeholderen for å fylle formen. Åpne kassett og bruke varme forceps, overføre vevet inn i formen.
- Nøye orientere vev under parafin embedding å produsere lengdesnitt. Plasser merket vev kassett over støping og trykk godt på plass. La formen avkjøles i minst 30 min.
- Skjær seriesnitt (4 mikrometer tykke) fra formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) vev blokk. Plasser en precleaned skyve under seksjonene som bånd av vev kommer av parafinblokken.
- Serielt seksjon hele omentum; samle inn og beis hver tredje seksjon for Giemsa flekk (se 3.6). Tillat glass-slide med seksjonene lufttørke, helst O / N på RT. Tørket lysbilder er klar for fiksering. Flekk den første delen for hematoxylin og eosin for sammenligninger til Giemsa farget lysbilder.
- Deparaffinize lysbildene med to påfølgende 5 min inkuberingene i xylen. Rehydrere lysbilder med to påfølgende inkuberinger i følgende: 100% etanol, 95% etanol, og til slutt trykker water.
- Ta nødvendige forholdsregler for å unngå lysbildene fra tørking. Utføre alle trinnene på RT.
- Helt fordype lysbildene i en Coplin krukke som inneholder 5% Giemsa løsning (w / v stilles i vann fra springen) og inkuberes i 4 min ved RT. Skyll lysbilder i vann fra springen i 60 sek, lufttørke og monter med dekkglass med feste medier.
- Bilde de fargede lysbilder ved hjelp av en Whole Slide skanner og prosessen med produsenten programvare. Kvantifisere melkeaktig sted volumet i Giemsa-farget omentfaktorene delene med ImageJ programvare 4.
4. Formering og klargjøring av eggstokkreft celler for In vivo og ex vivo studier
- Pre-varm 15 ml cellevekstmedium til 37 ° C i en varme bad. Forbered en riktig størrelse vevskulturkolbe (f.eks 75 cm 2 overflateareal) ved merking med navn på cellelinje, passasje nummer, dato og som har utarbeidet frossen lager, og datoenog personen som tiner / platekledning cellene.
Merk: I studier av metastase slik detaljert informasjon er avgjørende, som dato for fryse ned og passasje tall kan påvirke metastatisk fenotype. - Ved hjelp av sterilt miljø av den biologiske vernedeksel, pipette 10 ml medium i T-75 kulturflaske. Fjern en ampulle med celler fra flytende nitrogen systemet og sjekke etiketten for å bekrefte celletype. Tine bare en ampulle med celler på en gang ved å varme den opp i 37 ° C varme bad.
- Ved å bruke steril teknikk, pipette 1x10 6 celler tint i dyrkningskolben. Sett kolben i kuvøse for å tillate celler å feste. Rist kolben frem og tilbake for å danne en jevn cellesuspensjon.
- Plassere kolben i vevskultur-inkubator og vedlikeholde ved 37 ° C i 5% CO2-miljø. Tillate celler til å følge O / N.
- Sug media, og erstatte med fersk forvarmet vekstmedier. Plassere kolben i inkubatoren og alleow celler til å vokse. Overvåke cellevekst daglig ved visuell inspeksjon hver 2-3 dager ved bruk av et invertert mikroskop. Bruk standard cellekulturteknikker i Passage celler ved oppnådd 70-80% samløpet.
Merk: For eksperimentelle analyser høste celler på 70% samløpet å sikre at cellene er aktivt proliferating. - Aspirer kulturmedium og skyll med 10 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Aspirer PBS og tilsett 0,25% trypsin / EDTA (2 til 3 ml for en 75 cm 2 areal) og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C. Visuelt bekrefte at cellene er frittliggende og tilsett et likt volum av vekstmedium, og cellene forsiktig pipetter opp og ned for å oppnå en enkel cellesuspensjon.
Merk: Det er viktig at vekstmediet inneholder serum som det inaktiverer trypsin. Klargjør det minste 2- til 4-ganger flere celler enn det antall som kreves for et gitt eksperiment for å kompensere for tap av celler i løpet av etterfølgende trinn - Bestemme prosenten av levedyktige celler iSuspensjonen via trypan blå eksklusjon assay ved bruk av et hemacytometer, eller en automatisk celleteller.
Merk: Her, bare bruke cellepreparater som ≥ 96% av cellene er levedyktige. - Overfør cellesuspensjonen fra kolben til et 50 ml konisk rør. Pellet celler ved sentrifugering 5 min ved 1100 xg ved 4 o C.
- Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i PBS til en konsentrasjon på 2x10 6 celler pr ml.
5. intraperitoneal injeksjon av celler
Merk: I våre forsøk, blir musene behandlet i en laminær luftstrøm eller biosikkerhet kabinettet innenfor vår barriere anlegg for å begrense risikoen for patogenet eksponering, For å demonstrere denne teknikken tydelig, ble fremgangsmåtene i den tilhørende video utført i et laboratorium godkjent for dyr arbeid. Denne spesielle teknikken krever ikke dyrene til å være under anestesi. Under godkjente protokoller, utføre denne technique på levende dyr. Bruke egnede stammer av mus for denne studien. For eksempel: Bruk immunsupprimerte, atymiske hårløse mus for studiet av menneskelig eggstokkreft celle (SKOV3ip.1, og HeyA8) kolonisering; bruke immunocompetent C57BL / 6 mus for studie av mus eggstokkreft celler (ID8) kolonisering.
- Last 500 mL av enkeltcellesuspensjon i sprøyten og sette i sterile avkortet 25 G nål. Dette reduserer celle klipping før injeksjon.
- Plukk musen opp ved nakkeskinnet og hold halen hjelp av håndflaten og pekefinger og fikse venstre bakbein mellom ringen og lillefingeren (når musen er tilbakeholdne med venstre hånd).
Merk: For å unngå traumatiserende abdominal organer, holde muse godt slik at den ikke kan bevege seg under injeksjonen. - Tenk deg en linje over magen rett over knærne, og finne et punkt på dyrets høyre side og i nærheten av midtlinjen. Inntakspunktet er kranie til og litt medialav den siste nippelen.
Merk: Sette inn nålen på musens høyre side unngår cecum og reduserer risikoen for punktering tarmen 11. - Sett nålen ved den nedre laterale område av musene underliv til en dybde på omtrent 0,5 cm. Trekk tilbake på stempelet for å bekrefte at nålen ikke har trengt et blodkar eller andre peritoneal organer.
- Hvis noe væske suges kast sprøyten (og prøve) 11. Et grønn-brun eller gul aspireres indikerer nålepenetrering inn i tarmen eller blæren, respektivt.
- Injisere prøven med langsom, jevn press. Trekk nålen og returnere musen til buret sitt. Ikke oppsummering sprøyte før deponering i beholder for skarpe gjenstander.
- Offer mus via CO 2 kvelning og vitale organ fjerning på bestemte tidspunkter etter injeksjon.
6. Milky sted kolonisering In vivo
- Quantitasjon av kreftcelle lokalisering til melkeaktige flekker ved hjelp av flowcytometri
- Isolere peritoneal fettdepoter fra mus (som beskrevet i trinn 2,3 - 2,7) injisert med fluorescens-merkede kreftceller og vev umiddelbare sted i iskald PBS.
- For denne spesielle teknikken, vekt-kamp alle adipose fettvev til omentum. Overfør vev for å separere 5 ml rør inneholdende 1,5 ml serumfritt DMEM og 0,1% (w / v) bovint serum-albumin. Basseng vev høstet fra tre uavhengige mus for å sikre et tilstrekkelig utbytte av celler for flowcytometri.
- Kjøttdeig vev ved hjelp av kirurgiske sakser og Tilsett 1,5 ml serumfritt DMEM inneholdende 0,4% (vekt / volum) kollagenase I. Inkuber vev suspensjonen ved 37 ° C i 30 min med roterende blanding.
- Som et valgfritt trinn, videre angre vev ved tygging. I dette tilfelle overfører vev-kollagenase suspensjonen til en microstomacher pose, masticate i 10 minutter på lav, roterende retningenav posene etter 5 min.
- Filterprøver gjennom en nylon mesh filter (60 mikrometer pore) for å fjerne større rusk. Samle celler via sentrifugering ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C og kast supernatantfraksjonen.
- Resuspender cellepelleten i 100 ul PBS kombinert med 900 ul av ACK lysebuffer og inkuber ved romtemperatur i 1 min. Sentrifuger cellene ved 250 xg i 5 minutter og kast supernatant.
- Resuspender cellepelleten i 250 ul iskald PBS. Filtrer prøven gjennom et 60 um pore nylonduk for å sikre enkel cellesuspensjon. Skyll filteret med 250 ul iskald PBS.
- Kvantifisere antallet fluorescently merkede celler i populasjonen ved hjelp av et strømningscytometer utstyrt med et 561 nm-gul-grønn laser og en 585 nm / 15 nm båndpassfilter. Still porten for tdTomato-positive celler basert på analyse av parentale celler og / eller egnede negative kontroller 4.
- Kvantifisering av mikroskopiske og makroskopiske metastaser
- Ved ønsket eksperimentelle endepunkt (s), isolere, og umiddelbart plassere vev i den riktige fiksering media. Fiks større prøver, slik som intakt gonadal, livmor, og mesenteriske fettdepoter i 10% nøytral bufret formalin i 48 timer ved 4 ° C. Løse små prøver (omental splenoportal og fett, samt vevsekvivalenter av livmor og mesentrialfett) i 5% nøytral bufret formalin ved 4 ° C i 2-16 timer.
- Alternativt snap fryse vev ved å plassere dem i et frysemedium, for eksempel oktober og slippe inn en passende mengde flytende nitrogen.
- Transfer fast vev til 70% etanol og oppbevares ved 4 ° C før innstøping i parafin. Embed og prosess vev som beskrevet i 3.2 og 3.3.
- Bruk H & E farget delen for å evaluere vev med hensyn til nærvær eller fravær av mikroskopiske metastaser (dvs. klynger av 50 celler). Bekreft tHan nærvær av mikroskopiske metastaser hos en sekundær metode slik som en IHC flekk for cytokeratin 8/18 til å detektere eggstokkreft celler.
- Ved ønsket eksperimentelle endepunkt (s), isolere, og umiddelbart plassere vev i den riktige fiksering media. Fiks større prøver, slik som intakt gonadal, livmor, og mesenteriske fettdepoter i 10% nøytral bufret formalin i 48 timer ved 4 ° C. Løse små prøver (omental splenoportal og fett, samt vevsekvivalenter av livmor og mesentrialfett) i 5% nøytral bufret formalin ved 4 ° C i 2-16 timer.
7. Milky Spot Colonization Ex Vivo
- Etablering av grunnleggende ex vivo omental organdyrkningsforhold
- Plasser hver omentum til en enkelt kultur plate innsatsen og plass innenfor en brønn av en tolv-brønners vevskulturplate inneholdende 500 ul av DME / F12 medium inneholdende 20% FCS. Oppretthold organkulturer ved 37 ° C i en 5% CO 2 miljø i 24 til 48 timer, og / eller flere tidspunkter. Bruk tre uavhengige omenta (triplikatprøvene) for hver tilstand (for eksempel medietype / tidspunkt).
- For å bekrefte integriteten til vev ved de eksperimentelle endepunkter, fikse og behandle prøvene som beskrevet i trinn 3. Telle sunt versus nekrotiske adipocytes på H & E seksjoner kan vurdere vev integritet. Et minimum av ~ 120 celler fra5 biologiske prøver er nødvendig for å formulere en prosentandel av levende vev til stede 10.
- For å måle vev funksjon, sted omenta (n = 3) i separate brønner i en 24-brønners plate inneholdende 500 ul av DME / F12 medium med 20% FCS. Tillat omenta å pleie media ved 37 ° C i en 5% CO 2 miljøet i 24 timer, og deretter fjerne 250 ul i bruk i en IL-6 ELISA-analysen 10.
- Ex vivo co-kultur av musen omentum med SKOV3ip.1-GFP celler
- Vokse og forberede fluorescently merket celler som beskrevet i punkt 4 og resuspender i en konsentrasjon på 2 × 10 6 celler per ml.
- Påfør ~ 6 mL av vevlimet til membranen av innsatsen kultur og la det lufttørke. Vask membranen to ganger med sterilt vann for å fjerne overdreven klebemiddel. Air tørke membranene under en laminær hette.
- Eksisere omenta nøye og fest den til klebemiddelbelagte medlrane bruker steril tang. Tillate vevet å følge membranen i 1 min før du legger medier. Legg 500 mL av cellesuspensjonen på toppen av hver omentet i hvert innsats kultur. Fylle området rundt transwell kammer med 2,5 ml av DME / F-12 10.
- Inkuber omenta med cellesuspensjonen i 6 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-miljø. Fjern forsiktig og vaske omenta med ~ 10 ml PBS. Visual fluorescerende kreftcelle foci med en passende fluorescerende Imaging System 10.
- Isolere peritoneal fettdepoter fra mus (som beskrevet i trinn 2,3 - 2,7) injisert med fluorescens-merkede kreftceller og vev umiddelbare sted i iskald PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifisering og Histologisk undersøkelse av Peritoneale fett depoter
Brutto anatomisk disseksjon tillater identifisering av fire av de fem viktigste kildene til peritoneal fett (figur 1A). Beveger seg med urviseren fra øverst på midten er: omentum (OM; beskrevet) som ligger over magen og milt, er gonadal fett (GF) som omgir den venstre eggstokk (ov), livmor fett (UF) som er festet til de uterine horn (uh) og mesenteriet (MY) som er festet til tynntarmen (si). Eggstokken (ov), livmor horn (uh), og tynntarm (SI) er angitt som referansepunkter. Den splenoportal fett (SP) omgir miltarterien og forbinder hilum av milten til cøliaki arterien (figur 1B). Til slutt blir omentum festet til mage og bukspyttkjertel (figur 1C). Brutto struktur og relative størrelse av disse vev er vist i figur 1D. Histologisk undersøkelse av the vev viser at splenoportal og omental fett inneholder melke sted [MS] strukturer på vevet periferien, omgitt av adipocytter [A]; livmor, gonadal, og mesentrialfett ikke (figur 1E).
Milky sted identifisering ved hjelp Giemsa Farging
For å muliggjøre sammenligning av samlede melkeaktig sted innhold mellom forskjellige musestammer, melkeaktig sted volum og areal til stede i enkelte omenta ble kvantifisert ved hjelp av en ny metode. Som beskrevet i Methods, ble en "digital hel mount" av omenta konstruert ved å farge hver tredje seksjon av vev i en 5% Giemsa-løsning og å ta bilder av de fargede vev (figur 2A). Melkeaktige flekker som regioner flekker mørk blå (figur 2B). Identiteten til disse regionene som melkeaktige flekker ble bekreftet i seriesnitt av både H & E farging og IHC for celler positive for CD45, et felles lymfocytt markør (
Kvantitativ og kvalitativ vurdering av kreft kolonisering av oment
En flowcytometri basert metode ble utviklet for å kvantifisere antallet av kreftceller som er tilstede i adipose depoter etter intraperitoneal injeksjon. Denne protokollen er spesielt nyttig å studere tidlige kolonisering trinnene i metastatisk prosess. For eksempel, i figur 3A, ble ID8-tdTomato celler fremstilt og injisert intraperitonealt inn i C57BL / 6 mus. Ved 7 dager efter injeksjon (dpi) ble adipose organer fjernet og dissosiert til en enkelt cellesuspensjon som beskrevet i Metoder. Antallet tdTomato cells ble kvantifisert ved hjelp av flowcytometri (figur 3A, venstre). Omentum viste en omtrent 12 gangers økning i antall tdTomato-positive hendelser, i forhold til PBS-injiserte kontroller (figur 3A, til høyre), men det var ingen signifikant økning i cellepreparater fra gonadal fett, livmor fett, eller mesenteriet . En komplementær kvalitativ IHC basert tilnærming viste også at 7 dager etter ip injeksjon av SKOV3ip.1 celler, ble sammenlignbare cancercelle lesjoner observert hos både oment og splenoportal fett (figur 3B). IHC for human pan-cytokeratin (pan-CK) bekrefter tilstedeværelsen av kreft celler innenfor melkeaktige flekker. Spesifisiteten av IHC farging ble bekreftet ved hjelp av en IgG-kontroll for den pan-cytokeratin antistoff (Figur 3B). ID8 eggstokkreft kolonisering av peritoneale fettdepoter ble evaluert ved bruk av C57BL / 6-mus ved 7 dpi. Store kreftcelle lesjoner i melkeaktige flekker på både omentum og splenoportal fett er uteforet. Små klynger av kreftceller ble til sett i andre fettlagre, som illustrert i panel innfelt. Dermed kan man få tilgang til både det relative antall og plassering av cellene i et gitt vev.
Ex vivo analyse for å studere eggstokkreft kolonisering av melkeaktige flekker
For å løse begrensningene i vivo forhold og samtidig opprettholde vev sammensetning og arkitektur, vi optimalisert en ex vivo tilnærming for å studere eggstokkreft celle kolonisering av omentfaktorene vev. Hele omentfaktorene vev skåret ut fra mus er vellykket dyrkes ex vivo for å studere eggstokkreft samspill med melkeaktige flekker. SKOV3ip.1-GFP-celler ble sådd ut på ex vivo dyrkede omentfaktorene vev og opprettholdt ved 37 ° C i en periode på 6 timer. GFP-positive fluorescerende celler ble synlige i diskret foci i både ex vivo og in vivo (Figur 4A). Under begge forholdene, histologisk verifisering med H & E farging bekreftet kreftcelle lokalisering til melkeaktige flekker (Figur 4B). Bekreftende flekken bruker cytokeratin flekken for kreftceller viste tilstedeværelse av kreftcellen foci innenfor melkeaktige flekker (Figur 4C). Disse data viser gjennomførbarheten av å bruke ex vivo tilnærminger for mekanismebaserte undersøkelser for å komplettere in vivo resultater.
Figur 1. De relative posisjoner og strukturer av de viktigste peritoneale adipose depoter. (A) Brutto anatomisk disseksjon viser den relative plasseringen av fire av de fem viktigste kildene til peritoneal fett. Omentum (OM; skissert), gonadal fett (GF), livmor fett (UF), mesenterium(MY), eggstokk (ov), er uterine horn (uh), og tynntarmen (si) vist (B) Splenoportal fett (SP; skissert). Eksponeres ved å løfte av milten med pinsett (C) Musen omentum vist dissekert. fri fra bukspyttkjertelen for å bedre visualisering D:. De relative størrelser og strukturer av utskåret peritoneal fett; mesenterium vises festet til mesenteriske roten. E. Histologisk evaluering av peritoneal fett for tilstedeværelsen av melkeaktige flekker (A) adipocytes, (MS) melkeaktig sted. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Giemsa basert tilnærming for å kvantifisere melkeaktige flekker i omental vev. (A); Bilde av del av hele omentum farget med Giemsa. Seriesnitt av omentvev evaluert av: (B) Giemsa flekker; melkeaktige flekker, er angitt med sorte piler (C) H & E farging.; og, (D) IHC ved anvendelse av anti-CD45-antistoff for å identifisere lymfocytter innenfor melkeaktig flekk strukturen. Målestokk er den samme for BD og betegner 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Ovarian kreftceller fortrinnsvis kolon peritoneal fett som inneholder melkeaktige flekker. Strømningscytometrisk analyser av omentum (OM), livmor fett (UF), gonadal fett (GF), og mesenterium (MY) høstet fra mus ved 7 dpi av ID8- tdTomato celler (til venstre). Data er presentertsom fold-endring økning på tdTomato-postive celler i løpet av PBS-injisert mus (til høyre). Feil linjer indikerer standardavvik av gjennomsnittet. ** Betegner p <0,01 sammenlignet med PBS kontrollene. (B) Undersøkelse av vev av både standard histologi og IHC viser sammenlign kolonisering av melkeaktige flekker i både oment og splenoportal fett (etter injeksjon av 1x10 6 SKOV3ip.1 celler i Nude mus). Snittene ble undersøkt ved H & E farging. Tilstedeværelsen av epitel (kreft) celler i lesjonene ble bekreftet av IHC påvisning av cytokeratin bruke en pan-cytokeratin (pan-CK) antistoff. IHC ved bruk av en IgG isotype antistoff for pan-cytokeratin ble brukt som en kontroll for farging spesifisitet. Målestokk er den samme for alle bilder og betegner 100 mikrometer. (C) Evaluering av ID8 eggstokkreft kolonisering av peritoneal fettdepoter i C57BL / 6 mus ved 7 dpi. Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Ex vivo kolonisering av eggstokkreft celler til oment. Kolonnene representerer en sammenligning av de tre forsøksbetingelser som viser naive omenta (til venstre), omenta fra mus seks timer etter ip injeksjon av 1 x 10 6 SKOV3ip.1 celler (i midten) og omenta med SKOV3ip.1-GFP koloniserte etter ex vivo forhold (til høyre). Naive omenta (blank), omenta kolonisert av SKOV3ip.1-GFP fra in vivo-analyse (vedlegg in vivo) eller omenta kolonisert av SKOV3ip.1-GFP i ex vivo dyrkningsforhold (vedlegg ex vivo). Fluorescens avbildning av hele omenta for GFP viser lignende kolonisering mønster for både in vivo og ex vivo-analyser (A). H & E farging av seriesnitt avden omenta fra panel A bekrefter tilstedeværelsen av kreftceller lokalisert til den melkeaktige flekker (B). Cytokeratin for eggstokkreft celler validerer H & E farging (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvikling av terapi for å målrette spres celler krever en mekanistisk forståelse av metastatisk kolonisering, den kritiske første skritt i utviklingen av peritoneal sykdom. For å løse disse problemene vi rapporterer tilnærminger som kan brukes til å skjelne hvordan omentum unike vevssammenheng og arkitektur fremme eggstokkreft metastatisk kolonisering. Særtrekk ved vår tilnærming er: 1) fokus på tidlige hendelser i kolonisering prosessen; 2) sammenligning av melkepunktholdig og mangel adipose depoter; 3) tilgjengelighet av en reproduserbar teknikk for å kvantifisere melkeaktig sted volum i vev; 4) tilgjengelighet av komplementær in vivo og ex vivo tilnærminger for å vurdere eggstokkreft celle kolonisering av melkepunktstrukturer.
Ved utførelse av disse undersøkelser kom vi til å innse at søkere ofte er uvitende om plasseringen av mus omentum og eksistensen av den splenoportal fett band, som fungerer som en andre kilde til melkeaktig sted holdig peritoneal fett. Selv om teknikkene som er beskrevet her aktiver studier av trinnene i metastatisk kolonisering, de bare tilbyr "snapshots" av disse prosessene, og ikke vurdering av kolonisering i sanntid. Hvis fulgt riktig, bør de protokoller som er beskrevet gir reproduserbare resultater for en rekke forskere. Kritisk for å lykkes med disse teknikkene er: 1) identifisere og dissekere ut spesifikke peritoneal fettvev som forurensning av andre typer vev vil skew kvantitative data innhentet fra flowcytometri; og 2) iverksette hensiktsmessige påkjenningen av transgene mus for studie i spørsmålet. Det bør bemerkes at tidsforløpsstudier bør bestemmes for individuelle cellelinjer. Empirisk da den er avhengig av en rekke faktorer, inkludert formeringshastigheten, tid til tumor take og metastatisk potensiale.
I tillegg til å dissekere interactions av veletablerte ovarie cancer cellelinjer og deres omental mikromiljø som er viktige for metastasedannelse, kan den teknikk som her er beskrevet også bli brukt til å evaluere den ondartede potensiell klinisk avledede cellelinjer som rekapitulere tidlige molekylære forandringer i serøse tubene intraepitelial karsinomer i fimbrier av egglederne 12-17. Selv om en vei for den molekylære progresjon av disse lesjonene er nye, er in vivo studier for å bestemme den biologiske betydning av spesifikke endringer. Komplementære in vivo og ex vivo-analyser kan anvendes for å vurdere spesifikke trinn i koloniseringen av metastatisk omental vev hos slike modell forløper cellelinjer informasjon hentet fra studier kan være nøkkelen til generering av terapeutiske hypoteser og utformingen av ytterligere prekliniske studier.
Identifisere mekanismer som kontrollerer metastatisk kolonisering kan gjøre det mulig å forebyggeeller kontroll av metastasedannelse. For eksempel kvinner som har økt risiko for å utvikle eggstokkreft helst 18-22 (dvs. BRCA1 eller BRCA2 mutasjonsbærere) ofte gjennomgå profylaktisk salpingo-ooforektomi for å redusere risikoen for å utvikle peritoneal sykdom 23,24. Dessverre, pasienter ofte fortsatt utvikle HGSC grunn av utvekst av eggstokkreft celler til stede i omentum og andre metastaser på tidspunktet for kirurgi. Identifisering av midler som forstyrrer omental vev mikromiljøet kan hindre kreftcelle lokalisering og / eller vekst i omentum. En slik tilnærming kan potensielt bli anvendt i kombinasjon med terapeutiske midler som er rettet mot eggstokkreft celler for å forebygge metastasedannelse eller undertrykke cancer gjenvekst (etter kirurgisk debulking).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
- Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
- Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
- Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
- Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
- Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. The omentum. World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).
- Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
- Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
- Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
- Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
- Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
- Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
- Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
- Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
- Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
- Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
- Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
- Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
- Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
- King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
- Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
- Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
- Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
- Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).
