Abstract
Högkvalitativ serös äggstockscancer (HGSC), fortsätter orsaken till omfattande peritoneala metastaser att ha en extremt dålig prognos; mindre än 30% av kvinnorna lever 5 år efter diagnosen. Omentum är en föredragen plats för HGSC metastasbildning. Trots den kliniska betydelsen av denna mikro förblir understudied bidrag omental fettvävnad till äggstockscancer progression. Omental adipose är ovanligt att den innehåller strukturer som kallas mjölkaktiga fläckar, som består av B, T och NK-celler, makrofager, och progenitorceller kring täta bon kärl. Mjölkaktiga fläckar spelar en nyckelroll i de fysiologiska funktioner omentum, som krävs för peritoneal homeostas. Vi har visat att mjölkaktiga fläckar också främja äggstockscancer metastaserad koloniseringen av peritoneal fettvävnad, ett viktigt steg i utvecklingen av peritoneala metastaser. Här beskriver vi de metoder vi utvecklat för att utvärdera och kvantifiera mjölkaktiga fläckar i peritoneal adipös och studera deras funktionella bidrag till äggstockscancercell metastaserad kolonisering av omental vävnad både in vivo och ex vivo. Dessa metoder är generaliserbart till ytterligare musmodeller och cellinjer, vilket möjliggör studier av äggstockscancer metastasbildning från initial lokalisering av celler till milky spotstrukturer för utvecklingen av omfattande peritoneala metastaser.
Introduction
Till skillnad från de flesta fasta tumörer, är metastaser från höggradig serös äggstockscancer (HGSC) begränsad till bukhålan 1. Således kan effektiva peritoneala terapier eventuellt kontrollera eller utrota HGSC. För närvarande är en vanlig terapeutisk metod kirurgisk cytoreduktion kombination med kemoterapi 1-3. Tyvärr, de allra flesta patienter upplever och duka under för komplikationer av återfall i sjukdomen. Dessa dystra statistik visar på behovet av ökad förståelse av metastaserad kolonisering, den process genom vilken cancerceller lokalisera till utnyttja och föröka sig i värdvävnader för att bilda metastaser 2.
Omentum är en föredragen tidig platsen HGSC metastasering 4-7. Till skillnad från andra peritoneal fettvävnad, innehåller omental fettvävnad ovanliga immun strukturer som kallas mjölkaktiga fläckar, som innehåller B, T och NK-celler och makrofager, som spelar nyckelroller i peritoneala homeostasis 8,9. Förutom deras fysiologiska funktioner, fann vi att mjölkaktiga fläckar spelar en aktiv roll i äggstockscancer metastaserad kolonisering 4. I experimentella metastas analyser, SKOV3ip.1, CaOV3 och HeyA8 (human) och ID8 (mus, C57BL / 6) äggstockscancerceller snabbt hem till mjölkaktiga fläckar, vilket tyder på att cellerna är på väg mot ett utsöndrat kemotaktisk faktor. Intressant, gör cancercellerna inte kolonisera peritoneal adipose saknar mjölkaktiga fläckar (dvs. gonad och livmoder fett) 4.
För att identifiera mekanismer som reglerar mjölk plats kolonisation, har vi optimerat xenograft-modeller som möjliggör förhör av cellulära och molekylära händelser under tidsförloppet av metastaserad kolonisering 4. En särskild fördel med de metoder som beskrivs här är dess betoning på vävnad arkitektur och funktion, som gör det möjligt för användare att testa hypoteser i helt integrerad in vivo och ex vivo-modeller av metastatic kolonisering 4,10. Genom att jämföra cancercellernas lokalisering och tillväxt i peritoneala fettdepåer som antingen innehåller eller saknar mjölkaktiga fläckar, kan utredarna testa det relativa bidraget (s) i adipocyter och celler inom mjölkaktiga fläckar till logi och progressiv tillväxt av äggstockscancerceller i fysiologiskt relevanta vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss inhystes, underhålls och avlivas enligt Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer och under överinseende av University of Chicago Animal Resource Center.
1. Förbereda djur för experimentella studier
- Låt djuren acklimatisera sig nya bostäder och miljö, för att återhämta sig från potentiella fysiologiska effekter av transport och hantering.
Obs: Följande teknik kan tillämpas på alla kommersiellt tillgängliga stammar av möss. Antalet djur som skall användas för ett experiment är beroende av studiens utformning och bör göras med konsultation från en statistiker.
2. Identifiering och isolering av Peritoneal fettdepåerna.
- Avliva djur via CO2 överdos och en sekundär fysisk metod för att bekräfta död.
- Som skörd peritoneala fettdepåer utgör en intern avlägsnande av organ (sekundär metod), make en mittlinjeincision nära inguinal papiller genom peritonealväggen att exponera de inre organen (Figur 1A).
- För omental Fett (OM), exponera omental / pankreas komplexet genom att förlänga mjälten från peritonealhålan med pincett (Figur 1C). Släpp omentum från bukspottkörteln och mjälten genom att noga trimma alla vävnads anslutningar. Säkerställ att eventuella kvarvarande pankreatisk vävnad skärs 4.
- För gonadala Fett (GF), använder pincett för att lyfta gonadal fett som omger äggstockarna och punktskatter genom att minska vävnads anslutningar (Figur 1A övre righ t) 4.
- För Uterine Fett (UF), använder pincett för att lyfta livmoder fett som omger livmodern horn och punktskatter genom att minska vävnads anslutningar (Figur 1A nedre högra) 4.
- För Mesenteriska Fett (MF), skär övergången mellan tunntarmen och pylorus. Använd pincett för att stadigt gripa den fria änden avtunntarmen, och långsamt "skal" bort från mesenteriska fett. Släpp mesenteriska fett från mesenteriska roten med hjälp av dissekera sax (Figur 1A nedre vänstra) 4.
- För Splenoportal Fett (SF), lyfter den distala änden av mjälten med pincett för att exponera den tunna fett band av vävnad som förbinder hilum av mjälten till bukspottkörteln. Skära ut splenoportal fett genom att först släppa den från bukspottkörteln och sedan försiktigt dissekera det från mjälten (Figur 1B) 4.
3. Milky Spot Identification Använda Giemsa färgning
- Punkt omenta (se steg 2,3) från C57BL / 6-möss och fixera 5% neutral buffrad formalin vid 4 ° C under 16 h (O / N).
- För paraffininbäddning den fasta vävnaden, välja en form som är lämplig för storleken på vävnaden. Häll smält paraffin från paraffinbehållaren för att fylla formen. Öppna kassett och använda varmt förceps, överföra vävnaden in i formen.
- Noggrant orientera vävnaderna under paraffininbäddning att producera längdsnitt. Placera märkta vävnadskassetten över formning och tryck fast på plats. Tillåt gjutformen att svalna i minst 30 minuter.
- Skär seriesnitt (4 pm tjocka) från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadsblock. Placera en förrenade glider under avsnitten som bandet av vävnad lossnar paraffinblocket.
- Serie avsnittet hela omentum; samla och ge fläckar var tredje avdelning för Giemsa bets (se 3.6). Låt glasskiva med sektionerna lufttorka, företrädesvis O / N vid RT. Torkade bilderna är redo för fixering. Färga första sektionen för hematoxylin och eosin för jämförelser med Giemsa färgade objektglas.
- Avparaffinera bilderna av två på varandra följande 5 min inkubationer i xylener. Rehydrera objektglasen genom två sekventiella inkubationer i det följande: 100% etanol, 95% etanol, och slutligen trycker waTer.
- Vidta lämpliga försiktighetsåtgärder för att undvika bilderna från torkning. Utför alla steg vid RT.
- Helt Doppa glasen i ett Coplin-kärl innehållande 5% Giemsa-lösning (vikt / volym ställdes i kranvatten) och inkubera under 4 min vid rumstemperatur. Skölj objektglasen i kranvatten i 60 sek, lufttorka och montera med täckglas med användning av monteringsmedel.
- Bild de färgade bilderna med hjälp av en hel Slide Scanner och processen med tillverkare programvara. Kvantifiera milky plats volymen i Giemsa-färgade omental sektioner med hjälp ImageJ programvara 4.
4. Förökning och beredning av äggstockscancer celler för In vivo och ex vivo studier
- Pre-varm 15 ml celltillväxtmedium till 37 ° C i ett värmebad. Förbered (t.ex. 75 cm 2 yta) en lämplig storlek vävnadskultur kolv genom märkning med namn cellinje, passage nummer, datum och person som iordningställde frusna lager, och datumperson som tinar / plätering cellerna.
Obs: I studier av metastaser sådan detaljerad information är avgörande, som datum för frysa ner och passagenummer kan påverka metastatisk fenotyp. - Använda den sterila miljön i biologiska säkerhets huva, pipett 10 ml medium i T-75 odlingsflaska. Ta en flaska med celler från systemet flytande kväve och kontrollera märkningen för att bekräfta celltypen. Tina endast en injektionsflaska med celler i taget genom uppvärmning i 37 ° C värme bad.
- Med hjälp av steril teknik, pipett 1x10 6 tinade celler i odlingskolven. Placera kolven i inkubatorn för att tillåta cellerna att fästa. Skaka kolven fram och tillbaka för att bilda en likformig cellsuspension.
- Placera kolven i vävnadsodlingsinkubator och hålls kvar vid 37 ° C i 5% CO 2 miljö. Låt cellerna att fästa O / N.
- Aspirera media och ersätta med färsk förvärmda odlingsmedier. Placera kolven i inkubatorn och allaow celler att växa. Övervakning av celltillväxt dagligen genom visuell inspektion var 2-3 dagar med användning av ett inverterat mikroskop. Använd standardcellodlingstekniker till passageceller på att nå 70-80% konfluens.
Obs: För experimentella analyser skörda cellerna vid 70% sammanflödet för att säkerställa att cellerna aktivt frodas. - Aspirera odlingsmediet och skölj med 10 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Aspirera PBS och till 0,25% trypsin / EDTA (2 till 3 ml för en 75 cm 2 ytarea) och inkubera 5 min vid 37 ° C. Se noga efter att cellerna har lossnat och tillsätt en lika stor volym odlingsmedium, och försiktigt pipettera cellerna upp och ned för att erhålla en enkelcellsuspension.
Obs: Det är viktigt att tillväxtmediet innehålla serum som inaktiverar trypsin. Bered minst 2- till 4-faldigt fler celler än det antal som krävs för en given experiment för att kompensera för förlust av celler under efterföljande steg - Bestäm procentandelen viabla celler isuspensionen via exklusion med trypanblått med användning av en hemacytometer eller en automatiserad cellräknare.
Obs: Här endast använda cellpreparat där ≥ 96% av cellerna är livskraftiga. - Överför cellsuspensionen från kolven till ett 50 ml koniskt rör. Pelletera celler genom centrifugering 5 min vid 1100 xg vid 4 ° C
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i PBS till en koncentration av 2x10 6 celler per ml.
5. intraperitoneal injektion av celler
Obs: I våra experiment, möss hanteras på ett laminärt luftflöde eller biosäkerhet skåp i vårt barriär anläggning i syfte att minska risken för patogen exponering För att visa den här tekniken tydligt var instruktionerna i medföljande videon utföras i ett laboratorium som godkänts för djur arbete. Denna speciella teknik kräver inte att djuren är under narkos. Under godkända protokoll, utföra denna technique på levande djur. Använda lämpliga stammar av möss för denna studie. Till exempel: använd med nedsatt immunförsvar, atymiska nakna möss för att studera human äggstockscancerceller (SKOV3ip.1 och HeyA8) kolonisering; använda immunkompetenta C57BL / 6-möss för studier av mus ovariala cancerceller (ID8) kolonisering.
- Belastning 500 pl av en enda cell suspensionen i sprutan och sätta i den sterila utjämnade 25 G-nål. Detta minskar cell skjuvning före injektion.
- Plocka musen upp av nackskinnet och hålla svansen med hjälp av handflatan och pekfingret och fixera vänster bakben mellan ringen och lillfingret (när musen hindras med vänster hand).
Obs! För att undvika traumatiserande bukorganen, hålla musen väl så att det inte kan röra sig under injektionen. - Föreställ dig en linje över buken strax ovanför knäna, och hitta en punkt på djurets högra sida, nära mittlinjen. Införselorten är hjärn till och något medialav den sista nippeln.
Observera: Om du sätter nålen på musens högra sida undviker blindtarmen och minskar risken för punktering tarmarna 11. - Stick in nålen i den nedre sido regionen mössens buken till ett djup av ca 0,5 cm. Dra tillbaka kolven för att bekräfta att nålen inte har trängt ett blodkärl eller andra peritoneala organ.
- Om någon vätska sugs kassera sprutan (och prov) 11. En grön-brun eller gul aspirera indikerar nålpenetration i tarmarna eller urinblåsan, respektive.
- Injicera provet med långsam, stadig tryck. Dra ut nålen och återgå musen till sin bur. Inte recap sprutan före bortskaffande i avfallsbehållare.
- Sacrifice möss via CO 2 kvävning och vitala organ borttagning vid specifika tidpunkter efter injektion.
6. Milky plats kolonisering In vivo
- Quantitàtion av cancercell lokalisering till mjölkaktiga fläckar med hjälp av flödescytometri
- Isolera peritoneala fettdepåer från möss (såsom beskrivs i steg 2,3 - 2,7) injicerades med fluorescerande taggade cancerceller och omedelbara plats vävnader i iskall PBS.
- För denna teknik, vikt-match alla fettfettvävnader till omentum. Överför vävnader för att separera 5 ml rör innehållande 1,5 ml serumfritt DMEM och 0,1% (vikt / volym) bovint serumalbumin. Pool vävnader skördas från tre oberoende möss för att säkerställa en tillräcklig avkastning på celler för flödescytometri.
- Mince vävnader med hjälp av kirurgiska saxar och tillsätt 1,5 ml serumfritt DMEM innehållande 0,4% (vikt / volym) kollagenas I. Inkubera vävnaden suspensionen vid 37 ° C under 30 min med rotations blandning.
- Som ett valfritt steg, ytterligare disassociera vävnad genom tuggning. I detta fall, överför den vävnads kollagenas suspensionen till en microstomacher väska, tugga för 10 min på låg, rotera orienteringenav påsarna efter 5 min.
- Filterprov genom ett nylonnät filter (60 pm por) för att avlägsna större skräp. Samla cellerna genom centrifugering vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten fraktionen.
- Resuspendera cellpelleten i 100 fil PBS i kombination med 900 | il av ACK-lysbuffert och inkubera vid RT under 1 minut. Centrifugera cellerna vid 250 xg under 5 minuter och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 250 | il iskall PBS. Filtrera proven genom ett 60 | j, m por nylonnät för att säkerställa enkelcellsuspension. Skölj filtret med 250 ul iskall PBS.
- Kvantifiera antalet fluorescensmärkta cellerna i populationen med användning av en flödescytometer utrustad med en 561-nm gulgrön laser och en 585 nm / 15 nm bandpassfilter. Ställ grinden för tdTomato-positiva celler baserade på analys av moderceller och / eller lämpliga negativa kontroller 4.
- Kvantifiering av mikroskopiska och makroskopiska metastaser
- Vid den önskade experimentella slutpunkt (er), isolera, och omedelbart placera vävnaderna i lämpligt fixeringsmediet. Fix större prover, såsom intakta gonadal, livmoder- och mesenteriska fettdepåer i 10% neutral buffrad formalin för 48 timmar vid 4 ° C. Fix mindre prover (omentalt och splenoportal fett, såväl som vävnads ekvivalenter livmoder och mesenteriska fett) i 5% neutral buffrad formalin vid 4 ° C under 2-16 h.
- Alternativt, snap frysa vävnaderna genom att placera dem i ett frysmedium såsom oktober och släppa in en lämplig mängd flytande kväve.
- Överföring fasta vävnader till 70% etanol och förvara vid 4 ° C tills inbäddning i paraffin. Bädda in och process vävnad såsom beskrivits i 3,2 och 3,3.
- Använd H & E-färgade avsnitt för att utvärdera vävnader för närvaro eller frånvaro av mikroskopiska metastaser (dvs kluster av 50 celler). Bekräfta than närvaron av mikroskopiska metastaser från en sekundär metod såsom en IHC fläck för cytokeratin 8/18 att upptäcka äggstockscancerceller.
- Vid den önskade experimentella slutpunkt (er), isolera, och omedelbart placera vävnaderna i lämpligt fixeringsmediet. Fix större prover, såsom intakta gonadal, livmoder- och mesenteriska fettdepåer i 10% neutral buffrad formalin för 48 timmar vid 4 ° C. Fix mindre prover (omentalt och splenoportal fett, såväl som vävnads ekvivalenter livmoder och mesenteriska fett) i 5% neutral buffrad formalin vid 4 ° C under 2-16 h.
7. Milky Spot Colonization Ex Vivo
- Fastställande av grundläggande ex vivo omental organodlingsbetingelser
- Placera varje omentum till en enda odlingsplatta insatsen och rum inom en brunn av en tolv-brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande 500 | il av DME / F12-medium innehållande 20% FCS. Bibehåll organkulturer vid 37 ° C i en 5% CO2 miljö för 24 till 48 timmar och / eller ytterligare tidpunkterna. Använd tre oberoende omenta (triplikatprover) för varje tillstånd (t.ex. medietyp / tidpunkt).
- För att bekräfta integritet vävnader vid de experimentella ändpunkter, fixa och processprover som beskrivs i steg 3. Räkna sunt kontra nekrotiska adipocyter på H & E sektioner kan bedöma vävnadsintegritet. Ett minimum av ~ 120 celler från5 biologiska prov krävs för att formulera en procentandel av levande vävnad närvarande 10.
- För att mäta vävnadsfunktion, plats omenta (n = 3) i separata brunnar i en 24-brunnsplatta innehållande 500 | il av DME / F12-medium med 20% FCS. Låt omenta att påverka media vid 37 ° C i en 5% CO 2 miljö under 24 timmar, och sedan ta bort 250 pl för användning i en IL-6 ELISA-analys 10.
- Ex vivo samodling av musen omentum med SKOV3ip.1-GFP-celler
- Växa och förbereda fluorescerande etiketterade celler som beskrivs i avsnitt 4 och resuspendera vid en koncentration av 2 x 10 6 celler per ml.
- Applicera ~ 6 | il av vävnadsadhesivet till membranet i odlingsinsatsen och låta det lufttorka. Tvätta membranet två gånger med sterilt vatten för att avlägsna eventuell överdriven adhesiv. Lufttorka membranen under ett laminärt huva.
- Försiktigt skära ut omenta och koppla den till adhesivbelagda MEMBrane användning av sterila pincett. Låt vävnaden att vidhäfta till membranet under 1 min före tillsats av media. Tillsätt 500 | il av cellsuspensionen på toppen av varje omentum i varje odlingsinsatsen. Fyll området runt transwell kammaren med 2,5 ml DME / F-12 10.
- Inkubera omenta med cellsuspension för 6 h vid 37 ° C i en 5% CO2 omgivning. Försiktigt bort och tvätta omenta med ~ 10 ml PBS. Visualisera fluorescerande cancercell härdar med hjälp av ett lämpligt fluorescerande avbildningssystem 10.
- Isolera peritoneala fettdepåer från möss (såsom beskrivs i steg 2,3 - 2,7) injicerades med fluorescerande taggade cancerceller och omedelbara plats vävnader i iskall PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifiering och histologisk undersökning av Peritoneal fettdepåerna
Brutto anatomisk dissektion möjliggör identifiering av fyra av de fem främsta källorna till peritoneal fett (Figur 1A). Medsols uppifrån centrum är: bukhinnenätet (OM, skiss) ligger över magen och mjälten, den gonadal fett (GF) som omger den vänstra äggstock (ov), livmoder fett (UF) fäst vid livmoderhornen (uh) och tarmkäxet (MIN) som är fäst till tunntarmen (SI). Äggstocken (ov), livmoderhorn (uh), och tunntarmen (si) anges som referenspunkter. Den splenoportal fett (SP) omger mjälten artären och förbinder hilum av mjälten till celiaki artär (Figur 1B). Slutligen bukhinnenätet fäst vid magen och bukspottkörteln (Figur 1C). Brutto struktur och relativa storleken av dessa vävnader visas i figur 1D. Histologisk undersökning av the vävnader visar att splenoportal och omental fett innehåller mjölk plats [MS] strukturer på vävnads periferi, omgiven av adipocyter [A]; livmoder, gonadal och mesenteriska fett inte (Figur 1E).
Milky plats identifiering med Giemsa färgning
För att möjliggöra en jämförelse av den totala mjölk plats innehåll mellan olika musstammar, milky plats volym och området förekommer i enskilda omenta kvantifierades med hjälp av en ny metod. Såsom beskrivs i Methods ades ett "digitalt hela montera" av omenta konstrueras genom färgning var tredje sektion av vävnad i en 5% Giemsa-lösning och fotografering av de färgade vävnader (Figur 2A). Milky fläckar som regioner färgning mörkblå (Figur 2B). Identiteten för dessa regioner som mjölkaktiga fläckar bekräftades i seriesnitt av både H & E färgning och IHC för celler positiva för CD45, en gemensam lymfocyt markör (
Kvantitativ och kvalitativ bedömning av cancer kolonisering av omentum
En flödescytometri-baserad metod har utvecklats för att kvantifiera antalet cancerceller som föreligger i adipose depåer efter intraperitoneal injektion. Detta protokoll är särskilt användbart för att studera tidiga kolonisering steg i metastaserande process. Till exempel, i figur 3A, var ID8-tdTomato celler framställes och injiceras intraperitonealt i C57BL / 6-möss. Vid 7 dagar efter injektion (dpi), de fett organ skördas och dissocieras till en enkelcellsuspension såsom beskrivits i Metoder. Antalet tdTomato ceLLS kvantifierades med användning av flödescytometri (figur 3A, vänster). Omentum visade en ungefär 12-faldig ökning i antalet tdTomato-positiva händelser, i förhållande till PBS injicerade kontroller (fig 3A, höger), men det fanns ingen signifikant ökning i cellberedningar från gonadal fett, livmoder fett, eller tarmkäx . En kompletterande kvalitativ IHC baserad metod visade också att 7 dagar efter ip-injektion av SKOV3ip.1 celler, jämförbara cancercellskador observerats i både omental och splenoportal fett (Figur 3B). IHC för human pan-cytokeratin (pan-CK) bekräftar närvaron av cancerceller inom mjölkaktiga fläckar. Specificiteten för IHC-färgning bekräftades med hjälp av en IgG-kontroll för den pan-cytokeratin antikropp (Figur 3B). ID8 äggstockscancer kolonisering av peritoneala fettdepåerna utvärderades med användning av C57BL / 6-möss vid 7 dpi. Stora cancercellskador i mjölkaktiga fläckar både bukhinnenätet och splenoportal fett är utefodrade. Små kluster av cancerceller ibland ses i andra fettdepåer, såsom illustreras i panelen infällda. Sålunda kan en tillgång till både det relativa antalet och placeringen av celler inom en given vävnad.
Ex vivo-analys för att studera äggstockscancer kolonisering av mjölkaktiga fläckar
För att ta itu med begränsningar av in vivo-förhållanden med bibehållen kroppskonstitution, och arkitektur, optimerad vi ett ex vivo metod för att studera äggstockscancerceller kolonisering av omental vävnader. Hela omental vävnader utskurna från möss är framgångsrikt odlas ex vivo för att studera äggstockscancer interaktion med mjölkaktiga fläckar. SKOV3ip.1-GFP-celler såddes på de ex vivo odlade omental vävnader och hölls vid 37 ° C under en period av 6 timmar. GFP-positiva fluorescerande celler var synliga i diskret foci i både ex vivo och in vivo (Figur 4A). Under båda sjukdomarna histologiska verifiering med hjälp av H & E färgning bekräftade cancercell lokalisering till mjölkaktiga fläckar (Figur 4B). Bekräftande fläck med användning av Cytokeratin färgning för cancerceller visade närvaron av cancercell foci inom de mjölkaktiga fläckar (fig 4C). Dessa data visar att möjligheten att använda ex vivo metoder för mekanismbaserade studier för att komplettera in vivo resultat.
Figur 1. De relativa platser och strukturer för de viktigaste peritoneala fettdepåer. (A) Brutto anatomisk dissektion som visar den relativa placeringen av fyra av de fem primära källor på peritoneal fett. Bukhinnenätet (OM, skiss), gonadal fett (GF), livmoder fett (UF), mesenterium(MY), äggstockar (ov), är livmodern hornen (uh), och tunntarm (si) visas (B) Splenoportal fett (SP, skiss). Exponeras genom att lyfta mjälten med pincett (C) Musen omentum visas dissekeras. fri från bukspottkörteln att förbättra visualisering D:. Relativa storlekar och strukturer exciderad peritoneal fett; tarmkäxet visas fäst vid mesenteriska roten. E. Histologisk utvärdering av peritoneal fett med avseende på förekomst av mjölkaktiga fläckar (A) adipocyter, (MS) milky plats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Giemsa baserad metod för kvantifiering mjölkaktiga fläckar i omental vävnad. (A), Bild av del av hela omentum färgas med Giemsa. Serie delar av omental vävnad utvärderas av: (B) Giemsa färgning; mjölkaktiga fläckar indikeras med svarta pilar (C) H & E-färgning. och (D) IHC användning av anti-CD45-antikropp för att identifiera lymfocyter inom mjölk plats strukturen. Skalstrecket är densamma för BD och betecknar 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Äggstockscancerceller företrädesvis kolonisera peritoneal fett som innehåller mjölkaktiga fläckar. Flödescytometrisk analyser av omentum (OM), livmoder fett (UF), gonadal fett (GF) och tarmkäxet (MY) skördades från möss vid 7 dpi av ID8- tdTomato celler (vänster). Data presenterassom fold-change ökning av tdTomato-postive celler över PBS-injicerade möss (höger). Felstaplar indikerar standardfel av medelvärdet. ** Betecknar p <0,01 jämfört med PBS-kontroller. (B) Undersökning av vävnader från både standard histologi och IHC visar jämförbar kolonisering av mjölkaktiga fläckar i både omentum och splenoportal fett (efter injektion av 1x10 6 SKOV3ip.1 celler i nakna möss). Sektioner utvärderades med H & E-färgning. Närvaron av epitel (cancer) celler i lesioner bekräftades av IHC detektion av cytokeratin med hjälp av en pan-cytokeratin (pan-CK) antikropp. IHC med hjälp av en IgG-isotyp antikropp för pan-cytokeratin användes som en kontroll för färgning specificitet. Skalstrecket är densamma för alla bilder och betecknar 100 um. (C) Utvärdering av ID8 äggstockscancer kolonisering av peritoneala fettdepåer i C57BL / 6 möss vid 7 dpi. Klickahär för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ex vivo kolonisering av äggstockscancerceller att oment. Kolonnerna representerar en jämförelse av de tre experimentella betingelserna som visar naiva omenta (vänster), omenta från möss 6 h efter ip injektion av 1 x 10 6 SKOV3ip.1 celler (mitten) och omenta med SKOV3ip.1-GFP koloniserade i ex vivo förhållanden (höger). Naïve omenta (Blank), omenta koloniseras av SKOV3ip.1-GFP från in vivo-analys (bilaga in vivo) eller omenta koloniseras av SKOV3ip.1-GFP i ex vivo odlingsbetingelser (bilaga ex vivo). Fluorescens avbildning av hela omenta för GFP visar liknande kolonisering mönster för både in vivo och ex vivo-analyser (A). H & E-färgning av seriella sektioner avden omenta från fält A bekräftar närvaron av cancerceller lokaliserade till de mjölkaktiga fläckar (B). Cytokeratin för äggstockscancerceller validerar H & E-färgning (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utveckling av terapier för att rikta sprids celler kräver en mekanistisk förståelse av metastaser kolonisering, det kritiska första steget i utvecklingen av peritoneala sjukdomen. För att möta dessa frågor som vi rapporterar metoder som kan användas för att urskilja hur omentum unika kroppskonstitution och arkitektur främja äggstockscancer metastaserad kolonisering. Utmärkande för vår strategi är: 1) fokus på tidiga händelser i koloniseringen processen; 2) jämförelse av mjölkpunkt innehållande och bristfällig fettdepåer; 3) tillgång till en reproducerbar teknik för att kvantifiera milky plats volymen i vävnader; 4) tillgång till kompletterande in vivo och ex vivo metoder för att utvärdera äggstockscancerceller kolonisering av milky spotstrukturer.
Vid genomförandet av dessa studier kom vi att inse att utredarna är ofta omedvetna om placeringen av musen bukhinnenätet och förekomsten av splenoportal fett band, som tjänar som en andra källa till mjölkaktig fläck innehållande peritoneal fett. Även de tekniker som beskrivs gör det möjligt häri studier av stegen vid metastaserande kolonisering, de bara erbjuda "ögonblicksbilder" av dessa processer, och inte bedömning av kolonisering i realtid. Om lämpligt följt bör protokoll som beskrivs ge reproducerbara resultat till en rad forskare. Avgörande för framgången för dessa tekniker är: 1) identifiera och dissekera särskilda peritoneala fettvävnad som kontaminering av andra vävnadstyper kommer skeva kvantitativa data från flödescytometri; och 2) Att genomföra lämpliga stammar av transgena möss för att studera i fråga. Det bör noteras att kursstudier tids bör bestämmas för enskilda cellinjer. Empiriskt eftersom det beror på en mångfald faktorer, däribland proliferationshastighet, tid till tumör ta och metastatisk potential.
Förutom att dissekera den interaTGÄRDER av väletablerade äggstockscancercellinjer och deras omental mikromiljö som är viktiga för metastasbildning, den teknik som beskrivs häri kan också användas för att utvärdera den maligna potentialen av kliniskt härledda cellinjer som rekapitulera tidiga molekylära förändringar i serösa äggledarna intraepithelial karcinom i fimbriae i äggledarna 12-17. Även om en väg för den molekylära utvecklingen av dessa lesioner är under utveckling, krävs in vivo-studier för att bestämma den biologiska betydelsen av specifika förändringar. Kompletterande in vivo och ex vivo-analyser kan användas för att bedöma särskilda åtgärder i metastaserande koloniseringen av omental vävnad av sådan modell föregångare cellinjer Information samlats från studier kan vara nyckeln till generation av terapeutiska hypoteser och utformningen av fortsatta prekliniska studier.
Identifiera mekanismer som styr metastaserad kolonisering kan göra det möjligt att förebyggaeller kontroll av metastasbildning. Till exempel, kvinnor som löper ökad risk att utveckla äggstockscancer 18-22 (dvs. BRCA1 eller BRCA2 genmutation bärare) genomgår ofta profylaktisk salpingooforektomi för att minska risken för att utveckla peritonealdialys sjukdom 23,24. Olyckligtvis patienter ofta fortfarande utveckla HGSC grund av utväxt av ovariala cancerceller som finns inuti omentum och andra metastatiska platser vid tidpunkten för operation. Identifiering av ämnen som stör omental vävnadsmikro kan förhindra cancer cell lokalisering och / eller tillväxt i omentum. Sådana tillvägagångssätt skulle kunna användas i kombination med läkemedel som riktar äggstockscancerceller för att förhindra metastasbildning eller undertrycka cancer återväxt (efter kirurgisk debulking).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
- Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
- Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
- Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
- Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
- Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. The omentum. World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).
- Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
- Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
- Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
- Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
- Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
- Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
- Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
- Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
- Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
- Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
- Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
- Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
- Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
- King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
- Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
- Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
- Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
- Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).
