Summary
该协议细节的方法分离细胞外囊泡（电动汽车），从细胞中释放的小的膜的颗粒，从少至10微升血清样品。这种方法绕过需要超速离心，需要测定时间仅几分钟，并且使电动车从有限体积的样品的分离。
Abstract
胞外囊泡（电动汽车），从不同类型的细胞释放的膜的颗粒，持有用于临床应用的巨大潜力。它们含有核酸和蛋白质的货物和正日益被视为间通讯双方真核生物和原核生物细胞利用的手段。然而，由于它们的尺寸小，对电动汽车的隔离电流协议往往费时，繁琐，并且需要较大的样品体积和昂贵的设备，如超速离心。为了解决这些限制，我们开发了一种基于纸张免疫平台，用于分离电动汽车的亚组是容易的，高效的，并且需要的样品体积低至10微升。生物样品可以直接吸移到已经被化学修饰以捕获分子具有高亲和力的特定的EV表面标记纸测试区。我们验证该测定通过使用扫描电子显微镜（SEM），纸基酶联immunosorben吨测定（P-ELISA），和转录组分析。这些文件为基础的设备将使临床和研究设置电动车的研究，以帮助促进我们的健康和疾病EV功能的理解。
Protocol
操作步骤的总体框图如图1中提供。使用道德实践，我们收集了来自健康受试者的血液样本，并通过台中荣民总医院（TCVGH），台中，台湾在IRB批准协议获得房水样本的患者（ IRB TCVGH号CF11213-1）。
1.制造纸张的设备
- 切色谱纸放入5mm的圆的直径，以提供相同的布局为一个96孔微量滴定板。夹着这些纸片具有两个聚苯乙烯片材与注册的通孔，和层压体。
- 修改使用在下面的步骤28中所述的化学缀合方法纸装置。
- 处理纸的设备用氧等离子体（100毫瓦，1％的氧气，30秒）在等离子体室中。
注意：用3-巯丙基三甲氧基硅烷和 N-γ-马来酰亚胺琥珀酰亚胺工作时特别小心，必须采取酯（GMBS），因为它们都是湿气敏感和毒性。戴防护手套，避免吸入或与皮肤和眼睛接触。保持股市瓶子盖紧并允许它打开，以避免冷凝水之前平衡至RT。或者，打开股票瓶内充氮的手套袋中或框。分装成小药瓶，以避免频繁开股票瓶。 - 立即处理的孵育在4％（体积/体积）的3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇（200标准强度）为30分钟，溶液纸装置。
- 冲洗纸装置，用乙醇和孵化它们与0.01微摩尔/毫升GMBS在乙醇中15分钟。
- 冲洗，用乙醇（200标准强度），并培育纸装置用10μg/ ml的抗生物素蛋白在磷酸盐缓冲盐水（PBS），在4℃的溶液1小时。如果需要储存在4℃下，并在4周内使用。
- 处理纸的设备用氧等离子体（100毫瓦，1％的氧气，30秒）在等离子体室中。
- 湿纸的每个测试区与10微升的PBS含有1％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA）为察觉10微升生物素化的捕获分子3×10分钟前，3×10分钟。使用抗CD63抗体（20微克/毫升的PBS含有1％（重量/体积）BSA和0.09％（重量/体积）叠氮化钠）或膜联蛋白V（1:20，体积/体积在膜联蛋白V结合缓冲液），为捕获分子。
- 冲洗掉，用10微升相应的PBS含有1％（重量/体积）BSA或膜联蛋白V结合缓冲液进行3×1分钟，分别未结合的抗CD63抗体或膜联蛋白V的分子。
2.血清和房水样品采集与处理
- 血清集合。
- 在血清分离管中收集10毫升外周血通过静脉穿刺，轻轻颠倒试管5次。设置该管处于垂直位置，并等待30分钟。
- 离心机在1200×g下15分钟。再次传输从顶层血清到一个干净的试管中，离心以3000×g的30分钟。
- 通过0.8微米FIL通过上清器。保持样品在-80℃下直到使用。
- 房水的收集：收集房水样本的患者可直接通过侵入性操作和储存样品在-80°C，直到使用诊断眼科医生。
3.隔离外囊泡
- 点样到每个纸测试区以5微升/分钟的速率。
- 冲洗掉未结合的电动汽车用10微升相应的PBS含有1％（重量/体积）BSA或膜联蛋白V结合缓冲液进行3×1分钟，用于分别官能用抗CD63抗体或膜联蛋白V的分子，造纸设备。执行以下下游试验。
4.下游测定实施例1：扫描Electromicrographs
- 修复捕获使用10微升0.5×Karnovsky固定液10分钟官能试纸测试区的电动车。
- 冲洗了充足的PBS样品2×5分钟。
- 脱水样品随后35％乙醇10分钟，50％乙醇为2×10分钟，70％乙醇中2×10分钟，95％乙醇为2×10分钟，100％乙醇为4×10分钟。
- 临界干燥和溅射涂层与钯/金的样品中，并且检查使用在低电子加速电压操作的扫描型电子显微镜（〜5千伏）。
5.下游分析实施例2：基于纸张的ELISA
- 在PBS 1000稀释含电动车捕捉每一个测试区：添加含有抗CD9一抗5微升溶液中1。等待1分钟。
- 冲洗样品用30ml PBS中振摇在100rpm下30秒。
- 添加5微升含有溶液辣根过氧化物酶（HRP）为1 - 连接的二级抗体：1,000稀释在PBS中，并等待1分钟。
- 冲洗样品用30ml PBS中振摇在100rpm下30秒。
- 添加含有1 5微升比色底物：过氧化氢的1体积比ð3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和扫描使用台式扫描器。
6.下游试验例3：RNA分离
- 浸泡样品中35微升的聚乙烯吡咯烷酮为基础的RNA分离援助和265微升裂解/结合缓冲液裂解捕获电动车。涡大力。
- 加在分离试剂盒的裂解物提供30微升匀浆。涡大力和雪藏了10分钟。
- 使用在下面的步骤中描述的酸苯酚 - 氯仿分离提取的RNA。
- 取330微升酚 - 氯仿从瓶底层并添加到匀浆/溶胞产物。涡大力。
- 离心以10,000×g离心5分钟。水性（上部）相转移到一个干净的试管，并注意除去的体积。
- 沉淀的总RNA使用本身是在前面的步骤和共除去水相的1.25倍的体积的体积的100％乙醇llect在预热至95℃的洗提溶液的核糖核酸。
- 浓缩和进一步纯化根据生产商的方案使用RNA净化试剂盒的RNA。
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Representative Results
造纸设备的隔离电动汽车的亚组的能力有效地依靠其敏感性和特异性识别的EV表面标志。纸纤维与捕获分子的稳定修饰是通过使用抗生物素蛋白-生物素化学如别处28-30所描述实现的。化学缀合的物理吸附方法的有效性，并且在使用基于荧光的读数评估。纸张测试区被以下置换为20微克/毫升的荧光团R-藻红蛋白缀合的生物素分子（PE-生物素），在步骤1.3协议步骤1），所不同的捕获分子制备。纸张测试区，然后用PBS清洗以除去未结合的PE-生物素分子。与此相反，10微升20微克/毫升PE-生物素在PBS中含有1％（重量/体积）BSA和0.09％（重量/体积）叠氮化钠被直接点样在纸测试区为3×10分钟，随后的PBS冲洗用于进行PE-生物素染料分子的物理吸附。化学修改纸装置（“纸+交联剂+染料”）与未处理纸装置（“纸”），修改与相同的协议没有PE生物素分子（“纸+交联剂”）和纸设备与物理吸附的应用程序文件设备PE-生物素分子（“物理吸附染料”），使用图像记录系统设置为540-560毫微米的激发被扫描，575纳米长通发射，并且该数据被保存在16位文件的形式和分析使用ImageJ软件。 如图2A所示 ，制备由化学缀合方法测试区的荧光强度基本上更高，因为相比物理涂布纸测试区（p值<0.0005，每组5，学生t检验）。电动车辆的捕获也具体例举在图2B，C，其中少数电动汽车被保留在纸装置上时，所述捕获分子通过PBS溶液更换。
电动车是异质的SIZES，具体内容，和生物合成的路线。结合它们，涂覆有两种不同的EV捕获分子，抗CD63抗体和膜联蛋白V纸装置，进行制备。 CD63的四旋家族的成员（包括CD9，CD63，CD81和CD82分子）富含于EV膜31，和膜联蛋白V对磷脂酰丝氨酸（PS）的32,33有很强的亲和力。据发现，电动汽车是在早期凋亡或胁迫条件下组成性释放，在这种过程中的正常细胞的磷脂不对称性丧失，导致的PS上的EV膜的外小叶增加曝光量。 SEM图像的分析表明，CD63 +电动汽车和PS +电动汽车的尺寸分布是不同的，具有80的平均直径和分别为43纳米，（ 图3）。双尾学生t检验用于确定统计p值（p值<0.0001）。出人意料的是，CD63 +电动车出现圆，比PS大，平均+电动汽车，其中生物意义仍有待澄清。
从捕获的纸装置上电动汽车的RNA可以被提取。分析用生物分析仪显示用于从CD63 +和PS +电动汽车（ 图4A）中提取总RNA类似的总体轮廓。相比的RNA利用微流体和超离心技术提取的量，分别为约两次，每血清样品的单位体积39倍以上的RNA提取利用所述纸装置中，虽然使用的是更小的样品体积（ 见表1）。 P-ELISA可以进行对电动汽车的检测。抗CD9初级抗体和HRP缀合的第二抗体被用于本研究。 图4B显示由HRP用于施加10微升PBS中，50％的血清纸装置的酶反应产生的灰度值的变化（用PBS稀释），或100 ％血清，分别。灰度值线性增加血清样本进行测试的范围内。
例如，超速离心，都可以使用。从患者房水样品中分离与涂覆有能够在SEM图像可以看出抗CD63抗体纸装置如电动汽车表现出在图5中。
图1的纸基试验旨在分离和细胞外囊泡的特征的制造和操作步骤：（A）过滤纸被切成所希望的形状并层叠。 （B）的纸张的表面进行改性以氧等离子体的简短处理，并与3-巯基丙基三甲氧基硅烷，N- <反应/ em>的-γ-马来酰亚胺琥珀酰亚胺酯，和的NeutrAvidin，以该顺序。生物素化的捕获分子， 例如，抗体，然后可通过生物 素和的NeutrAvidin分子之间的亲和力强固定。 （C）的生物样品可以是吸移管到官能纸装置。外囊泡可以分离。 （D）下游检测，如SEM，转录和ELISA（如图所示），可以执行。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.外囊泡（EVS），可以捕获功能化纸设备具有良好的特异性和灵敏性。（A）荧光标记的生物素分子被高度固定在纸张上通过化学缀合方法（“纸+交联剂+染料”）在对比物理吸附（“物理吸附染料”）的设备。未经处理的纸（“纸”）和共轭分子（“纸+交联剂”）贡献不大的荧光强度。 （B）的代表性SEM图像示出几个电动汽车被捕获的文件在设备上的非特异性当捕获分子被替换的PBS含有1％（重量/体积）BSA中。 （C）许多电动车保留在涂有抗CD63抗体纸装置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.群外囊泡（EVS），可以有不同的粒度分布。（A）和（B）是捕获在涂有分别的抗CD63抗体和膜联蛋白V的分子，纸装置电动车辆的代表性SEM图像。 （C），CD63 +电动车看起来比在这项研究中所使用的实验条件下，PS +电动车大（p值<0.0001，N = 124和203，学生t检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.下游转录和ELISA测定法：（A）生物分析仪的数据表示的强度（y轴，以任意单位）和大小（x轴，在核苷酸（nt））荧光标记的总RNA从电动汽车中提取的分布捕获抗CD63抗体或膜联蛋白V-涂滤纸。在〜25的迁移高峰NT代表内标。 （B）的辣根过氧化物酶（HRP）在施加用PBS的10微升样品，50％血清（用PBS稀释）和100％的血清样品为纸装置的P-ELISA测定酶反应生成的灰色值改变。 请这里查看这个数字的放大版本。
图5.细胞外囊泡（电动汽车）的房水样品中，可以捕获在官能滤纸没有样品池。分离CD63的房水样品中的SEM图像+电动车从患者（a）年龄相关性黄斑变性，（B）的糖尿病黄斑水肿，和（C）的息肉状脉络膜血管病变，分别。加载/ 52722 / 52722fig5highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
| 隔离法 | 捕获分子 | 血清第一卷。 （微升） | 提取一般RNA（NG） | 平均提取RNA /血清 （PG /微升） | 平均RNA /血清比值 | 参考 |
| 微流体装置 | 抗人CD63 | 400 | 4.14 | 10.4 | 20 | 20 |
| 造纸设备 | 抗人CD63 | 72 | 1.49±0.08 | 20.7 | 39 | 22 |
| 造纸设备 | 膜联蛋白V | 72 | 0.99±0.26 | 13.8 | 26 | 22 |
| 超速离心 | - | 2000 | 1.06±0.64 | 0.53 | 1 | |
| 血清 | - | 72 | 1.23±0.58 | 17 | 32 | 22 |
从健康志愿者的血清样品中提取表1总RNA用生物分析仪（n = 4时对所有的条件）进行分析。
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Discussion
为胞外囊泡的子组的成功分离的最重要的步骤是：1）一个良好的纸张选择; 2）稳定和高的纸纤维的表面上的捕获分子的覆盖范围; 3）样品的妥善处理; 4）一般实验室卫生习惯。
多孔材料已经被用于许多廉价且设备无测定。它们可以具有可调孔径，多用途功能，成本低和高的表面与体积之比，允许液体的被动的芯吸。我们选择色谱纤维素纸1级主要针对其适当的孔径和低蛋白吸附。相比于另一种常用的多孔材料，硝酸纤维素，纤维素纸具有低得多的非特异性蛋白质吸附34。我们还发现在这项研究电动车的非特异性很少捕获。另外，它的颗粒保留水平，11微米，比电动汽车35的尺寸大，从而允许在特定的捕获相反，电动车的物理诱捕。在这里，我们专注于一个更小尺寸的电动汽车，通过一个0.8微米的过滤器，其步骤可以被修改时较大的电动汽车是需要研究经过血清样品。
表面化学改性可一键实现捕获分子的稳定，高覆盖面的提高EV隔离效率的手段上。纤维素表面改性进行了审查36,37。有高数量的羟基（-OH）基团的纤维素的表面上，它们可以与硅烷反应被用氧等离子体或其他缩合方法活化后，得到稳定的化学的Si-OC键。在这项研究中所用的硅烷是（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷，（的MeO）3 Si-所示（CH 2）3 -SH。硫醇（-SH）基团可与GMBS反应以提供短空臂（0.73毫微米）和交联基团，夫妻与伯胺。捕获分子与胺基团可缀合直接专线小巴。在这项研究中，但是，我们的NeutrAvidin缀合代替，以提供一个总方案偶联各种捕获分子是生物素标记。然而，在EV亚型特异性标志物的共识尚未达成17。的NeutrAvidin具有非常强的亲和力的生物素和一个近中性等电点（pH值6.3），最小化与带负电荷的对象的非特异性相互作用， 例如电动汽车的表面上。与此相反，抗生物素蛋白10.5的等电点携带正电荷，在中性pH值。抗CD63抗体的浓度较高时比在Chen 等人 20，主要是由于施加的小体积和纸装置的较大的表面与体积比。然而，其量和吸附到纸纤维蛋白的组合物还没有被表征，其可以是样品依赖性。因此，必须小心解释蛋白质分析的结果时，可采取。
收集的双向ological样品应轻轻处理和快速地处理，以防止artifactually增大的EV电平。因此建议以除去细胞和血小板，如果有的话，保存前在-80℃下。在EV研究的样品处理电流的标准化可以在本次审查17被发现。
正确的实验室卫生措施应被采用。一定要穿戴手套和变化频繁的手套，以尽量减少引进的尘埃粒子和核糖核酸的。从电动车RNA在细胞培养条件培养基分离可以作为相比，提取使用超速离心机方法（未出版），从电动车的产量集中使用的纸张的设备超过70倍的浓度。
本文所描述的协议使用与捕获分子的化学修饰来隔离电动车辆的不同亚组的纤维素纸的设备。该方法简便，高效，尤其是有价值的，当样本量是有限的。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由台湾国科会grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2（CC）和NSC 101-2628-E-007-011-MY3（CMC），以及荣总部分支持医院和台湾联合研究计划大学系统（CC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatography Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Grade 1 cellulose paper |
| (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane | Sigma Aldrich | 175617 | This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | Absolute, 200 Proof, molecular biology grade |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Often referred to as Cohn fraction V. |
| N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive. |
| Avidin | Pierce Biotechnology | 31000 | NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin |
| Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 | Ancell | 215-030 | clone AHN16.1/46-4-5 |
| biotinylated annexin V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS) |
| Primary anti-CD9 and secondary antibody | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated |
| Serum separation tubes | BD Biosciences | 367991 | Clot activator and gel for serum separation |
| Annexin V binding buffer | BD Biosciences | 556454 | 10x; dilute to 1x prior to use. |
| TMB substrate reagent set | BD Biosciences | 555214 | The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA isolation kit | Life Technologies | AM1560 | MirVana RNA isolation kit |
| Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid | Life Technologies | AM9690 | Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides. |
| RNA cleanup kit | Qiagen Inc. | 74004 | MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA. |
| Plasma chamber | March Instruments | PX-250 | |
| Scanning electron microscope | Hitachi Ltd. | S-4300 | |
| Desktop scanner | Hewlett-Packard Company | Photosmart B110 | 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used. |
| Image-record system | J&H Technology Co | GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used. |
References
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
- Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
- Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
- Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
- Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
- Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
- Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
- Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
- Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
- Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
- Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
- Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
- Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
- Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
- Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
- Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
- Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
- Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
- Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
- Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
- Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
- Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
