Summary
Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des vésicules extracellulaires (VE), de petites particules libérées par des cellules membranaires, d'aussi peu que 10 échantillons de sérum ul. Cette approche évite la nécessité d'ultracentrifugation, ne nécessite que quelques minutes de temps de dosage, et permet l'isolement des véhicules électriques à partir d'échantillons de volumes limités.
Abstract
Vésicules extracellulaires (VE), membraneuses particules libérées par divers types de cellules, détiennent un grand potentiel pour des applications cliniques. Ils contiennent cargaison d'acide nucléique et des protéines et sont de plus en plus reconnus comme un moyen de communication intercellulaire utilisé à la fois par eucaryote et les cellules procaryotes. Toutefois, en raison de leur petite taille, les protocoles actuels pour l'isolement des véhicules électriques sont souvent beaucoup de temps, lourde, et nécessitent de grands volumes d'échantillons et des équipements coûteux, comme une ultracentrifugation. Pour répondre à ces limitations, nous avons développé une plate-forme d'immunoaffinité à base de papier pour séparer les sous-groupes de véhicules électriques qui est facile, efficace et nécessite des volumes d'échantillon aussi faibles que 10 pi. Les échantillons biologiques peuvent être introduits à la pipette directement sur les zones de test de papier qui ont été chimiquement modifiés avec des molécules de capture ayant une affinité élevée à des marqueurs spécifiques de la surface d'exposition. Immunosorben lié à une enzyme, à base de papier Nous valider l'essai en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB)t essais (P-ELISA), et l'analyse du transcriptome. Ces dispositifs à base de papier permettront l'étude des véhicules électriques dans la clinique et le contexte de la recherche pour faire avancer notre compréhension des fonctions EV en matière de santé et de la maladie.
Protocol
Un schéma général de la procédure d'opération est fourni à la figure 1. Utilisation de pratiques éthiques, nous avons recueilli des échantillons de sang de sujets sains, et obtenu des échantillons de l'humeur aqueuse de patients à travers le Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sous CISR protocoles approuvé ( CISR TCVGH n ° CF11213-1).
1. fabrication de dispositifs papier
- Couper le papier de Chromatographie en cercles de 5 mm de diamètre pour fournir la même disposition que une plaque de microtitrage à 96 puits. Sandwich ces morceaux de papier avec deux feuilles de polystyrène ayant son siège trous traversants, et stratifié.
- Modifier dispositifs de papier en utilisant le procédé de conjugaison chimique décrite dans ce qui suit les étapes 28.
- Traiter les dispositifs de papier avec un plasma d'oxygène (100 mW, 1% d'oxygène, 30 sec) dans une chambre à plasma.
ATTENTION: Une attention particulière doit être prise lorsque vous travaillez avec 3-mercaptopropyltriméthoxysilane et-maléimidobutyryloxy de succinimide Nester (GMBS), car ils sont à la fois sensibles à l'humidité et toxique. Porter des gants de protection et éviter l'inhalation ou contact avec la peau et les yeux. Gardez le stock flacon hermétiquement fermé et le laisser se stabiliser à la température ambiante avant d'ouvrir pour éviter la condensation de l'eau. Vous pouvez également ouvrir la bouteille de l'intérieur d'un sac ou une boîte gants remplie d'azote. Aliquote en petits flacons pour éviter l'ouverture fréquente du stock bouteille. - Immédiatement incubat traitée dispositifs de papier dans une (v / v) à 4% de 3-mercaptopropyltriméthoxysilane dans de l'éthanol (200 proof) pendant 30 min.
- Rincer les dispositifs de papier avec de l'éthanol et de les incuber avec 0,01 umol / ml dans de l'éthanol GMBS pendant 15 min.
- Rincer avec de l'éthanol (200 proof) et incuber dispositifs de papier avec 10 ug / ml d'avidine en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 1 heure à 4 ° C. Conserver à 4 ° C si nécessaire, et d'utiliser dans les 4 semaines.
- Traiter les dispositifs de papier avec un plasma d'oxygène (100 mW, 1% d'oxygène, 30 sec) dans une chambre à plasma.
- Mouiller chacune des zones de test de papier avec 10 ul de PBS contenant 1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) Pour 3 x 10 min avant de repérer 10 ul biotinylé molécules de capture pour 3 x 10 min. Utiliser anticorps anti-CD63 (20 ug / ml dans du PBS contenant 1% (p / v) de BSA et 0,09% (p / v) d'azoture de sodium) ou l'annexine V (01:20, v / v dans du tampon de liaison d'annexine V) comme molécules de capture.
- Rincer molécules d'anticorps ou l'annexine V anti-CD63 non liés en utilisant 10 ul correspondant PBS contenant 1% (p / v) de BSA ou de l'annexine V solutions de tampon de liaison pour 1 × 3 min, respectivement.
2. sérum et humeur aqueuse Prélèvement et traitement
- Collecte le sérum.
- Recueillir 10 ml de sang périphérique par ponction veineuse dans des tubes de séparation du sérum et inverser doucement le tube cinq fois. Réglez le tube en position verticale et attendre 30 min.
- Centrifuger à 1200 xg pendant 15 min. Transférer le sérum à partir de la couche supérieure dans un tube propre, et centrifuger à nouveau à 3000 g pendant 30 min.
- Passez le surnageant à travers un fil de 0,8 umter. Conserver l'échantillon à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- La collecte de l'humeur aqueuse: recueillir des échantillons d'humeur aqueuse de patients diagnostiqués par un ophtalmologiste directement par des procédures et des échantillons de magasins invasive à -80 ° C jusqu'à utilisation.
3. Isolement de vésicules extracellulaires
- Échantillons ponctuels sur chaque zone de test de papier à un taux de 5 pi / min.
- Rincer VE non liées avec 10 pi correspondant PBS contenant 1% (p / v) de BSA ou de l'annexine V solutions de tampon de liaison pour 1 × 3 min pour les dispositifs de papier fonctionnalisées avec des anticorps anti-CD63 ou l'annexine V molécules, respectivement. Effectuez les tests suivants en aval.
4. Essai Exemple 1 en aval: Electromicrographs d'analyse
- Fix VE capturées sur la zone de test de papier fonctionnalisé en utilisant 10 ul 0,5 × fixateur de Karnovsky pendant 10 min.
- Rincer les échantillons avec une vaste PBS pendant 2 × 5 min.
- Déshydrater leles échantillons à la suite de l'éthanol à 35% pendant 10 min, éthanol à 50% pendant 2 x 10 min, de l'éthanol à 70% pendant 2 x 10 min, éthanol à 95% pendant 2 x 10 min et 100% d'éthanol pendant 4 x 10 min.
- Critical sec et pulvérisation enrober les échantillons avec du palladium / or, et d'examiner l'aide d'un microscope électronique à balayage fonctionnant à basse tension d'accélération des électrons (~ 5 kV).
5. aval Assay Exemple 2: ELISA à la version papier
- Ajouter une solution à 5 pi contenant l'anticorps primaire anti-CD9 à 1: 1000 dilution dans du PBS à chaque zone de test contenant VE capturées. Attendre 1 min.
- Rincer les échantillons avec 30 ml de PBS agité à 100 rpm pendant 30 s.
- Ajouter 5 ul solution contenant la peroxydase de raifort (HRP) lié en anticorps secondaire au 1: 1000 dilution dans du PBS et attendre 1 min.
- Rincer les échantillons avec 30 ml de PBS agité à 100 rpm pendant 30 s.
- Ajouter un substrat colorimétrique 5 ul contenant 1: 1 en volume d'un peroxyde d'hydrogèned 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et numériser à l'aide d'un scanner de bureau.
Exemple 6. En aval de test 3: Isolement de l'ARN
- Plonger les échantillons dans 35 ul d'aide d'isolement d'ARN à base de polyvinylpyrrolidone et 265 pl de lyse / tampon de liaison pour lyser les véhicules électriques capturées. Vortex vigoureusement.
- Ajouter 30 ul d'homogénat fourni dans le kit d'isolation au lysat. Vortex vigoureusement et mis sur la glace pendant 10 min.
- Extraire l'ARN en utilisant une séparation de l'acide phénol-chloroforme décrit dans les étapes suivantes.
- Prendre 330 ul de phénol-chloroforme à partir de la couche inférieure de la bouteille et ajouter à l'homogénat / lysat. Vortex vigoureusement.
- Centrifuger à 10 000 g pendant 5 min. Transférer la phase aqueuse (supérieure) dans un tube propre et noter le volume enlevé.
- Précipiter l'ARN total avec 100% d'éthanol du volume qui est de 1,25 fois le volume de la phase aqueuse éliminée à l'étape précédente et collect l'ARN dans la solution d'élution préchauffé à 95 ° C.
- Concentrer et purifier davantage l'ARN en utilisant un kit de nettoyage de l'ARN selon le protocole du fabricant.
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Representative Results
La capacité du dispositif de papier pour isoler les sous-groupes de VE se appuie de manière efficace sur la reconnaissance sensible et spécifique de marqueurs de surface EV. La modification stable de fibres de papier avec des molécules de capture est obtenue en utilisant la chimie de l'avidine-biotine tel que décrit ailleurs 28-30. L'efficacité de la conjugaison chimique et celle de la méthode de physisorption est évalué en utilisant les lectures basées sur la fluorescence. Les zones de test de papier sont préparés suivant le protocole de l'étape 1), sauf la molécule de capture est remplacée par des molécules de biotine 20 ug / ml R-phycoérythrine fluorophore conjugué à (PE-biotine) dans l'étape 1.3. Les zones de test de papier sont ensuite rincées avec du PBS pour éliminer les molécules de PE-biotine non liés. En revanche, 10 ul 20 pg / ml de PE-biotine dans du PBS contenant 1% (p / v) de BSA et 0,09% (p / v) d'azoture de sodium est directement repéré sur la zone d'essai du papier de 3 x 10 min, suivi par du PBS rincer pendant la conduite de l'physisorption des molécules de colorant PE-biotine. Chimiquementdispositifs de papier modifiés ("papier + réticulation + colorant») ainsi que des dispositifs de papier non transformés («papier»), les dispositifs de papier modifiés avec le même protocole sans l'application de molécules de PE-biotine ("papier + agent de réticulation") et les dispositifs de papier avec physisorbée PE-biotine molécules ("physisorbée-dye") sont analysés en utilisant un système d'image record à 540-560 nm excitation, 575 nm longue passe-émission, et les données sont enregistrées sous forme de fichiers 16 bits et analysé en utilisant le logiciel ImageJ. Comme le montre la figure 2A, l'intensité de fluorescence des zones de test préparés par le procédé de conjugaison chimique est nettement plus élevé, par rapport aux zones de test de papier couché physiquement (valeur p <0,0005, n = 5, t-test de Student). La saisie des véhicules électriques est également spécifique comme le montre la figure 2B, C, où quelques véhicules électriques sont retenus sur le dispositif de papier lorsque les molécules de capture sont remplacés par une solution de PBS.
VE sont hétérogènes sizes, contenus spécifiques, et des voies de biogenèse. Pour les fixer, des dispositifs de papier couché avec deux molécules de capture différentes EV, des anticorps anti-CD63 et de l'annexine V, ont été préparés. CD63, un membre de la famille des tétraspanines (qui comprend des molécules CD9, CD63, CD81 et CD82) est enrichi sur membrane EV 31, et l'annexine V a une forte affinité pour la phosphatidylsérine (PS) 32,33. On constate que les véhicules électriques sont libérés constitutive au cours apoptose précoce ou dans des conditions de stress, dans lequel processus normal cellule asymétrie des phospholipides est perdu, conduisant à une exposition accrue des PS sur le feuillet externe de la membrane de EV. Les analyses des images MEB montrent que les distributions de taille des CD63 + VE et PS + VE sont différents, avec des diamètres moyens de 80 et 43 nm, respectivement (figure 3) .Le test t de Student bilatéral est utilisé pour déterminer la p-valeur statistique (valeur p <0,0001). Étonnamment, CD63 + VE apparaissent plus rond et plus grand que PS + VE en moyenne, biologiquesignification reste à élucider.
ARN à partir de véhicules électriques capturées sur le dispositif de papier peut être extrait. Analyses avec un bioanalyseur montré profils globaux similaires pour ARN totaux extraits de CD63 + et PS + VE (figure 4A). Par rapport aux quantités d'ARN extraits en utilisant les techniques microfluidiques et ultracentrifugation, respectivement environ deux fois et 39 fois plus d'ARN par unité de volume d'échantillon de sérum ont été extraits en utilisant le dispositif de papier, bien que l'utilisation d'un volume d'échantillon plus petites (tableau 1). P-ELISA peut être effectué pour la détection des véhicules électriques. Anticorps primaire anti-CD9 et anticorps secondaire conjugué à HRP sont utilisés dans cette étude. Figure 4B affiche changements de valeur de gris produites par la réaction enzymatique de HRP pour les appareils de papier appliquées avec 10 pi de PBS,% de sérum 50 (dilué avec du PBS), ou 100 % de sérum, respectivement. La valeur de gris augmente linéairement dans la plage d'échantillons de sérum testé.
par exemple, ultracentrifugation, doivent être utilisés. VE de patients échantillons de l'humeur aqueuse isolés avec des dispositifs de papier couché avec des anticorps anti-CD63 peut être vu dans les images SEM ont montré que dans la Figure 5.
Figure 1. Le procédé de fabrication et le fonctionnement des dosages à base de papier destinés à l'isolement et à la caractérisation de vésicules extracellulaires. (A) de filtre en papier est découpé en la forme souhaitée et stratifié. (B) la surface du papier est modifiée par un bref traitement de plasma d'oxygène et amené à réagir avec du 3-mercaptopropyltriméthoxysilane, le N </ Em> -γ-maléimidobutyryloxy succinimide ester, et NeutrAvidin, dans cet ordre. Des molécules de capture biotinylée, par exemple des anticorps, peuvent être immobilisés par l'intermédiaire de la forte affinité entre la biotine et les molécules neutravidine. (C) échantillons biologiques peut être pipette sur le dispositif de papier fonctionnalisé. Vésicules extracellulaires peuvent être isolés. (D) des essais en aval, tels que SEM, transcriptome, et ELISA (illustré), peut être effectuée. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. vésicules extracellulaires (VE) peuvent être capturés sur les appareils de papier fonctionnalisés avec une bonne spécificité et de sensibilité. (A) molécules de biotine marqué par fluorescence sont très immobilisés sur le papierappareil via processus de conjugaison chimique («papier + réticulation + colorant") contrairement à adsorption physique ("physisorbée-dye"). Papier non traité («papier») et des molécules de conjugaison ("papier + réticulation") contribuent peu à l'intensité de fluorescence. (B) Une image SEM représentant montrant quelques véhicules électriques sont capturées sur le dispositif de papier non spécifique lorsque les molécules de capture sont remplacés par du PBS contenant 1% (p / v) de BSA. (C) de nombreux véhicules électriques sont conservés sur les périphériques de papier couché avec des anticorps anti-CD63. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Sous-groupes de vésicules extracellulaires (VE) peuvent avoir différentes distributions de taille. (A)et (B) sont des images MEB représentatifs de véhicules électriques capturées sur des dispositifs de papier revêtues d'anticorps anti-CD63 et des molécules d'annexine V, respectivement. (C) CD63 + VE paraissent plus grands que PS + VE dans des conditions expérimentales utilisées dans cette étude (p <0,0001, n = 124 et 203, le test t de Student). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. transcriptome Aval et dosages ELISA. (A) Données Bioanalyseur montrant les intensités (axe Y, en unités arbitraires) et la taille (axe x, en nucléotides (nt)) distributions d'ARN total marqué par fluorescence extraites de véhicules électriques capturés sur l'anti-CD63-anticorps ou annexine V-enduit des papiers-filtres. Le pic migrant à ~ 25 représente nt un étalon interne. (B) change gris de valeur produite par la réaction enzymatique de la peroxydase de raifort (HRP) dans l'essai P-ELISA pour les dispositifs de papier appliqué à des échantillons de 10 ul de PBS, 50% de sérum (dilué dans du PBS) et 100 échantillons% de sérum. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. vésicules extracellulaires (VE) dans des échantillons d'humeur aqueuse peuvent être capturées sur un papier filtre fonctionnalisé sans l'échantillon mise en commun. Images MEB de CD63 isolée + VE dans les échantillons d'humeur aqueuse de patients avec (A) de la dégénérescence maculaire liée à l'âge, (B) maculaire diabétique l'œdème, et (C) de la vasculopathie choroïdienne polypoïdale, respectivement.charge / 52722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Procédé d'isolement | molécule de capture | sérum vol. (Ul) | ARN extrait moyenne (ng) | Extrait moyenne ARN / sérum (Pg / ul) | rapport de la moyenne ARN / sérum | ref |
| dispositif microfluidique | CD63 anti-humain | 400 | 4.14 | 10,4 | 20 | 20 |
| dispositif de papier | CD63 anti-humain | 72 | 1,49 ± 0,08 | 20,7 | 39 | 22 |
| dispositif de papier | annexine V | 72 | 0,99 ± 0,26 | 13,8 | 26 | 22 |
| ultracentrifugation | - | 2000 | 1,06 ± 0,64 | 0,53 | 1 | |
| sérum | - | 72 | 1,23 ± 0,58 | 17 | 32 | 22 |
Tableau 1. L'ARN total extrait à partir d'échantillons de sérum provenant de volontaires sains analysés avec un bioanalyseur (n = 4 pour tous les conditions).
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Discussion
Les étapes les plus critiques pour l'isolement réussi de sous-groupes de vésicules extracellulaires sont: 1) un bon choix de papier; 2) une couverture stable et élevé de molécules de capture sur la surface des fibres de papier; 3) la manipulation correcte des échantillons; et 4) la pratique de l'hygiène générale de laboratoire.
Les matériaux poreux ont été utilisés dans de nombreux tests peu coûteux et sans équipement. Ils peuvent avoir une taille de pores accordable, la fonctionnalité polyvalente, de faible coût et de haut rapport surface-volume passive permettant l'effet de mèche des fluides. Nous avons choisi chromatographie cellulose du papier grade 1 principalement pour sa taille de pores appropriée et une faible adsorption des protéines. Par rapport à un autre matériaux poreux couramment utilisés, la nitrocellulose, papier de cellulose a beaucoup plus faible adsorption des protéines non spécifique 34. Nous trouvons peu capture non spécifique d'EVS dans cette étude. En outre, le niveau de rétention de particules 11 um, est plus grande que la taille des véhicules électriques 35, ce qui permet de capture spécifique àContrairement à piégeage physique des véhicules électriques. Ici, nous nous concentrons sur les véhicules électriques de plus petite taille en passant échantillons de sérum à travers un filtre de 0,8 um, étape qui peut être modifié lorsque de plus grandes véhicules électriques doivent être étudiés.
Modification de surface chimique peut être une clé pour atteindre une couverture stable et élevé de molécules de capture sur la surface en tant que moyen d'améliorer l'efficacité de l'isolement EV. Des modifications de surface de la cellulose ont été examinés 36,37. Il existe un grand nombre de groupes hydroxyle (-OH) sur la surface de la cellulose et ils peuvent réagir avec le silane pour donner des liaisons Si-OC chimiques stable après avoir été activé par plasma d'oxygène ou tout autre procédé de condensation. Le silane utilisé dans cette étude est le (3-mercaptopropyl) triméthoxysilane, (MeO) 3 Si- (CH 2) 3 -SH. Le groupe thiol (-SH) peut réagir avec le GMBS à fournir un espace de bras court (0,73 nm) et un groupe de réticulation qui couple avec des amines primaires. molécules de capture avec des groupes amine peuvent être conjuguésdirectement à GMBS. Dans cette étude, cependant, nous NeutrAvidin conjugué à la place de fournir un schéma général pour conjuguer différentes molécules de capture qui sont marqué à la biotine. Cependant, un consensus sur les marqueurs spécifiques du sous-type EV n'a pas encore été atteint 17. NeutrAvidin a une très forte affinité à la biotine et un point isoélectrique presque neutre (pH 6,3), en minimisant les interactions non spécifiques avec des objets chargés négativement, par exemple la surface des véhicules électriques. En revanche, l'avidine avec un point isoélectrique de 10,5 transporte des charges positives à pH neutre. Une concentration plus élevée d'anticorps anti-CD63 est utilisé que dans Chen et al. 20, principalement en raison du faible volume appliqué et le plus grand rapport surface-volume du dispositif d'alimentation. Cependant, la quantité et les compositions de protéines adsorbées sur les fibres du papier ne ont pas été caractérisé, qui peut être dépendant de l'échantillon. Par conséquent, des précautions doivent être prises lors de l'interprétation des résultats de l'analyse des protéines.
Bi collectéesgiques échantillons doivent être traités avec douceur et traitées rapidement pour empêcher niveaux EV artifactually augmentation. Il est recommandé pour éliminer les cellules et les plaquettes, le cas échéant, avant le stockage à -80 ° C. Une standardisation actuelle de manipulation des échantillons dans la recherche EV peut être trouvée dans cet avis 17.
Pratiques d'hygiène de laboratoire appropriée devrait être utilisée. Toujours porter des gants et des gants changement fréquemment afin de minimiser l'introduction de particules de poussière et ribonucléases. Isolement de l'ARN d'EVS dans les milieux de culture conditionné cellulaires peut obtenir des concentrations de plus de 70 fois supérieure à l'aide de dispositifs de papier par rapport à celle extraite de véhicules électriques concentré en utilisant la méthode d'ultracentrifugation (non publié).
Le protocole décrit ici utilise des dispositifs de papier de cellulose modifiés chimiquement avec les molécules de capture pour isoler différents sous-groupes de véhicules électriques. La méthode est simple, efficace et particulièrement utile lorsque le volume de l'échantillon est limitée.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par NSC 99-2320-B-007-005-MY2 du Conseil national des sciences de Taiwan (CC) et NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) et le Veterans General Hôpitaux et University System of Programme conjoint de recherche de Taiwan (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatography Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Grade 1 cellulose paper |
| (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane | Sigma Aldrich | 175617 | This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | Absolute, 200 Proof, molecular biology grade |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Often referred to as Cohn fraction V. |
| N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive. |
| Avidin | Pierce Biotechnology | 31000 | NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin |
| Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 | Ancell | 215-030 | clone AHN16.1/46-4-5 |
| biotinylated annexin V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS) |
| Primary anti-CD9 and secondary antibody | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated |
| Serum separation tubes | BD Biosciences | 367991 | Clot activator and gel for serum separation |
| Annexin V binding buffer | BD Biosciences | 556454 | 10x; dilute to 1x prior to use. |
| TMB substrate reagent set | BD Biosciences | 555214 | The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA isolation kit | Life Technologies | AM1560 | MirVana RNA isolation kit |
| Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid | Life Technologies | AM9690 | Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides. |
| RNA cleanup kit | Qiagen Inc. | 74004 | MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA. |
| Plasma chamber | March Instruments | PX-250 | |
| Scanning electron microscope | Hitachi Ltd. | S-4300 | |
| Desktop scanner | Hewlett-Packard Company | Photosmart B110 | 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used. |
| Image-record system | J&H Technology Co | GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used. |
References
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