Summary
Dettagli Questo protocollo di un metodo per isolare vescicole extracellulari (EV), piccole particelle membranose rilasciate dalle cellule, da un minimo di 10 campioni di siero microlitri. Questo approccio elude la necessità di ultracentrifugazione, richiede solo pochi minuti di tempo di saggio, e permette l'isolamento di EVs da campioni di volumi limitati.
Abstract
Vescicole extracellulari (SVE), particelle membranose rilasciate da vari tipi di cellule, in possesso di un grande potenziale per le applicazioni cliniche. Essi contengono acidi nucleici e proteine carico e sono sempre più riconosciuti come un mezzo di comunicazione intercellulare utilizzato sia da eucarioti e cellule procariote. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni, attuali protocolli per l'isolamento di EVs sono spesso molto tempo, ingombrante, e richiedono grandi volumi di campione e attrezzature costose, come un'ultracentrifuga. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una piattaforma immunoaffinità cartaceo per la separazione sottogruppi di veicoli elettrici che è facile, efficiente, e richiede volumi di campione a partire da 10 ml. I campioni biologici possono essere pipettati direttamente su aree di prova di carta che sono stati modificati chimicamente con le molecole di cattura che hanno alta affinità per specifici marcatori di superficie EV. Abbiamo la convalida del saggio utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM), a base di carta immunosorben enzimaticot test (P-ELISA), e l'analisi del trascrittoma. Questi dispositivi cartacei consentiranno lo studio dei veicoli elettrici nella clinica e l'impostazione della ricerca per far progredire la nostra comprensione delle funzioni EV in salute e malattia.
Protocol
Uno schema generale della procedura operativa è prevista in Figura 1. Utilizzando pratiche etiche, abbiamo raccolto campioni di sangue di soggetti sani, e ottenuto campioni di umore acqueo pazienti attraverso la Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sotto IRB approvato protocolli ( IRB TCVGH No. CF11213-1).
1. Realizzazione di dispositivi di carta
- Tagliare la carta per cromatografia in cerchi di 5 mm di diametro per fornire lo stesso layout come una micropiastra a 96 pozzetti. Sandwich questi pezzi di carta con due fogli di polistirolo con sede fori passanti, e laminato.
- Modificare i dispositivi di carta con il metodo coniugazione chimica descritto nei passaggi seguenti 28.
- Trattare dispositivi di carta con plasma di ossigeno (100 mW, 1% di ossigeno, 30 sec) in una camera di plasma.
ATTENZIONE: Particolare cautela deve essere presa quando si lavora con 3 mercaptopropil trimetossisilano e N--γ maleimidobutyryloxy succinimmideestere (GMBS), poiché entrambi sono sensibili all'umidità e tossici. Indossare guanti protettivi ed evitare l'inalazione o contatto con la pelle e gli occhi. Tenere il flacone magazzino ben chiuso e lasciarlo equilibrare a RT prima di aprire per evitare la formazione di condensa. In alternativa, aprire la bottiglia stock all'interno di un sacchetto guanto di azoto riempito o scatola. Aliquota in piccole fiale per evitare frequente apertura della bottiglia stock. - Subito Incubare trattati dispositivi di carta in un (v / v) soluzione al 4% di 3-mercaptopropil trimetossisilano in etanolo (200 proof) per 30 min.
- Risciacquare dispositivi di carta con etanolo e incubare con 0,01 mmol / GMBS ml in etanolo per 15 min.
- Sciacquare con etanolo (200 proof) e incubare dispositivi di carta con 10 mg / ml soluzione avidina in tampone fosfato (PBS) per 1 ora a 4 ° C. Conservare a 4 ° C, se necessario, e utilizzare entro 4 settimane.
- Trattare dispositivi di carta con plasma di ossigeno (100 mW, 1% di ossigeno, 30 sec) in una camera di plasma.
- Bagnare ogni zona di prova di carta con 10 microlitri PBS contenente 1% (w / v) di albumina sierica bovina (BSA) Per 3 × 10 min prima di avvistare 10 ml biotinilati molecole di cattura per 3 × 10 min. Utilizzare l'anticorpo anti-CD63 (20 ug / ml in PBS contenente 1% (w / v) BSA e 0,09% (w / v) di sodio azide) o annessina V (1:20, v / v in annessina V binding buffer) come molecole di cattura.
- Risciacquare anticorpi o annessina V molecole anti-CD63 non legati con 10 microlitri corrispondente PBS contenente 1% (w / v) BSA o annessina V soluzioni tampone vincolante per 3 × 1 min, rispettivamente.
2. siero e acqueo Umore Raccolta e lavorazione
- Collezione Serum.
- Raccogliere 10 ml di sangue periferico mediante prelievo venoso in tubi di siero di separazione e capovolgere delicatamente la provetta per cinque volte. Impostare il tubo in posizione verticale e attendere 30 min.
- Centrifugare a 1.200 xg per 15 min. Trasferire il siero di strato superiore in una provetta pulita, e centrifugare di nuovo a 3.000 xg per 30 min.
- Passare il surnatante con un fil di 0,8 micronter. Mantenere il campione a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Collezione umore acqueo: raccogliere campioni di umore acqueo pazienti diagnosticati da un oculista direttamente attraverso procedure e conservare i campioni invasiva a -80 ° C fino al momento dell'uso.
3. Isolamento di extracellulare vescicole
- Campioni Spot su ogni zona di prova di carta a una velocità di 5 ml / min.
- Risciacquare veicoli elettrici non legati con 10 ml corrispondenti PBS contenente 1% (w / v) BSA o annexin V vincolante soluzioni tampone per 3 × 1 min per dispositivi carta funzionalizzati con molecole di anticorpi o annessina V anti-CD63, rispettivamente. Eseguire le seguenti saggi a valle.
4. valle Assay Esempio 1: Electromicrographs scansione
- Fissare EV catturati su funzionalizzata zona di prova di carta utilizzando 10 microlitri 0,5 × fissante di Karnovsky per 10 min.
- Sciacquare i campioni con ampio PBS per 2 × 5 min.
- Disidratare ilcampioni con conseguente 35% di etanolo per 10 min, 50% di etanolo per 2 × 10 min, 70% di etanolo per 2 × 10 min, 95% di etanolo per 2 × 10 min, e il 100% di etanolo per 4 × 10 min.
- Critical asciutto e sputtering rivestire i campioni con palladio / oro, ed esaminare con un microscopio elettronico a scansione funzionare a bassa tensione di accelerazione di elettroni (~ 5 kV).
5. valle Assay Esempio 2: a base di carta ELISA
- Aggiungere una soluzione 5 ml contenente anticorpo primario anti-CD9 a 1: 1.000 di diluizione in PBS per ogni zona di prova contenente EV catturati. Attendere 1 min.
- Risciacquare i campioni con 30 ml di PBS agitata a 100 rpm per 30 sec.
- Aggiungere a 5 ml soluzione contenente perossidasi (HRP) -linked anticorpo secondario a 1: 1.000 di diluizione in PBS e attendere 1 min.
- Risciacquare i campioni con 30 ml di PBS agitata a 100 rpm per 30 sec.
- Aggiungere un substrato colorimetrico 5 microlitri contenente rapporto 1: 1 volume di idrogeno perossido di und 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e la scansione con uno scanner da tavolo.
6. A valle Assay Esempio 3: RNA Isolation
- Immergere i campioni in 35 ml di aiuti isolamento RNA a base polivinilpirrolidone-e 265 ml di lisi / binding buffer per la lisi EV catturati. Vortex vigorosamente.
- Aggiungere 30 microlitri omogenato fornito nel kit di isolamento al lisato. Vortex energicamente e mettere in ghiaccio per 10 min.
- Estrarre l'RNA utilizzando acido separazione fenolo-cloroformio descritto nei seguenti passaggi.
- Prendere 330 ml di fenolo-cloroformio dallo strato fondo della bottiglia e aggiungere al omogenato / lisato. Vortex vigorosamente.
- Centrifugare a 10.000 xg per 5 min. Trasferire la fase acquosa (superiore) in una provetta pulita e notare il volume rimosso.
- Precipitare il RNA totale con il 100% di etanolo del volume che è 1,25 volte il volume della fase acquosa rimossa nel passaggio precedente e collect l'RNA nella soluzione di eluizione preriscaldato a 95 ° C.
- Concentrato e purificare ulteriormente l'RNA utilizzando un kit di RNA di pulizia secondo il protocollo del produttore.
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Representative Results
La capacità del dispositivo di carta per isolare sottogruppi di veicoli elettrici si basa in modo efficiente sul suo riconoscimento sensibile e specifico di marcatori di superficie EV. La modifica stabile di fibre di carta con molecole di cattura è ottenuto utilizzando la chimica avidina-biotina come descritto altrove 28-30. L'efficacia di coniugazione chimica e quella del metodo fisisorbimento è valutata utilizzando letture basati sulla fluorescenza. Le zone di prova carta vengono preparati seguendo passo protocollo 1), tranne la molecola di cattura viene sostituita con molecole di biotina 20 mg / ml fluoroforo R-ficoeritrina coniugata (PE-biotina) in fase 1.3. Le zone di prova carta vengono poi sciacquati con PBS per rimuovere le molecole PE-biotina non legati. Al contrario, 10 microlitri 20 ug / ml PE-biotina in PBS contenente 1% (w / v) BSA e 0,09% (w / v) di sodio azide è macchiato direttamente sulla zona di test carta per 3 × 10 min, seguito da PBS sciacquare per condurre la fisisorbimento di molecole di colorante in PE-biotina. ChimicamenteDispositivi di carta modificati ("carta + crosslinker + dye") insieme con i dispositivi di carta non lavorati ("carta"), i dispositivi di carta modificati con lo stesso protocollo senza l'applicazione di molecole di PE-biotina ("paper + reticolante") e dispositivi di carta con physisorbed molecole di biotina PE-("physisorbed-dye") vengono analizzati utilizzando un sistema di image-record stabilito a 540-560 nm di eccitazione, 575 emissioni-pass lungo nm, ei dati vengono salvati sotto forma di file a 16 bit e analizzato utilizzando il software ImageJ. Come mostrato in Figura 2A, intensità di fluorescenza delle zone prova preparati con il metodo coniugazione chimica è sostanzialmente più elevato, rispetto alle zone di prova fisicamente carta patinata (p-value <0,0005, n = 5, t-test di Student). La cattura dei veicoli elettrici è anche specifico come esemplificato nella figura 2B, C, dove alcuni veicoli elettrici vengono conservati sul dispositivo carta quando le molecole di cattura sono sostituiti da una soluzione PBS.
EV sono eterogenei in siZES, contenuti specifici e percorsi biogenesi. A legarli, dispositivi di carta rivestiti di due differenti molecole di cattura EV, gli anticorpi anti-CD63 e annessina V, sono stati preparati. CD63, un membro della famiglia tetraspanine (che comprende molecole CD9, CD63, CD81 e CD82) è arricchito sul EV membrana 31, e annessina V ha una forte affinità per fosfatidilserina (PS) 32,33. Si è constatato che i veicoli elettrici vengono rilasciati costitutivamente nella prima apoptosi o in condizioni di stress, in cui normale processo cellulare asimmetria fosfolipidi è perso, portando ad una maggiore esposizione della PS sul foglietto esterno della membrana EV. Le analisi delle immagini SEM mostrano che le distribuzioni di dimensione delle CD63 + EV e PS + EV sono diverse, con diametri medi di 80 e 43 nm, rispettivamente (Figura 3) .Il test t di Student a due code viene utilizzato per determinare il valore di p-statistico (p-value <0,0001). Sorprendentemente, CD63 + EV appaiono più rotondo e più grande di PS + EV, in media, che biologicosignificato ancora da chiarire.
RNA da EVs catturati sul dispositivo carta può essere estratto. Analisi con bioanalizzatore hanno mostrato profili globali simili per RNA totale estratto da CD63 + e PS + EV (Figura 4A). Rispetto alle quantità di RNA estratti utilizzando le tecniche microfluidica e ultracentrifugazione, rispettivamente a circa due volte e 39 volte più RNA per unità di volume di campione di siero sono stati estratti utilizzando il dispositivo della carta, anche se con un piccolo volume di campione (Tabella 1). P-ELISA può essere effettuato per il rilevamento dei veicoli elettrici. Anti-CD9 anticorpo primario e anticorpo secondario HRP-coniugato sono utilizzati in questo studio. Figura 4B mostra valore cambia grigie prodotte dalla reazione enzimatica HRP per dispositivi in carta applicate con 10 microlitri di PBS, 50% di siero (diluiti con PBS), o 100 % di siero, rispettivamente. Il valore di grigio aumenta linearmente all'interno della gamma di campioni di siero testato.
ad esempio, ultracentrifugazione, devono essere utilizzati altri metodi di isolamento. EV da campioni acquosi umore dei pazienti isolati con dispositivi di carta rivestiti con anticorpi anti-CD63 può essere visto nelle immagini SEM, come mostrato in figura 5.
Figura 1. La procedura di realizzazione e di funzionamento saggi cartacei volte a isolamento e la caratterizzazione di vescicole extracellulari. (A) Filtro carta viene tagliata nella forma desiderata e laminato. (B) La superficie della carta viene modificato con un breve trattamento di plasma di ossigeno e fatto reagire con 3-mercaptopropil trimetossisilano, N </ Em> -γ-maleimidobutyryloxy estere succinimmide, e neutravidina, in questo ordine. Molecole di cattura biotinilato, ad esempio, anticorpi, possono essere immobilizzati con la forte affinità tra biotina e molecole neutravidina. (C) può essere Biosamples pipetta sul dispositivo di carta funzionalizzato. Vescicole extracellulari possono essere isolati. (D) test a valle, come il SEM, trascrittoma, ed ELISA (illustrato), può essere eseguita. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. vescicole extracellulari (EV) possono essere catturati su dispositivi di carta funzionalizzati con buona specificità e sensibilità. (A) molecole di biotina fluorescente altamente sono immobilizzati sulla cartadispositivo tramite processo di coniugazione chimica ("carta + crosslinker + dye") in contrasto con adsorbimento fisico ("physisorbed-dye"). Carta Lordo ("carta") e molecole di coniugazione ("carta + reticolante") contribuiscono poco alla intensità di fluorescenza. (B) Una immagine rappresentativa SEM mostra alcuni EVs vengono acquisite sul dispositivo carta non specificamente quando le molecole di cattura è sostituito da PBS contenente 1% (w / v) BSA. (C) Molti veicoli elettrici vengono conservati sui dispositivi di carta rivestiti con anticorpi anti-CD63. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. I sottogruppi di vescicole extracellulari (EV) possono avere distribuzioni diverse dimensioni. (A)e (B) sono immagini rappresentative SEM di veicoli elettrici catturati su dispositivi di carta rivestiti con anticorpi anti-CD63 e molecole annessina V, rispettivamente. (C) CD63 + EV appaiono più grande di PS + EV in condizioni sperimentali utilizzate in questo studio (p-value <0,0001, n = 124 e 203, Test t). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. trascrittoma Downstream e ELISA test. (A) dati Bioanalyzer mostrano le intensità (asse y, in unità arbitrarie) e le dimensioni (asse x, in nucleotidi (nt)) distribuzioni di RNA totale fluorescenza marcata estratti da veicoli elettrici catturati on anti-CD63 anticorpi o annessina V-rivestito filtri di carta. Il picco migrazione a ~ 25 rappresenta nt uno standard interno. (B) valore cambia grigio prodotte dalla reazione enzimatica della perossidasi di rafano (HRP) nel saggio P-ELISA per dispositivi carta applicato con 10 campioni microlitri di PBS, 50% di siero (diluito con PBS) e 100 campioni di siero%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. vescicole extracellulari (EV) in campioni nell'umore acqueo possono essere catturati su carta da filtro funzionalizzata senza campione pooling. Immagini SEM di isolati CD63 + EV in campioni nell'umore acqueo da pazienti con (A) la degenerazione maculare legata all'età, (B) maculare diabetico edema, e (C) polypoidal vasculopatia coroidale, rispettivamente.Carico / 52722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| metodo di isolamento | capture molecola | siero vol. (Ml) | RNA estratto medio (ng) | RNA / siero estratto media (Pg / ml) | rapporto RNA / sierica media | arbitro |
| dispositivo a microfluidi | CD63 anti-uomo | 400 | 4.14 | 10.4 | 20 | 20 |
| Dispositivo di carta | CD63 anti-uomo | 72 | 1.49 ± 0.08 | 20.7 | 39 | 22 |
| Dispositivo di carta | annessina V | 72 | 0.99 ± 0.26 | 13.8 | 26 | 22 |
| ultracentrifugazione | - | 2.000 | 1.06 ± 0.64 | 0.53 | 1 | |
| siero | - | 72 | 1.23 ± 0.58 | 17 | 32 | 22 |
Tabella 1. L'RNA totale estratto da campioni di siero di volontari sani analizzata con un bioanalizzatore (n = 4 per tutte le condizioni).
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Discussion
Le fasi più critiche per il successo isolamento di sottogruppi di vescicole extracellulari sono: 1) una buona scelta di carta; 2) di copertura stabile ed elevato di molecole di cattura sulla superficie delle fibre di carta; 3) la corretta manipolazione dei campioni; e 4) la pratica di laboratorio di igiene generale.
Materiali porosi sono stati utilizzati in molti saggi economici e senza attrezzatura. Essi possono avere dimensioni sintonizzabile pori, funzionalità versatile, a basso costo ed elevato rapporto superficie-volume di consentire assorbimento passivo di fluidi. Abbiamo scelto cromatografia cellulosa carta di grado 1 soprattutto per la sua corretta dimensione dei pori e basso assorbimento di proteine. Rispetto ad altri materiali porosi comunemente usati, nitrocellulosa, carta di cellulosa ha una più bassa non specifico delle proteine 34. Troviamo anche poco cattura non specifica dei veicoli elettrici in questo studio. Inoltre, il livello di ritenzione delle particelle, 11 micron, è maggiore della dimensione di EVs 35, consentendo la cattura specificocontrasto alla cattura fisica dei veicoli elettrici. Qui, ci concentriamo su veicoli elettrici di dimensioni inferiori passando campioni di siero attraverso un filtro 0,8 micron, che passo può essere modificato quando EV più grandi sono da studiare.
Modifica superficiale chimico può essere una chiave per ottenere una copertura stabile ed elevato di molecole di cattura sulla superficie come un mezzo per migliorare l'efficienza di isolamento EV. Modifiche di superficie di cellulosa sono stati esaminati 36,37. Ci sono un numero elevato di idrossile (-OH) gruppi sulla superficie della cellulosa e possono reagire con silano invia chimici stabili legami Si-OC dopo l'attivazione con plasma di ossigeno o un altro processo di condensazione. Il silano usato in questo studio è (3-mercaptopropil) trimetossisilano, (MeO) 3 Si- (CH 2) 3 -SH. Il gruppo (-SH) tiolo può reagire con GMBS di fornire un braccio di breve (0,73 nm) e un gruppo di reticolazione che si accoppia con ammine primarie. Cattura molecole con gruppi amminici possono essere coniugatia GMBS direttamente. In questo studio, però, abbiamo coniugato neutravidina invece a fornire uno schema generale di coniugare diverse molecole di cattura che sono biotina marcata. Tuttavia, il consenso su marcatori specifici del sottotipo EV deve ancora essere raggiunto 17. Neutravidina ha una forte affinità con biotina e un punto isoelettrico quasi neutro (pH 6,3), riducendo al minimo le interazioni aspecifiche con oggetti caricati negativamente, ad esempio la superficie di EVs. In contrasto, avidina con un punto isoelettrico di 10,5 trasporta cariche positive a pH neutro. Una maggiore concentrazione di anticorpo anti-CD63 viene utilizzato quello in Chen et al. 20, principalmente a causa del piccolo volume applicato e maggiore rapporto superficie-volume del dispositivo di carta. Tuttavia, la quantità e la composizione delle proteine adsorbite sulle fibre di carta non sono state caratterizzate, che può essere dipende dal campione. Quindi, bisogna fare attenzione quando si interpretano i risultati delle analisi delle proteine.
Bi Raccoltacampioni ological devono essere maneggiati con delicatezza e trattati rapidamente per evitare che un aumento dei livelli artifactually EV. Si raccomanda di rimuovere le cellule e piastrine, se presente, prima di conservazione a -80 ° C. Una corrente di standardizzazione di manipolazione del campione nella ricerca EV può essere trovato in questa recensione 17.
Una corretta prassi di igiene laboratorio dovrebbe essere impiegato. Indossare sempre guanti e cambiare i guanti frequentemente per ridurre al minimo l'introduzione di particelle di polvere e ribonucleasi. Isolamento di RNA da EVs in media-coltura condizionato di cellule può produrre più di 70 volte maggiore concentrazioni che utilizzano dispositivi di carta rispetto a quello estratto da EVs concentrata usando il metodo ultracentrifuga (non pubblicata).
Il protocollo qui descritto utilizza dispositivi di carta cellulosa modificati chimicamente con le molecole di cattura per isolare diversi sottogruppi di veicoli elettrici. Il metodo è semplice, efficace e particolarmente utile quando il volume del campione è limitata.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NSC 99-2320-B-007-005-MY2 Taiwan Consiglio Nazionale della Scienza grants- (CC) e NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), e il Veterans General Ospedali e sistema universitario di Taiwan Programma comune di ricerca (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatography Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Grade 1 cellulose paper |
| (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane | Sigma Aldrich | 175617 | This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | Absolute, 200 Proof, molecular biology grade |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Often referred to as Cohn fraction V. |
| N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive. |
| Avidin | Pierce Biotechnology | 31000 | NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin |
| Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 | Ancell | 215-030 | clone AHN16.1/46-4-5 |
| biotinylated annexin V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS) |
| Primary anti-CD9 and secondary antibody | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated |
| Serum separation tubes | BD Biosciences | 367991 | Clot activator and gel for serum separation |
| Annexin V binding buffer | BD Biosciences | 556454 | 10x; dilute to 1x prior to use. |
| TMB substrate reagent set | BD Biosciences | 555214 | The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA isolation kit | Life Technologies | AM1560 | MirVana RNA isolation kit |
| Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid | Life Technologies | AM9690 | Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides. |
| RNA cleanup kit | Qiagen Inc. | 74004 | MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA. |
| Plasma chamber | March Instruments | PX-250 | |
| Scanning electron microscope | Hitachi Ltd. | S-4300 | |
| Desktop scanner | Hewlett-Packard Company | Photosmart B110 | 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used. |
| Image-record system | J&H Technology Co | GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used. |
References
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