Summary
Este protocolo detalla un método para aislar vesículas extracelulares (SVE), pequeñas partículas membranosas liberadas de las células, a partir de tan poco como 10 muestras de suero l. Este enfoque evita la necesidad de ultracentrifugación, requiere sólo unos pocos minutos de tiempo de ensayo, y permite el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de muestras de volúmenes limitados.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs), partículas membranosas liberados de varios tipos de células, tienen un gran potencial para aplicaciones clínicas. Contienen ácido nucleico y proteínas de carga y se reconoce cada vez más como un medio de comunicación intercelular utilizado tanto por eucariota y células procariotas. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, los protocolos actuales para el aislamiento de los vehículos eléctricos son a menudo consume mucho tiempo, engorroso, y requieren grandes volúmenes de muestras y equipos caros, tales como una ultracentrífuga. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado una plataforma de inmunoafinidad en papel para separar subgrupos de vehículos eléctricos que es fácil, eficiente y requiere volúmenes de muestra tan bajas como 10 l. Las muestras biológicas pueden ser pipetearon directamente sobre zonas de ensayo de papel que han sido modificados químicamente con moléculas de captura que tienen alta afinidad a los marcadores específicos de la superficie EV. Immunosorben ligado a enzimas Validamos el ensayo mediante el uso de microscopía electrónica de barrido (SEM), en papelensayos t (P-ELISA), y el análisis del transcriptoma. Estos dispositivos basados en papel permitirán el estudio de los vehículos eléctricos en la clínica y el marco de la investigación para ayudar a avanzar nuestra comprensión de las funciones de EV en la salud y la enfermedad.
Protocol
Un esquema general del procedimiento de operación se presenta en la Figura 1. El uso de prácticas éticas, se recogieron muestras de sangre de sujetos sanos, y se obtuvieron muestras de humor acuoso de los pacientes a través del Hospital General de Veteranos Taichung (TCVGH), Taichung, Taiwán bajo IRB aprobó protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).
1. La fabricación de dispositivos de papel
- Cortar papel de cromatografía en círculos de 5 mm de diámetro para proporcionar el mismo diseño que una placa de microtitulación de 96 pocillos. Sandwich estas piezas de papel con dos láminas de poliestireno con domicilio orificios pasantes y laminado.
- Modificar los dispositivos de papel utilizando el método de conjugación química se describe en los pasos 28 de la siguiente.
- Tratar dispositivos de papel con plasma de oxígeno (100 mW, 1% de oxígeno, 30 sec) en una cámara de plasma.
PRECAUCIÓN: Se debe tener especial cuidado cuando se trabaja con trimetoxisilano 3-mercaptopropil y N--γ maleimidobutiriloxi succinimidaéster (GMBS), ya que ambos son sensibles a la humedad y tóxico. Use guantes de protección y evitar la inhalación o el contacto con la piel y los ojos. Mantenga la botella stock bien cerrado y deje que se equilibre a temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación de agua. Alternativamente, abra la botella stock dentro de una bolsa de guantes llena de nitrógeno o caja. Alícuota en pequeños frascos para evitar la apertura frecuente de la botella stock. - Inmediatamente incubado tratada dispositivos de papel en un (v / v) solución al 4% de 3-mercaptopropil trimetoxisilano en etanol (200 prueba) durante 30 min.
- Enjuague dispositivos de papel con etanol y se incuba con GMBS / ml 0.01 mu mol en etanol durante 15 min.
- Enjuague con etanol (200 prueba) e incubar dispositivos de papel con 10 mg / ml solución de avidina en tampón fosfato salino (PBS) durante 1 hora a 4 ° C. Almacenar a 4 ° C si es necesario, y utilizar un plazo de 4 semanas.
- Tratar dispositivos de papel con plasma de oxígeno (100 mW, 1% de oxígeno, 30 sec) en una cámara de plasma.
- Mojar cada zonas de ensayo de papel con 10 l de PBS que contiene 1% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) Durante 3 x 10 min antes de la detección de 10 l biotinilados moléculas de captura para 3 × 10 min. Utilizar Anti-CD63 anticuerpo (20 g / ml en PBS que contenía 1% (w / v) de BSA y 0,09% (w / v) de azida de sodio) o anexina V (01:20, v / v en tampón de unión de anexina V) como moléculas de captura.
- Enjuague anticuerpo o anexina V moléculas anti-CD63 no unidas utilizando 10 l correspondiente PBS que contenía 1% (w / v) BSA o anexina V vinculante soluciones tampón durante 3 x 1 min, respectivamente.
2. El suero y el humor acuoso Recolección y Procesamiento
- Recogida de suero.
- Recoger 10 ml de sangre periférica por punción venosa en tubos de separación de suero y de invertir suavemente el tubo de cinco veces. Ajuste el tubo en posición vertical y esperar 30 min.
- Centrifugar a 1200 × g durante 15 min. Transferir el suero de la capa superior a un tubo limpio, y se centrifuga de nuevo a 3000 × g durante 30 min.
- Pasar el sobrenadante a través de un fil 0,8 micraster. Mantenga la muestra a -80 ° C hasta su uso.
- Acuosa colección humor: recoger muestras del humor acuoso de pacientes diagnosticados por un oftalmólogo directamente a través de procedimientos y almacenar muestras invasiva a -80 ° C hasta su uso.
3. Aislamiento de vesículas extracelular
- Las muestras puntuales en cada zona de prueba de papel a una velocidad de 5 l / min.
- Enjuague EVs no unidos con 10 l correspondientes PBS que contiene 1% (w / v) BSA o anexina V vinculante soluciones tampón durante 3 x 1 min para los dispositivos de papel funcionalizados con anti-CD63 de anticuerpos o moléculas de anexina V, respectivamente. Lleve a cabo los siguientes ensayos posteriores.
4. Downstream Ensayo Ejemplo 1: Electromicrographs de exploración
- Fijar EVs capturados en funcionalizado zona de prueba de papel utilizando 10 l 0,5 × fijador de Karnovsky durante 10 min.
- Enjuague las muestras con amplia PBS durante 2 × 5 min.
- Deshidratar elmuestras con etanol posterior 35% durante 10 min, etanol al 50% durante 2 x 10 min, etanol al 70% durante 2 x 10 min, etanol al 95% durante 2 x 10 min, y etanol 100% para 4 × 10 min.
- Crítico seco y pulverización catódica recubrir las muestras con paladio / oro, y examinar utilizando un microscopio electrónico de barrido operado a baja tensión de aceleración de electrones (~ 5 kV).
5. Aguas abajo el Ejemplo de Ensayo 2: ELISA basado en Papel
- Añadir una solución de 5 l que contiene anti-CD9 anticuerpo primario a 1: 1.000 dilución en PBS a cada zona de ensayo que contiene EVs capturados. Espere 1 min.
- Enjuagar las muestras con 30 ml de PBS agitó a 100 rpm durante 30 seg.
- Añadir a 5 l solución que contiene peroxidasa de rábano (HRP) -vinculada anticuerpo secundario a 1: 1000 dilución en PBS y esperar 1 min.
- Enjuagar las muestras con 30 ml de PBS agitó a 100 rpm durante 30 seg.
- Añadir un sustrato colorimétrico 5 l que contiene 1: 1 relación de volumen de peróxido de hidrógeno unad 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) y escanear con un escáner de escritorio.
6. Ejemplo Ensayo de Downstream 3: Aislamiento de ARN
- Sumergir las muestras en 35 l de ayuda ARN aislamiento a base de polivinilpirrolidona y 265 l de lisis / tampón de unión para la lisis de los vehículos eléctricos capturados. Vortex vigorosamente.
- Añadir 30 l de homogeneizado proporcionado en el kit de aislamiento al lisado. Vortex vigorosamente y se puso en hielo durante 10 min.
- Extraer el ARN usando ácido separación de fenol-cloroformo descrito en los pasos siguientes.
- Tomar 330 l de fenol-cloroformo de la capa de fondo de la botella y añadir a la homogenado / lisado. Vortex vigorosamente.
- Centrifugar a 10.000 xg durante 5 min. Pasar la fase acuosa (superior) a un tubo limpio y tenga en cuenta el volumen extraído.
- Precipitar el ARN total con etanol al 100% del volumen que es 1,25 veces el volumen de la fase acuosa eliminado en el paso anterior y collect el ARN en la solución de elución precalentado a 95 ° C.
- Concentrar y purificar aún más el ARN usando un kit de ARN de limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.
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Representative Results
La capacidad del dispositivo de papel para aislar subgrupos de los vehículos eléctricos se basa de manera eficiente a partir de su reconocimiento sensible y específica de los marcadores de superficie EV. La modificación estable de fibras de papel con moléculas de captura se logra mediante el uso de la química de avidina-biotina como se describe en otra parte 28-30. La eficacia de la conjugación química y la del método de fisisorción se evalúa utilizando lecturas basadas en fluorescencia. Las zonas de ensayo de papel se preparan siguiendo el protocolo de paso 1), excepto la molécula de captura se sustituye con moléculas de biotina 20 mcg / ml fluoróforo R-ficoeritrina-conjugado (PE-biotina) en el paso 1.3. Las zonas de ensayo de papel se enjuagan con PBS para eliminar las moléculas de biotina-PE no unidos. En contraste, 10 l 20 mg / ml PE-biotina en PBS que contenía 1% (w / v) de BSA y 0,09% (w / v) de azida de sodio se vio directamente sobre la zona de prueba de papel para 3 × 10 min, seguido por PBS enjuague para la realización de la fisisorción de moléculas de colorante-PE biotina. Químicamentedispositivos de papel modificados ("papel + reticulante + tinte") junto con dispositivos de papel sin procesar ("papel"), dispositivos de papel modificados con el mismo protocolo sin la aplicación de moléculas de biotina-PE dispositivos de papel con fisisorbida ("papel + reticulante") y se guarda PE-biotina moléculas ("fisisorbida-dye") son digitalizadas mediante un sistema de imagen de registro ajustado a 540-560 nm de excitación, 575 de emisión de larga-pass nm, y los datos en forma de archivos de 16 bits y se analizó utilizando el software ImageJ. Como se muestra en la Figura 2A, la intensidad de fluorescencia de las zonas de ensayo preparados por el método de conjugación química es sustancialmente mayor, en comparación con zonas de ensayo de papel estucado físicamente (valor de p <0,0005, n = 5, prueba t de Student). La captura de los vehículos eléctricos es también específica como se ejemplifica en la figura 2B, C, donde pocos vehículos eléctricos son retenidos en el dispositivo de papel cuando las moléculas de captura se sustituyen por una solución de PBS.
EVs son heterogéneos en siZES, contenidos específicos, y las rutas de la biogénesis. Para obligar a ellos, dispositivos de papel recubierto con dos moléculas de captura EV diferentes, anticuerpos anti-CD63 y anexina V, se prepararon. CD63, un miembro de la familia tetraspanin (que incluye CD9, CD63, CD81 y CD82 moléculas) está enriquecida en EV membrana 31, y anexina V tiene una fuerte afinidad por la fosfatidilserina (PS) 32,33. Se ha encontrado que los vehículos eléctricos son liberados constitutivamente durante la apoptosis temprana o bajo condiciones de estrés, en el que se pierde proceso de asimetría de fosfolípidos normal de las células, lo que lleva a un aumento de la exposición de PS en el exterior prospecto de la membrana EV. Los análisis de las imágenes de SEM muestran que las distribuciones de tamaño de CD63 + EVs y PS + EVs son diferentes, con diámetros medios de 80 y 43 nm, respectivamente (Figura 3) .La prueba t de Student de dos colas se utiliza para determinar el valor de p estadística (valor de p <0,0001). Sorprendentemente, CD63 + EV aparecen más redondo y más grande que PS + EVs en promedio, lo biológicoimportancia que queda por esclarecer.
ARN de EVs capturados en el dispositivo de papel se puede extraer. Los análisis con un bioanalizador mostraron perfiles generales similares para RNAs totales extraídos de CD63 + y PS + EVs (Figura 4A). En comparación con las cantidades de ARN extraído por medio de las técnicas de microfluidos y ultracentrifugación, respectivamente aproximadamente dos veces y 39 veces más ARN por unidad de volumen de la muestra de suero se extrajeron utilizando el dispositivo de papel, aunque utilizando un menor volumen de muestra (Tabla 1). P-ELISA puede llevarse a cabo para la detección de los vehículos eléctricos. Anti-CD9 anticuerpo primario y anticuerpo secundario conjugado con HRP se utilizan en este estudio. Figura 4B muestra los cambios de valor de gris producidos por la reacción enzimática de HRP para los dispositivos de papel aplicadas con 10 l de PBS, 50% de suero (diluido con PBS), o 100 % de suero, respectivamente. El valor de gris aumenta linealmente dentro de la gama de muestras de suero probado.
por ejemplo, ultracentrifugación, se van a utilizar. Vehículos eléctricos a partir de muestras de humor acuoso de pacientes aislados con dispositivos de papel recubiertas con anticuerpos anti-CD63 se puede ver en las imágenes de SEM como mostraron en la Figura 5.
La Figura 1. El procedimiento de fabricación y el funcionamiento de los ensayos basados en papel destinados a aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares. (A) filtro de papel se corta en la forma deseada y se lamina. (B) La superficie del papel se modifica con un breve tratamiento de plasma de oxígeno y se hace reaccionar con 3-mercaptopropil trimetoxisilano, N </ Em> -γ-maleimidobutiriloxi éster de succinimida, y NeutrAvidin, en ese orden. Moléculas de captura biotinilado, por ejemplo, anticuerpos, se pueden inmovilizar a través de la fuerte afinidad entre la biotina y moléculas neutravidina. (C) muestras biológicas puede ser pipeta en el dispositivo de papel funcionalizado. Vesículas extracelulares pueden ser aislados. (D) Los ensayos posteriores, como la SEM, transcriptoma, y ELISA (muestra), se puede realizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. vesículas extracelulares (SVE) pueden ser capturados en los dispositivos de papel funcionalizados con buena especificidad y sensibilidad. (A) moléculas de biotina marcadas fluorescentemente son altamente inmovilizados sobre el papeldispositivo a través de proceso de conjugación química ("papel + reticulante + tinte") en contraste con la adsorción física ("fisisorbida-dye"). El papel sin procesar ("papel") y moléculas de conjugación ("papel + reticulante") contribuyen poco a la intensidad de la fluorescencia. Una imagen representativa SEM que muestra pocos vehículos eléctricos (B) son capturados en el dispositivo de papel no específicamente cuando las moléculas de captura se sustituye por PBS con 1% (w / v) BSA. (C) Muchos vehículos eléctricos son retenidos en los dispositivos de papel recubiertas con anticuerpos anti-CD63. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los subgrupos de vesículas extracelulares (EVs) pueden tener diferentes distribuciones de tamaño. (A)y (B) son imágenes representativas de SEM de EVs capturados en los dispositivos de papel recubiertas con anticuerpos anti-CD63 y moléculas de anexina V, respectivamente. (C) CD63 + EV aparecen más grandes que PS + vehículos eléctricos en condiciones experimentales utilizadas en este estudio (p-valor <0,0001, n = 124 y 203, la prueba t de Student). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. transcriptoma aguas abajo y ensayos ELISA. (A) los datos que muestran las intensidades Bioanalyzer (eje y, en unidades arbitrarias) y el tamaño (eje x, en nucleótidos (nt)) distribuciones de ARN total marcado fluorescentemente extraídos de EVs capturados en anti-CD63 recubierto V-anticuerpo o anexina papeles de filtro. El pico que migraba a ~ 25 representa nt un patrón interno. Cambios en el valor del gris producido por la reacción enzimática de la peroxidasa de rábano picante (HRP) en el ensayo P-ELISA para los dispositivos de papel aplicado con 10 muestras l de PBS, 50% de suero (diluido con PBS) y 100 muestras de suero% (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. vesículas extracelulares (EVs) en muestras de humor acuoso se pueden capturar en papel de filtro funcionalizado y sin acumulación de muestra. Imágenes SEM de aislado CD63 + EVs en muestras de humor acuoso de pacientes con (A) la degeneración macular relacionada con la edad, (B) macular diabético edema, y (C) vasculopatía coroidea polipoidal, respectivamente.carga / 52722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| método de aislamiento | captura molécula | vol suero. (L) | ARN media extraída (ng) | promedio extraído ARN / suero (Pg / l) | relación de promedio de ARN / suero | árbitro |
| dispositivo de microfluidos | CD63 anti-humano | 400 | 4.14 | 10.4 | 20 | 20 |
| dispositivo de papel | CD63 anti-humano | 72 | 1.49 ± 0.08 | 20.7 | 39 | 22 |
| dispositivo de papel | anexina V | 72 | 0.99 ± 0.26 | 13.8 | 26 | 22 |
| ultracentrifugación | - | 2000 | 1.06 ± 0.64 | 0.53 | 1 | |
| suero | - | 72 | 1,23 ± 0,58 | 17 | 32 | 22 |
Tabla 1. ARN total extraído de muestras de suero de voluntarios sanos analizó con un Bioanalyzer (n = 4 para todas las condiciones).
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Discussion
Los pasos más críticos para el éxito en el aislamiento de los subgrupos de vesículas extracelulares son: 1) una buena opción de papel; 2) la cobertura estable y alto de moléculas de captura en la superficie de las fibras de papel; 3) el manejo adecuado de las muestras; y 4) las prácticas de higiene general de laboratorio.
Los materiales porosos se han utilizado en muchos ensayos baratas y equipo libre. Pueden tener el tamaño de poro sintonizable, funcionalidad versátil, de bajo coste y alta relación de superficie a volumen que permite efecto de mecha pasiva de fluidos. Elegimos cromatografía de celulosa de papel de grado 1 principalmente por su tamaño de poro adecuado y baja adsorción de proteínas. En comparación con otros materiales porosos utilizados comúnmente, nitrocelulosa, papel de celulosa tiene adsorción inespecífica de proteínas mucho más bajo 34. También encontramos poca captura no específica de los vehículos eléctricos en este estudio. Además, su nivel de retención de partículas, 11 m, es mayor que el tamaño de los vehículos eléctricos 35, lo que permite la captura específico encontraste con atrapamiento físico de los vehículos eléctricos. Aquí, nos centramos en los vehículos eléctricos de un tamaño más pequeño que pasa por las muestras de suero a través de un filtro de 0,8 micras, etapa que puede ser modificada cuando los vehículos eléctricos más grandes deben ser estudiadas.
Modificación de la superficie química puede ser una clave para lograr una cobertura estable y alto de moléculas de captura en la superficie como un medio de mejorar la eficiencia del aislamiento EV. Modificaciones de la superficie de la celulosa han sido revisados 36,37. Hay un gran número de hidroxilo (-OH) grupos en la superficie de la celulosa y pueden reaccionar con silano para dar químicas estables enlaces Si-OC después de ser activado con plasma de oxígeno u otro proceso de condensación. El silano utilizado en este estudio es de (3-mercaptopropil) trimetoxisilano, (MeO) 3 Si- (CH 2) 3 -SH. El grupo (-SH) tiol puede reaccionar con GMBS para proporcionar un brazo corto espacio (0,73 nm) y un grupo de reticulación que las parejas con aminas primarias. Moléculas de captura con grupos amino pueden conjugarsea GMBS directamente. En este estudio, sin embargo, se conjugaron NeutrAvidin en lugar de proporcionar un esquema general para conjugar varias moléculas de captura que son marcado con biotina. Sin embargo, el consenso sobre los marcadores específicos de subtipo EV aún no se ha llegado a 17. NeutrAvidin tiene una muy fuerte afinidad a biotina y un punto isoeléctrico casi neutro (pH 6,3), minimizando las interacciones no específicas con objetos cargados negativamente, por ejemplo, la superficie de los vehículos eléctricos. En contraste, la avidina con un punto isoeléctrico de 10,5 lleva cargas positivas a pH neutro. Una mayor concentración de anticuerpo anti-CD63 se usa de aquél en Chen et al. 20, principalmente debido al pequeño volumen aplicado y la proporción más grande de superficie a volumen de dispositivo de papel. Sin embargo, la cantidad y las composiciones de proteínas adsorbidas sobre las fibras de papel no se han caracterizado, que puede ser dependiente de la muestra. Por lo tanto, se debe tener cuidado al interpretar los resultados del análisis de proteínas.
Bi recopiladamuestras meto- deben manejarse con cuidado y procesados rápidamente para evitar que el aumento de los niveles artificialmente EV. Se recomienda eliminar las células y plaquetas, en su caso, antes de su almacenamiento a -80 ° C. Una estandarización actual de manejo de la muestra en la investigación EV se puede encontrar en esta revisión 17.
Prácticas de higiene laboratorio adecuado debe ser empleado. Siempre use guantes y cambiarse los guantes con frecuencia para minimizar la introducción de partículas de polvo y ribonucleasas. Aislamiento de ARN a partir de EVs en medios de cultivo acondicionado de células puede producir más de 70 veces mayores concentraciones utilizando dispositivos de papel en comparación con la extraída de EVs concentró utilizando el método de ultracentrífuga (no publicado).
El protocolo se describe en este documento utiliza dispositivos de papel de celulosa modificada químicamente con moléculas de captura para aislar los diferentes subgrupos de los vehículos eléctricos. El método es simple, eficiente, y especialmente valiosa cuando el volumen de la muestra es limitada.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta obra fue financiada en parte por el Consejo de Seguridad Nacional 99-2320-B-007-005-MY2 el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán grants- (CC) y NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), y el General de Veteranos Hospitales y Sistema Universitario del Programa Común de Investigación de Taiwán (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatography Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Grade 1 cellulose paper |
| (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane | Sigma Aldrich | 175617 | This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | Absolute, 200 Proof, molecular biology grade |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Often referred to as Cohn fraction V. |
| N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive. |
| Avidin | Pierce Biotechnology | 31000 | NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin |
| Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 | Ancell | 215-030 | clone AHN16.1/46-4-5 |
| biotinylated annexin V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS) |
| Primary anti-CD9 and secondary antibody | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated |
| Serum separation tubes | BD Biosciences | 367991 | Clot activator and gel for serum separation |
| Annexin V binding buffer | BD Biosciences | 556454 | 10x; dilute to 1x prior to use. |
| TMB substrate reagent set | BD Biosciences | 555214 | The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA isolation kit | Life Technologies | AM1560 | MirVana RNA isolation kit |
| Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid | Life Technologies | AM9690 | Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides. |
| RNA cleanup kit | Qiagen Inc. | 74004 | MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA. |
| Plasma chamber | March Instruments | PX-250 | |
| Scanning electron microscope | Hitachi Ltd. | S-4300 | |
| Desktop scanner | Hewlett-Packard Company | Photosmart B110 | 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used. |
| Image-record system | J&H Technology Co | GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used. |
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