Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Published: April 3, 2015 doi: 10.3791/52722
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية)، والجسيمات غشائي صغيرة أطلق سراحهم من الخلايا، من اقل من 10 عينات مصل ميكرولتر. هذا النهج تلتف الحاجة إلى تنبيذ فائق، لا يتطلب سوى بضع دقائق من الوقت الفحص، وتمكن من عزل المركبات الكهربائية من عينات من وحدات التخزين محدودة.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية)، والجسيمات غشائي المفرج عنهم من أنواع مختلفة من الخلايا، عقد إمكانات كبيرة للتطبيقات السريرية. أنها تحتوي على حمض النووي والبروتين البضائع ويتم الاعتراف بشكل متزايد كوسيلة للتواصل بين الخلايا التي يستخدمها كلا حقيقي النواة والخلايا بدائيات النوى. ولكن نظرا لصغر حجمها، والبروتوكولات الحالية لعزل المركبات الكهربائية وغالبا ما تكون مضيعة للوقت، مرهقة، وتتطلب كميات عينة كبيرة ومعدات باهظة الثمن، مثل نابذة فائقة السرعة. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير منصة immunoaffinity الورقية لفصل مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية التي هي سهلة وفعالة، ويتطلب كميات عينة منخفضة تصل إلى 10 ميكرولتر. عينات بيولوجية يمكن pipetted مباشرة على مناطق رقة الاختبار التي تم تعديلها كيميائيا مع جزيئات القبض التي لديها قابلية عالية لعلامات محددة سطح EV. ونحن تحقق من صحة الفحص باستخدام المجهر الإلكتروني (SEM)، الورقية انزيم مرتبط immunosorbenر المقايسات (P-ELISA)، وتحليل Transcriptome على. ستمكن هذه الأجهزة الورقية دراسة المركبات الكهربائية في العيادة وإعداد البحوث للمساعدة في دفع فهمنا من وظائف EV في الصحة والمرض.

Protocol

ويرد المخطط العام لإجراء عملية في الشكل 1. عن طريق الممارسات الأخلاقية، فإننا جمع عينات الدم من الأصحاء، والحصول على عينات الخلط المائي من المرضى من خلال تايتشونغ مستشفى المحاربين القدماء العام (TCVGH)، تايتشونغ، تايوان تحت افق IRB البروتوكولات ( IRB TCVGH رقم CF11213-1).

1. تصنيع أجهزة ورقة

  1. قطع ورقة اللوني الى دوائر من 5 ملم في القطر لتوفير نفس التخطيط باعتباره وحة microtiter 96-جيدا. ساندويتش هذه القطع الورقية مع ورقة من البوليستيرين مع اثنين من المسجلين من خلال الثقوب، وصفح.
  2. تعديل الأجهزة الورق باستخدام طريقة الاقتران الكيميائية موضح في الخطوات التالية 28.
    1. علاج أجهزة رقة مع البلازما الأكسجين (100 ميغاواط، 1٪ أكسجين و 30 ثانية) في غرفة البلازما.
      تنبيه: يجب أن تؤخذ بحذر خاص عند العمل مع trimethoxysilane 3-mercaptopropyl وN--γ maleimidobutyryloxy succinimideاستر (GMBS)، لأنها على حد سواء الرطوبة حساسة وسامة. ارتداء القفازات الواقية وتجنب استنشاق أو ملامسة الجلد والعينين. إبقاء زجاجة الأسهم مغلقة بإحكام والسماح لها لكي تتوازن لRT قبل فتح لتجنب تكثيف الماء. بدلا من ذلك، فتح زجاجة الأسهم داخل كيس القفازات مليئة النيتروجين أو مربع. قسامة في قوارير صغيرة لتجنب افتتاح المتكرر لزجاجة الأسهم.
    2. على الفور احتضان تعامل الأجهزة الورق في 4٪ (ت / ت) حل 3-mercaptopropyl trimethoxysilane في الإيثانول (200 دليل) لمدة 30 دقيقة.
    3. شطف أجهزة رقة مع الايثانول واحتضان لهم مع 0.01 مكرومول / GMBS مل في الإيثانول لمدة 15 دقيقة.
    4. شطف مع الإيثانول (200 دليل)، واحتضان الأجهزة الورق مع 10 ميكروغرام / مل حل أفيدين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تخزينها في 4 ° C إذا لزم الأمر، واستخدام في غضون 4 أسابيع.
  3. الرطب كل مناطق رقة الاختبار مع 10 ميكرولتر PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 3 × 10 دقيقة قبل اكتشاف 10 ميكرولتر المعقدة البيروكسيديز جزيئات القبض لمدة 3 × 10 دقيقة. استخدام مكافحة CD63 الأجسام المضادة (20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA وبنسبة 0.09٪ (ث / ت) أزيد الصوديوم) أو annexin V (1:20، / V V V في annexin العازلة ملزمة) كما جزيئات الالتقاط.
  4. شطف غير منضم الأجسام المضادة أو annexin V مكافحة CD63 الجزيئات باستخدام 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V حلول العازلة ملزمة لمدة 3 × 1 دقيقة، على التوالي.

2. المصل ومائي فكاهة جمع العينات وتجهيز

  1. جمع المصل.
    1. جمع 10 مل من الدم المحيطي من بزل الوريد في أنابيب فصل المصل وعكس بلطف أنبوب خمس مرات. تعيين أنبوب في وضع عمودي والانتظار لمدة 30 دقيقة.
    2. الطرد المركزي في 1،200 × ز لمدة 15 دقيقة. نقل المصل من الطبقة العليا إلى أنبوب نظيفة، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 3،000 × ز لمدة 30 دقيقة.
    3. تمرير طاف خلال 0.8 ميكرون سن الفيلثالثا. الحفاظ على عينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. مائي جمع النكتة: جمع عينات من الخلط المائي من المرضى الذين شخصت من قبل طبيب عيون مباشرة من خلال الإجراءات وعينات متجر الغازية في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. عزل خارج الخلية الحويصلات

  1. عينات بقعة على كل منطقة اختبار الورق بمعدل 5 ميكرولتر / دقيقة.
  2. شطف المركبات الكهربائية غير منضم مع 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V ملزمة حلول عازلة لمدة 3 × 1 دقيقة لأجهزة رقة بين functionalized مع مكافحة CD63 الأجسام المضادة أو annexin V الجزيئات، على التوالي. إجراء المقايسات المصب التالية.

4. المصب الفحص مثال 1: Electromicrographs الضوئي

  1. إصلاح المركبات الكهربائية القبض على بين functionalized منطقة اختبار الورق باستخدام 10 ميكرولتر 0.5 × تثبيتي Karnovsky لمدة 10 دقيقة.
  2. شطف العينات مع PBS واسعا ل2 × 5 دقائق.
  3. يذوىالعينات مع احق الايثانول 35٪ لمدة 10 دقيقة، والإيثانول 50٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 70٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 95٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 4 × 10 دقيقة.
  4. تنتقد الجافة وتفل معطف العينات مع البلاديوم / الذهب، ودراسة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح تعمل في انخفاض تسارع الإلكترون الجهد (~ 5 كيلو فولت).

5. المصب الفحص مثال 2: ELISA الورقية

  1. إضافة إلى حل 5 ميكرولتر تحتوي على مكافحة CD9 الأجسام المضادة الأولية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني على كل منطقة الاختبار التي تحتوي على المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. انتظر 1 دقيقة.
  2. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  3. إضافة 5 ميكرولتر محلول يحتوي الفجل البيروكسيديز (HRP) -linked الضد الثانوية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني وانتظر 1 دقيقة.
  4. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  5. إضافة 5 ميكرولتر الركيزة اللونية التي تحتوي على نسبة 1: 1 حجم الهيدروجين بيروكسيد لد 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) والمسح الضوئي باستخدام ماسحة سطح المكتب.

6. المصب الفحص مثال 3: عزل الحمض النووي الريبي

  1. تزج العينات في 35 ميكرولتر من المساعدات العزلة RNA القائم على بوفيدون و 265 ميكرولتر من تحلل / العازلة ملزمة لليز المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. دوامة بقوة.
  2. إضافة 30 ميكرولتر جناسة المنصوص عليها في عدة العزلة إلى المحللة. دوامة بقوة وضعت على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام حمض فصل الفينول كلوروفورم موضح في الخطوات التالية.
    1. تأخذ 330 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم من الطبقة السفلى من القمقم وإضافة إلى جناسة / المحللة. دوامة بقوة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل (العليا) المرحلة المائية لأنبوب نظيفة ونلاحظ حجم إزالتها.
  4. ترسيب الحمض النووي الريبي مجموع مع الإيثانول بنسبة 100٪ من حجم هذا هو 1.25 أضعاف حجم المرحلة المائية إزالتها في الخطوة السابقة والتعاونllect الحمض النووي الريبي في حل شطف مسخن إلى 95 ° C.
  5. التركيز ومواصلة تنقية RNA باستخدام طقم تنظيف RNA فقا لبروتوكول تصنيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قدرة الجهاز رقة لعزل مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية تعتمد بكفاءة عند التحقق حساس ونوعي لها من علامات سطح EV. ويتحقق تعديل مستقر للألياف ورقية مع جزيئات التقاط باستخدام أفيدين-البيوتين الكيمياء كما هو موضح في أماكن أخرى 28-30. ويتم تقييم فعالية تصريف المواد الكيميائية وذلك من طريقة physisorption باستخدام قراءات القائم على مضان. يتم إعداد مناطق اختبار الورقة التالية الخطوة بروتوكول 1) باستثناء جزيء التقاط يتم استبدال مع جزيئات البيوتين 20 ميكروغرام / مل fluorophore R-فيكوإيريترين مترافق (PE-البيوتين) في الخطوة 1.3. ثم يتم شطفها المناطق رقة الاختبار مع PBS لإزالة جزيئات PE البيوتين غير منضم. في المقابل، 10 ميكرولتر 20 ميكروغرام / مل PE-البيوتين في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA وبنسبة 0.09٪ (ث / ت) ورصدت أزيد الصوديوم مباشرة على منطقة الاختبار ورقة لمدة 3 × 10 دقيقة، تليها PBS شطف لإجراء physisorption من-PE البيوتين جزيئات الصبغة. كيميائياأجهزة رقة معدلة ("ورقة + crosslinker + صبغ") جنبا إلى جنب مع الأجهزة رقة غير المجهزة ("ورقة")، وأجهزة رقة معدلة مع نفس البروتوكول دون تطبيق الجزيئات-PE البيوتين ("ورقة + crosslinker") والأجهزة الورق مع physisorbed يتم حفظ جزيئات البيوتين PE-("physisorbed صبغ") يتم فحص باستخدام نظام صورة الرقم القياسي ل540-560 نانومتر الإثارة، 575 الانبعاث نانومتر طويلة تمرير، والبيانات في شكل ملفات 16-بت وتحليلها باستخدام برنامج يماغيج. كما هو مبين في الشكل 2A، وكثافة مضان من مناطق اختبار بواسطة طريقة الاقتران الكيميائية أعدت أعلى بكثير بالمقارنة مع مناطق اختبار ورقة المغلفة جسديا (ع القيمة <0.0005، ن = 5، اختبار t الطالب). واسر من المركبات الكهربائية هو أيضا محددة كما يتضح في الشكل 2B، C، حيث يتم الاحتفاظ القليلة المركبات الكهربائية على الجهاز ورقة عندما يتم استبدال جزيئات أسر حل PBS.

المركبات الكهربائية غير متجانسة في سيZES، محتويات محددة، وطرق نشوء حيوي. لربط لهم، وأجهزة رقة المغلفة مع اثنين من جزيئات مختلفة التقاط EV، والأجسام المضادة لمكافحة CD63 وannexin V، تم إعداد. وأثرى CD63، وهو عضو في الأسرة tetraspanin (والذي يتضمن CD9، CD63، CD81 CD82 والجزيئات) على EV غشاء 31، وannexin V لديه تقارب قوي لفسفاتيديل (PS) 32،33. تبين أن يتم إطلاق المركبات الكهربائية جوهري خلال موت الخلايا المبرمج في وقت مبكر أو في ظل ظروف الإجهاد، والتي تفقد فيها عملية العادي خلية التماثل فوسفورية، مما يؤدي إلى زيادة التعرض للPS على النشرة الخارجية للغشاء EV. تحليلات من الصور SEM تبين أن حجم التوزيعات من CD63 + المركبات الكهربائية وPS + المركبات الكهربائية مختلفة، بأقطار يعني من 80 و 43 نانومتر، على التوالي (الشكل 3) يستخدم. وثنائي الطرف اختبار t الطالب لتحديد الإحصائية ف القيمة (ص القيمة <0.0001). والمثير للدهشة، تظهر CD63 + المركبات الكهربائية مستدير وأكبر من PS + المركبات الكهربائية في المتوسط، والذي البيولوجية تبقى أهمية إلى توضيح.

RNA من المركبات الكهربائية القبض على الجهاز ورقة يمكن استخراج. وأظهرت التحليلات مع bioanalyzer ملامح الشاملة مماثلة لمجموع الرنا المستخرجة من CD63 + وPS + المركبات الكهربائية (الشكل 4A). مقارنة مع كميات من الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام تقنيات ميكروفلويديك وتنبيذ فائق، على التوالي حوالي مرتين وتم استخراج 39 مرات أكثر الرنا لكل وحدة حجم من عينة مصل الدم باستخدام جهاز الورق، وإن كان ذلك باستخدام حجم العينة أصغر (الجدول 1). P-ELISA يمكن القيام بها للكشف عن السيارات الكهربائية. وتستخدم مضادة للCD9 الأجسام المضادة الأولية والثانوية الضد HRP-مترافق في هذه الدراسة. الشكل 4B يعرض التغيرات في القيمة الرمادية التي تنتجها رد فعل الأنزيمية من HRP للأجهزة رقة تطبيقها مع 10 ميكرولتر PBS، 50٪ مصل (مخفف مع PBS)، أو 100 مصل٪، على التوالي. قيمة الرمادية يزيد خطيا ضمن مجموعة من عينات المصل اختبارها.

> أجهزة ورقة هي مفيدة خصوصا عندما كمية عينة محدودة مثل في حالة من الخلط المائي، وعندما فقط <200 ميكرولتر / العين يمكن جمعها. وغالبا ما يحتاج عينات متعددة وتجمع معا إذا طرق عزل أخرى، على سبيل المثال، تنبيذ فائق، والمراد استخدامها. المركبات الكهربائية من المرضى عينات الخلط المائي معزولة مع أجهزة رقة المغلفة مع أضداد CD63 يمكن أن يرى في الصور SEM أظهرت كما في الشكل (5).

الشكل (1)
يتم قطع الشكل 1. الإجراء تصنيع وتشغيل المقايسات الورقية التي تهدف إلى عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية. (A) تصفية الورق في الشكل المطلوب ومغلفة. يتم تعديل (B) على سطح الورق مع العلاج وجيزة من البلازما الأكسجين وكان رد فعل مع trimethoxysilane 3-mercaptopropyl، N </ م> -γ-maleimidobutyryloxy succinimide استر، وNeutrAvidin، في هذا النظام. الجزيئات المعقدة البيروكسيديز القبض، على سبيل المثال، والأجسام المضادة، ويمكن بعد ذلك ثبتوا عبر تقارب قوي بين البيوتين والجزيئات NeutrAvidin. (C) Biosamples يمكن أن تكون ماصة على الجهاز ورقة بين functionalized. الحويصلات خارج الخلية يمكن أن تكون معزولة. (D) المقايسات المصب، مثل SEM، Transcriptome على، وELISA (كما هو موضح)، لا يمكن أن يؤديها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) يمكن التقاطها على أجهزة رقة بين functionalized مع خصوصية وحساسية جيدة. ويجمد للغاية (A) جزيئات البيوتين Fluorescently المسمى على ورقةالجهاز عن طريق عملية الاقتران الكيميائية ("ورقة + crosslinker + صبغ") وعلى النقيض من الامتزاز الفيزيائي ("physisorbed صبغ"). ورقة غير المجهزة ("ورقة") والجزيئات الاقتران ("ورقة + crosslinker") تساهم قليلا لشدة مضان. (ب) SEM صورة تمثيلية تظهر بعض المركبات الكهربائية يتم التقاطها على الجهاز ورقة غير تحديدا عندما يتم استبدال جزيئات أسر PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA. يتم الاحتفاظ (C) العديد من المركبات الكهربائية على الأجهزة رقة المغلفة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD63. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3-mercaptopropyl
الشكل 3. المجموعات الفرعية من الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) يمكن أن يكون حجم التوزيعات المختلفة. (A)و (ب) هي صور SEM تمثيلية من المركبات الكهربائية استولت على أجهزة رقة المغلفة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD63 والجزيئات annexin V، على التوالي. (C) CD63 + المركبات الكهربائية تبدو أكبر من PS + المركبات الكهربائية تحت الظروف التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة (ع القيمة <0.0001، ن = 124 و 203، اختبار t الطالب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. Transcriptome على التكرير والتسويق وELISA المقايسات. (A) البيانات Bioanalyzer تبين شدة (المحور الصادي، في وحدات التعسفي) وحجم (محور س، في النيوكليوتيدات (NT)) توزيعات fluorescently المسمى الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من المركبات الكهربائية استولت على مكافحة CD63 المغلفة V-الأضداد أو annexin أوراق الترشيح. ذروة المهاجرة في ~ 25 يمثل الإقليم الشمالي معيار داخلي. (ب) التغيرات في القيمة رمادي ينتج عن تفاعل الأنزيمي من الفجل البيروكسيديز (HRP) في مقايسة P-ELISA لأجهزة رقة تطبيقها مع 10 عينات ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، 50٪ مصل (مخفف مع PBS) و 100 عينات٪ مصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) في عينات الخلط المائي يمكن التقاطها على ورق الترشيح بين functionalized دون تجميع العينة. الصور SEM من CD63 + معزولة المركبات الكهربائية في عينات الخلط المائي من المرضى الذين يعانون من (A) المرتبطة بالعمر الضمور البقعي، (B) البقعي السكري وذمة، و (C) اعتلال وعائي المشيمية polypoidal، على التوالي.تحميل / 52722 / 52722fig5highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

طريقة العزلة القبض على جزيء المجلد المصل. (ميكرولتر) متوسط ​​الحمض النووي الريبي المستخرج (نانوغرام) متوسط ​​استخراج الحمض النووي الريبي / مصل
(جزء من الغرام / ميكرولتر) 		نسبة متوسط ​​RNA / مصل المرجع
جهاز ميكروفلويديك CD63 مكافحة الإنسان 400 4.14 10.4 20 20
جهاز الورق CD63 مكافحة الإنسان 72 1.49 ± 0.08 20.7 39 22
جهاز الورق annexin V 72 0.99 ± 0.26 13.8 26 22
تنبيذ فائق - 2،000 1.06 ± 0.64 0.53 1
مصل الدم - 72 1.23 ± 0.58 17 32 22

الجدول 1. مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات الدم من المتطوعين الأصحاء تحليلها مع bioanalyzer (ن = 4 لجميع الظروف).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية لعزل الناجحة لمجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية هي: 1) اختيار جيد من الورق. 2) تغطية مستقرة وعالية من جزيئات القبض على السطح من ألياف ورقية. 3) التعامل الصحيح مع العينات. و4) ممارسة النظافة المختبر العام.

وقد تم استخدام مواد مسامية في العديد من المقايسات غير مكلفة وخالية من المعدات. قد يكون لديهم الانضباطي حجم المسام، وظائف متعددة، وانخفاض التكلفة، وارتفاع نسبة السطح إلى الحجم السماح فتل السلبي من السوائل. اخترنا اللوني السليلوز ورقة الصف 1 أساسا لفي حجم المسام السليم وانخفاض امتصاص البروتين. مقارنة مع المواد الأخرى المستخدمة عادة مسامية، النيتروسليلوز، ورق السيلولوز ديها أقل بكثير انوعي امتصاص البروتين 34. نجد أيضا القليل التقاط غير محدد من المركبات الكهربائية في هذه الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك، مستوى له الاحتفاظ الجسيمات، 11 ميكرون، أكبر من حجم المركبات الكهربائية 35، والسماح لالتقاط محددة فيعلى النقيض من لمحاصرة المادي للالمركبات الكهربائية. هنا، ونحن نركز على المركبات الكهربائية ذات حجم أصغر عن طريق تمرير عينات مصل الدم من خلال 0.8 ميكرون فلتر، الخطوة التي يجوز تعديلها عندما تكون المركبات الكهربائية أكبر لدراستها.

تعديل السطح الكيميائي يمكن أن يكون المفتاح لتحقيق تغطية مستقرة وعالية من جزيئات القبض على السطح كوسيلة لتحسين كفاءة EV العزلة. وقد تم استعراض التعديلات سطح السليلوز 36،37. وهناك أعداد كبيرة من الهيدروكسيل (-OH) مجموعات على سطح السليلوز وأنها يمكن أن تتفاعل مع سيلاني لإعطاء السندات سي OC الكيميائية مستقرة بعد أن تفعيلها مع البلازما الأكسجين أو عملية التكثيف الأخرى. وسيلاني المستخدمة في هذه الدراسة هو (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane، (ميو) 3 Si- (CH 2) 3 -SH. يمكن لل(-SH) مجموعة ثيول تتفاعل مع GMBS لتوفير الذراع القصير الفضاء (0.73 نانومتر) ومجموعة يشابك أن الأزواج مع الأمينات الأولية. التقاط الجزيئات مع مجموعات أمين يمكن مترافقلGMBS مباشرة. في هذه الدراسة، ومع ذلك، فإننا مترافق NeutrAvidin بدلا من ذلك إلى تقديم المخطط العام لتصريف مختلف الجزيئات التي هي القبض على المسمى البيوتين. ومع ذلك، لم يتم بعد التوصل إلى توافق في الآراء بشأن علامات سلالة محددة EV 17. NeutrAvidin لها قابلية قوية جدا لالبيوتين ونقطة كهرساوي شبه محايد (الرقم الهيدروجيني 6.3)، والتقليل من التفاعلات غير محددة مع الأجسام المشحونة سلبا، على سبيل المثال سطح المركبات الكهربائية. في المقابل، أفيدين مع نقطة تساوي الكهربية من 10.5 يحمل شحنات موجبة في درجة الحموضة محايدة. يتم استخدام تركيز أعلى من مكافحة CD63 الضد من ذلك في تشن وآخرون. 20، ويرجع ذلك أساسا إلى حجم صغير التطبيقية ونسبة أكبر من جهاز الورق أرض-الحجم. ومع ذلك، لم تتميز كمية وتركيبة البروتينات كثف على ألياف ورقية، والتي قد تكون العينة التي تعتمد على. وبالتالي، يجب توخي الحذر عند تفسير نتائج تحليل البروتين.

ثنائية تم جمعهاوينبغي التعامل مع عينات استثارة بلطف ومعالجتها بسرعة لمنع زيادة artifactually مستويات EV. فمن المستحسن لإزالة الخلايا والصفائح الدموية، إن وجدت، قبل التخزين في -80 ° C. وتوحيد الحالي لمعالجة العينة في البحوث EV يمكن العثور عليها في هذا الاستعراض 17.

ينبغي استخدام الممارسات السليمة النظافة المختبر. دائما ارتداء قفازات وقفازات تغيير في كثير من الأحيان للحد من إدخال جزيئات الغبار وribonucleases. عزل الحمض النووي الريبي من المركبات الكهربائية في وسائل الإعلام مكيفة زراعة الخلايا يمكن أن تسفر عن تركيزات أكثر من 70 أضعاف باستخدام أجهزة رقة بالمقارنة مع تلك المستخرجة من تتركز المركبات الكهربائية باستخدام طريقة نابذة فائقة السرعة (غير منشورة).

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الأجهزة رقة السليلوز معدلة كيميائيا مع جزيئات القبض على عزل مجموعات فرعية مختلفة من المركبات الكهربائية. طريقة بسيطة وفعالة وذات قيمة خاصة عندما يكون حجم عينة محدودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من المجلس الوطني للعلوم تايوان grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) وNSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC)، والمحاربين القدامى عامة المستشفيات ونظام جامعة تايوان برنامج البحوث المشتركة (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 98، الحويصلات خارج الخلية، exosomes، ورق السيلولوز، على microfluidics، ورقة ELISA، الخلط المائي، اقتران الكيميائية
أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y.,… More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter