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Bioengineering

कोशिकी vesicles के अलगाव और विशेषता के लिए कागज आधारित उपकरणों

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

इस प्रोटोकॉल के रूप में छोटा रूप में 10 μl सीरम नमूनों से, बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस), कोशिकाओं से जारी छोटे झिल्लीदार कणों को अलग करने के लिए एक विधि का विवरण। यह दृष्टिकोण, ultracentrifugation के लिए की जरूरत में गतिरोध उत्पन्न परख समय के कुछ ही मिनट की आवश्यकता है, और सीमित संस्करणों के नमूनों से ईवीएस के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है।

Abstract

कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस), विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से जारी झिल्लीदार कणों, नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए एक महान क्षमता पकड़। वे न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन कार्गो होते हैं और तेजी से यूकेरियोट और अकेन्द्रिक कोशिकाओं दोनों द्वारा उपयोग कहनेवाला संचार के साधन के रूप में पहचाने जाते हैं। हालांकि, उनके छोटे आकार के, ईवीएस के अलगाव के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल अक्सर समय लेने वाली है, बोझिल कर रहे हैं, और इस तरह के एक ultracentrifuge के रूप में बड़ा नमूना मात्रा और महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम, आसान कुशल है, और 10 μl के रूप में के रूप में कम नमूना संस्करणों की आवश्यकता है कि ईवीएस के उपसमूहों को अलग करने के लिए एक कागज आधारित immunoaffinity प्लेटफार्म विकसित की है। जैविक नमूने रासायनिक विशिष्ट ईवी सतह मार्करों के लिए उच्च आत्मीयता है कि कब्जा अणुओं के साथ संशोधित किया गया है कि कागज परीक्षण जोनों पर सीधे pipetted किया जा सकता है। हम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करके परख को मान्य, कागज आधारित एंजाइम से जुड़ी immunosorbenटी assays के (पी-एलिसा), और transcriptome विश्लेषण। ये कागज आधारित उपकरणों के लिए स्वास्थ्य और रोग में ईवी कार्यों के बारे में हमारी समझ के अग्रिम में मदद करने के क्लिनिक और अनुसंधान सेटिंग में ईवीएस के अध्ययन के लिए सक्षम हो जाएगा।

Protocol

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संचालन प्रक्रिया का एक सामान्य आरेख चित्र 1 में प्रदान की जाती है। नैतिक प्रथाओं का उपयोग कर, हम (स्वस्थ विषयों से रक्त के नमूने एकत्र, और आईआरबी प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी ताइवान के तहत ताइचुंग दिग्गजों जनरल हॉस्पिटल (TCVGH), ताइचुंग, के माध्यम से रोगियों से जलीय हास्य के नमूने प्राप्त आईआरबी TCVGH नं CF11213-1)।

कागज उपकरणों के 1. निर्माण

  1. एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट के रूप में एक ही लेआउट प्रदान करने के लिए व्यास में 5 मिमी के हलकों में क्रोमैटोग्राफी कागज काटें। पंजीकृत के माध्यम से छेद, और टुकड़े टुकड़े के साथ दो polystyrene शीट के साथ इन कागज के टुकड़े सैंडविच।
  2. निम्नलिखित 28 चरणों में वर्णित रासायनिक विकार विधि का उपयोग कागज उपकरणों को संशोधित करें।
    1. एक प्लाज्मा चैम्बर में ऑक्सीजन प्लाज्मा (100 मेगावाट, 1% ऑक्सीजन, 30 सेकंड) के साथ कागज उपकरणों समझो।
      चेतावनी: 3-mercaptopropyl trimethoxysilane और एन -γ-maleimidobutyryloxy succinimide साथ काम करते समय विशेष सावधानी लिया जाना चाहिएएस्टर (GMBS), वे दोनों नमी संवेदनशील और विषाक्त कर रहे हैं के बाद से। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें और साँस लेना बचने के लिए या त्वचा और आंखों के साथ संपर्क करें। कसकर बंद शेयर की बोतल रखें और यह पानी संक्षेपण से बचने के लिए खोलने से पहले आरटी को संतुलित करने की अनुमति देते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक नाइट्रोजन से भरे दस्ताने बैग या बॉक्स के अंदर शेयर बोतल खुली। छोटी शीशियों में विभाज्य शेयर बोतल के लगातार खोलने से बचने के लिए।
    2. इसके तत्काल बाद 30 मिनट के लिए इथेनॉल (200 सबूत) में 3-mercaptopropyl trimethoxysilane के 4% (वी / वी) के घोल में कागज उपकरणों का इलाज किया सेते हैं।
    3. इथेनॉल के साथ कागज उपकरणों कुल्ला और 15 मिनट के लिए इथेनॉल में 0.01 μmol / एमएल GMBS के साथ उन्हें सेते हैं।
    4. इथेनॉल (200 प्रमाण) के साथ कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / avidin समाधान के साथ कागज उपकरणों सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अगर जरूरत है, और चार सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
  3. (बीएसए 10 μl पीबीएस गोजातीय सीरम albumin (w / v) 1% से युक्त के साथ प्रत्येक पेपर की परीक्षा क्षेत्रों गीले) 3 × 10 मिनट के लिए कब्जा अणुओं biotinylated 10 μl खोलना पहले 3 × 10 मिनट के लिए। के रूप में या Annexin वी (01:20, Annexin वी बाध्यकारी बफर में वी / वी) विरोधी CD63 एंटीबॉडी का उपयोग करें (पीबीएस डब्ल्यू / वी) बीएसए और 0.09% (/ वी) सोडियम azide डब्ल्यू (1% से युक्त में 20 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) कब्जा अणुओं।
  4. पीबीएस क्रमश: 3 × 1 मिनट के लिए बफर समाधान बाध्यकारी बीएसए या Annexin वी (w / v) 1% से युक्त इसी 10 μl का उपयोग करते हुए अपार विरोधी CD63 एंटीबॉडी या Annexin वी अणुओं बंद कुल्ला।

2. सीरम और जलीय हास्य नमूना संग्रह और प्रसंस्करण

  1. सीरम संग्रह।
    1. सीरम जुदाई ट्यूबों में venipuncture द्वारा परिधीय रक्त के 10 मिलीलीटर लीजिए और धीरे ट्यूब पांच बार पलटना। एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में ट्यूब सेट और 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. 15 मिनट के लिए 1200 × छ पर अपकेंद्रित्र। 30 मिनट के लिए 3000 × छ पर फिर एक साफ ट्यूब करने के लिए शीर्ष स्तर से सीरम, और अपकेंद्रित्र स्थानांतरण।
    3. एक 0.8 माइक्रोन fil के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला दर्राआतंकवाद। उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखें।
  2. जलीय हास्य संग्रह: उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सीधे प्रक्रियाओं और दुकान के नमूने इनवेसिव के माध्यम से एक नेत्र रोग विशेषज्ञ द्वारा निदान रोगियों से जलीय हास्य नमूने एकत्र।

कोशिकी vesicles 3. अलगाव

  1. 5 μl / मिनट की दर से प्रत्येक पेपर परीक्षण क्षेत्र पर स्पॉट नमूने हैं।
  2. बीएसए या Annexin वी क्रमशः, विरोधी CD63 एंटीबॉडी या Annexin वी अणुओं के साथ क्रियाशील कागज उपकरणों के लिए 3 × 1 मिनट के लिए बफर समाधान बाध्यकारी (w / v) पीबीएस 1% से युक्त इसी 10 μl के साथ अपार ईवीएस बंद कुल्ला। निम्नलिखित बहाव के assays के प्रदर्शन।

4. डाउनस्ट्रीम परख उदाहरण 1: स्कैन Electromicrographs

  1. 10 मिनट के लिए 10 μl 0.5 × Karnovsky लगानेवाला का उपयोग कर functionalized कागज परीक्षण क्षेत्र पर कब्जा कर लिया ईवीएस को ठीक करें।
  2. 2 × 5 मिनट के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ नमूने कुल्ला।
  3. किसी पदार्थ में से जल निकाल देना10 मिनट, 2 × 10 मिनट के लिए 50% इथेनॉल, 2 × 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 2 × 10 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, और 4 × 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के लिए बाद में 35% इथेनॉल के साथ नमूने हैं।
  4. शुष्क क्रिटिकल और कोट पैलेडियम / स्वर्ण के साथ नमूने धूम, और कम इलेक्ट्रॉन त्वरण वोल्टेज में संचालित एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग जांच (~ 5 केवी)।

5. डाउनस्ट्रीम परख उदाहरण 2: कागज आधारित एलिसा

  1. 1 में विरोधी CD9 प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त 5 μl समाधान जोड़ें: 1,000 कमजोर पड़ने पीबीएस में कब्जा ईवीएस युक्त प्रत्येक परीक्षा जोन के लिए। 1 मिनट रुकिये।
  2. पीबीएस 30 सेकंड के लिए 100 rpm पर हिल मिलीलीटर 30 के साथ नमूने कुल्ला।
  3. एक 5 μl समाधान युक्त हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) 1 पर माध्यमिक एंटीबॉडी -linked जोड़ें: पीबीएस में 1,000 कमजोर पड़ने और एक मिनट इंतज़ार करो।
  4. पीबीएस 30 सेकंड के लिए 100 rpm पर हिल मिलीलीटर 30 के साथ नमूने कुल्ला।
  5. हाइड्रोजन पेरोक्साइड एक की एक मात्रा अनुपात: 1 से युक्त एक 5 μl वर्णमिति सब्सट्रेट जोड़ेंडी 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) और एक डेस्कटॉप स्कैनर का उपयोग कर स्कैन।

6. डाउनस्ट्रीम परख उदाहरण 3: शाही सेना अलगाव

  1. पर कब्जा कर लिया ईवीएस lyse करने के लिए बाध्यकारी बफर / Polyvinylpyrrolidone आधारित शाही सेना अलगाव सहायता के 35 μl और सेल के 265 μl में नमूने विसर्जित कर दिया। भंवर सख्ती।
  2. Lysate के लिए अलगाव किट में दिए गए 30 μl homogenate जोड़ें। भंवर सख्ती और 10 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया।
  3. निम्न चरणों में वर्णित एसिड फिनोल-क्लोरोफॉर्म जुदाई का उपयोग करते हुए शाही सेना निकालें।
    1. बोतल के नीचे की परत से फिनोल-क्लोरोफॉर्म के 330 μl ले लो और homogenate / lysate में जोड़ें। भंवर सख्ती।
    2. 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक साफ ट्यूब जलीय (ऊपरी) चरण हस्तांतरण और हटाया मात्रा ध्यान दें।
  4. पिछले चरण और सह में हटा जलीय चरण के 1.25 गुना मात्रा है कि मात्रा के लिए 100% इथेनॉल के साथ कुल शाही सेना वेग95 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते हैं क्षालन समाधान में शाही सेना llect।
  5. ध्यान लगाओ और आगे निर्माण प्रोटोकॉल के अनुसार एक शाही सेना सफाई किट का उपयोग कर शाही सेना शुद्ध।

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Representative Results

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ईवीएस की उपसमूहों अलग करने के लिए कागज डिवाइस की क्षमता कुशलतापूर्वक ईवी सतह मार्करों के अपने संवेदनशील और विशिष्ट मान्यता पर निर्भर करता है। कब्जा अणुओं के साथ कागज फाइबर के स्थिर संशोधन कहीं और 28-30 के रूप में वर्णित avidin बायोटिन रसायन विज्ञान का उपयोग करके हासिल की है। physisorption विधि का रासायनिक विकार की प्रभावशीलता और कहा कि प्रतिदीप्ति आधारित readouts का उपयोग कर मूल्यांकन किया है। कागज परीक्षण क्षेत्रों 1.3 चरण में 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / फ्लोरोफोरे आर-phycoerythrin संयुग्मित बायोटिन अणुओं (पीई बायोटिन) के साथ बदल जाता है पर कब्जा अणु को छोड़कर प्रोटोकॉल चरण 1) निम्न तैयार कर रहे हैं। कागज परीक्षण जोनों तो अपार पीई बायोटिन अणुओं को निकालने के लिए पीबीएस के साथ rinsed हैं। इसके विपरीत, पीबीएस 1% से युक्त में 10 μl 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पीई बायोटिन (डब्ल्यू / वी) बीएसए और 0.09% (डब्ल्यू / वी) सोडियम azide सीधे पीबीएस के द्वारा पीछा किया, 3 × 10 मिनट के लिए कागज परीक्षण क्षेत्र पर देखा जाता है पीई बायोटिन डाई अणु की physisorption आयोजित करने के लिए कुल्ला। रासायनिकसंशोधित कागज उपकरणों ("कागज + crosslinker + डाई") असंसाधित कागज उपकरणों के साथ ("कागज"), पीई बायोटिन अणु ("कागज + crosslinker") और physisorbed के साथ कागज उपकरणों के आवेदन के बिना ही प्रोटोकॉल के साथ संशोधित कागज उपकरणों पीई बायोटिन अणुओं ("physisorbed डाई") 540-560 एनएम उत्तेजना के लिए सेट एक छवि रिकॉर्ड प्रणाली का उपयोग करते हुए स्कैन कर रहे हैं, 575 एनएम के लंबे-पास उत्सर्जन, और डेटा 16-बिट फ़ाइलों के रूप में बचाया और विश्लेषण किया जाता है ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। 2A चित्रा में दिखाया गया है शारीरिक रूप से लेपित कागज परीक्षण क्षेत्रों की तुलना में, रासायनिक विकार विधि द्वारा तैयार परीक्षण क्षेत्र के प्रतिदीप्ति तीव्रता (पी मूल्य <0.0005 एन, = 5, छात्र की टी परीक्षण), काफी अधिक है। कब्जा अणुओं पीबीएस समाधान द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं जब कुछ ईवीएस कागज डिवाइस पर रखा जाता है, जहां चित्रा 2B, सी, में उदाहरण के रूप में ईवीएस का कब्जा भी विशिष्ट है।

ईवीएस एसआई में विषम हैंzes, विशिष्ट सामग्री, और जीवजनन मार्गों। उन्हें बाध्य करने के लिए, दो अलग अलग ईवी कब्जा अणुओं, विरोधी CD63 एंटीबॉडी और Annexin वी के साथ लेपित कागज उपकरणों, तैयार थे। CD63, tetraspanin परिवार के एक सदस्य (CD9, CD63, CD81 और CD82 अणुओं भी शामिल है) ईवी झिल्ली 31 पर समृद्ध है, और Annexin वी phosphatidylserine (पीएस) 32,33 के लिए एक मजबूत संबंध है। यह ईवीएस की प्रक्रिया में जो सामान्य कोशिका फॉस्फोलिपिड विषमता ईवी झिल्ली की बाहरी पत्रक पर पीएस की वृद्धि की जोखिम के लिए अग्रणी, खो दिया है, जल्दी apoptosis के दौरान या तनाव की शर्तों के तहत अनिवार्यता से जारी कर रहे हैं कि पाया जाता है। SEM छवियों का विश्लेषण व्याप्ति में दो पूंछ छात्र के टी-परीक्षण सांख्यिकीय पी मूल्य निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है CD63 + ईवीएस और पी एस + ईवीएस के आकार वितरण मतलब 80 के व्यास और क्रमशः 43 एनएम, के साथ, अलग कर रहे हैं (चित्रा 3) दिखाने (पी मूल्य <.0001)। हैरानी की बात है, CD63 + ईवीएस राउंडर दिखाई देते हैं और, जैविक, जो औसत पर + ईवीएस पुनश्च से भी बड़ामहत्व समझाया जाना बना रहता है।

कागज डिवाइस पर कब्जा कर लिया ईवीएस से शाही सेना निकाला जा सकता है। एक Bioanalyzer के साथ विश्लेषण CD63 + और ​​पी एस + ईवीएस (चित्रा -4 ए) से निकाले कुल RNAs के लिए इसी तरह की समग्र प्रोफाइल को दिखाया। क्रमशः के बारे में दो बार और सीरम के नमूने की मात्रा प्रति इकाई 39 गुना अधिक RNAs के एक छोटे नमूने की मात्रा (1 टेबल) का उपयोग हालांकि, कागज डिवाइस का उपयोग निकाला गया microfluidic और ultracentrifugation तकनीक का उपयोग कर निकाले शाही सेना की मात्रा, की तुलना में। पी-एलिसा ईवीएस का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। एंटी CD9 प्राथमिक एंटीबॉडी और एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी 4B चित्रा (पीबीएस के साथ पतला) 10 μl पीबीएस, 50% सीरम के साथ लागू कागज उपकरणों के लिए एचआरपी के enzymatic प्रतिक्रिया द्वारा उत्पादित ग्रे मूल्य में परिवर्तन को प्रदर्शित करता है। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया है, या 100 रहे हैं क्रमशः% सीरम,। ग्रे मूल्य का परीक्षण सीरम नमूनों की सीमा के भीतर रैखिक बढ़ जाती है।

जैसे, ultracentrifugation, इस्तेमाल हो रहे हैं अगर एक साथ जमा कर रहे हैं। SEM छवियों में देखा जा सकता विरोधी CD63 एंटीबॉडी के साथ लेपित कागज उपकरणों के साथ पृथक रोगी जलीय हास्य नमूनों से ईवीएस चित्रा 5 में दिखाया के रूप में।

चित्र 1
चित्रा 1. अलगाव और बाह्य vesicles के लक्षण वर्णन करने के उद्देश्य से कागज आधारित assays के निर्माण और संचालन प्रक्रिया। (ए) फिल्टर पेपर वांछित आकार में काट लें और टुकड़े टुकड़े में है। (बी) कागज की सतह ऑक्सीजन प्लाज्मा का एक संक्षिप्त उपचार के साथ संशोधित और 3-mercaptopropyl trimethoxysilane, एन <साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है/ उन्हें> -γ-maleimidobutyryloxy succinimide एस्टर, और NeutrAvidin, इसी क्रम में। Biotinylated कब्जा अणु, जैसे, एंटीबॉडी, तो बायोटिन और NeutrAvidin अणुओं के बीच मजबूत संबंध के माध्यम से स्थिर किया जा सकता है। (सी) Biosamples functionalized कागज डिवाइस पर पिपेट हो सकता है। कोशिकी पुटिकाओं अलग किया जा सकता है। (डी) ऐसे में SEM, transcriptome, और एलिसा (दिखाया गया है) के रूप में डाउनस्ट्रीम assays, प्रदर्शन किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) अच्छा विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ क्रियाशील कागज उपकरणों पर कब्जा कर लिया जा सकता है। (ए) Fluorescently लेबल बायोटिन अणुओं अत्यधिक कागज पर स्थिर रहे हैंरासायनिक विकार प्रक्रिया शारीरिक सोखना के विपरीत ("कागज + crosslinker + डाई") ("physisorbed डाई") के माध्यम से डिवाइस। Unprocessed पेपर ("कागज") और संयुग्मन अणु ("कागज + crosslinker") प्रतिदीप्ति तीव्रता को थोड़ा योगदान करते हैं। कब्जा अणुओं पीबीएस बीएसए (w / v) 1% से युक्त द्वारा बदल दिया है जब (बी) के कुछ ईवीएस दिखा एक प्रतिनिधि SEM छवि गैर-विशेष रूप से कागज डिवाइस पर कब्जा कर रहे हैं। (सी) कई ईवीएस विरोधी CD63 एंटीबॉडी के साथ लेपित कागज उपकरणों पर रखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3-mercaptopropyl
कोशिकी vesicles के चित्रा 3. Subgroups (ईवीएस) विभिन्न आकार वितरण हो सकता है। (ए)और (बी) क्रमशः विरोधी CD63 एंटीबॉडी और Annexin वी अणुओं के साथ लेपित कागज उपकरणों पर कब्जा कर लिया ईवीएस के प्रतिनिधि SEM छवियों हैं। (सी) CD63 + ईवीएस इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रयोगात्मक शर्तों के तहत पुनश्च + ईवीएस से बड़ा दिखाई देते हैं (पी मूल्य <.0001, एन 124 और 203, छात्र की टी परीक्षण =)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. डाउनस्ट्रीम transcriptome और एलिसा assays के। (ए) ईवीएस से निकाले fluorescently लेबल कुल शाही सेना के वितरण पर कब्जा कर लिया (NT) न्यूक्लियोटाइड (एक्स अक्ष) तीव्रता (मनमाना इकाइयों में वाई अक्ष,) और आकार दिखा Bioanalyzer डेटा विरोधी CD63 पर antibody- या Annexin फिल्टर कागजात वी-लेपित। ~ 25 में पलायन शिखर NT का प्रतिनिधित्व करता है एक आंतरिक मानक। (बी) 10 पीबीएस के μl नमूने, (पीबीएस के साथ पतला) 50% सीरम और 100% सीरम नमूनों के साथ लागू कागज उपकरणों के लिए पी-एलिसा परख में हॉर्सरैडिश peroxidase के enzymatic प्रतिक्रिया (एचआरपी) द्वारा उत्पादित ग्रे मूल्य परिवर्तन। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 5
जलीय हास्य नमूनों में चित्रा 5. कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) नमूना पूलिंग बिना functionalized फिल्टर पेपर पर कब्जा कर लिया जा सकता है। जलीय हास्य नमूनों में SEM पृथक CD63 की छवियों + ईवीएस रोगियों से (ए) उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन, (बी) मधुमेह धब्बेदार साथ शोफ, और क्रमश: (सी) polypoidal choroidal Vasculopathy,।लोड / 52,722 / 52722fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अलगाव विधि कब्जा अणु सीरम वॉल्यूम। (Μl) निकाले औसत आरएनए (एनजी) औसत निकाले आरएनए / सीरम
(पीजी / μl)
औसत आरएनए / सीरम के अनुपात रेफरी
microfluidic युक्ति मानव विरोधी CD63 400 4.14 10.4 20 20
कागज डिवाइस मानव विरोधी CD63 72 1.49 ± 0.08 20.7 39 22
कागज डिवाइस Annexin वी 72 0.99 ± 0.26 13.8 26 22
ultracentrifugation - 2000 1.06 ± 0.64 0.53 1
सीरम - 72 1.23 ± 0.58 17 32 22

स्वस्थ स्वयंसेवकों से सीरम नमूनों से निकाली तालिका 1. कुल शाही सेना के एक Bioanalyzer (सभी स्थितियों के लिए एन = 4) के साथ विश्लेषण किया।

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Discussion

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कोशिकी vesicles के उपसमूहों के सफल अलगाव के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: कागज के 1) एक अच्छा विकल्प; कागज फाइबर की सतह पर कब्जा अणुओं के 2) स्थिर और उच्च कवरेज; 3) नमूने के समुचित से निपटने; और 4) सामान्य प्रयोगशाला स्वच्छता अभ्यास।

झरझरा सामग्री कई सस्ती और उपकरणों से मुक्त assays में उपयोग किया गया है। वे ट्यून करने योग्य ताकना आकार, बहुमुखी कार्यक्षमता, कम लागत और उच्च सतह से मात्रा के अनुपात में तरल पदार्थ का निष्क्रिय wicking अनुमति देने के लिए हो सकता है। हम मुख्य रूप से इसके समुचित ध्यान में लीन होना आकार और कम प्रोटीन सोखना के लिए क्रोमैटोग्राफी सेल्यूलोज कागज ग्रेड 1 चुना है। एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया झरझरा सामग्री, nitrocellulose की तुलना में, सेल्यूलोज कागज बहुत कम अविशिष्ट प्रोटीन सोखना 34 है। हम भी इस अध्ययन में ईवीएस के छोटे अविशिष्ट कब्जा पाते हैं। इसके अलावा, इसके कण प्रतिधारण स्तर, 11 माइक्रोन, में विशिष्ट कब्जा करने के लिए अनुमति देता है, ईवीएस 35 के आकार से बड़ा हैईवीएस के भौतिक फँसाने के विपरीत। यहाँ, हम बड़े ईवीएस अध्ययन किया जा करने के लिए कर रहे हैं जब से संशोधित किया जा सकता है, जो कदम के लिए एक 0.8 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सीरम नमूनों से गुजर रहा एक छोटे आकार के ईवीएस पर ध्यान केंद्रित।

रासायनिक सतह संशोधन ईवी अलगाव की दक्षता में सुधार लाने का एक साधन के रूप में सतह पर कब्जा अणुओं की एक स्थिर और उच्च कवरेज प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण हो सकता है। सेलूलोज के भूतल संशोधनों 36,37 समीक्षा की गई है। वहाँ उच्च हाइड्रॉक्सिल (ओह) की संख्या समूहों सेल्यूलोज की सतह पर होते हैं और वे ऑक्सीजन प्लाज्मा या अन्य संक्षेपण प्रक्रिया के साथ सक्रिय होने के बाद स्थिर रासायनिक सी- ओसी बांड देने के लिए silane के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। इस अध्ययन में इस्तेमाल silane (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane, (मेव) 3 Si- (सीएच 2) 3 -SH है। thiol (-SH) समूह एक छोटी जगह बांह (0.73 एनएम) और कहा कि प्राथमिक amines के साथ जोड़ों एक crosslinking समूह प्रदान करने के लिए GMBS के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। Amine समूहों के साथ कब्जा अणुओं संयुग्मित किया जा सकता हैसीधे GMBS करने के लिए। इस अध्ययन में, हालांकि, हम NeutrAvidin बजाय बायोटिन चिह्नित कर रहे हैं कि विभिन्न कब्जा अणुओं संयुग्म करने के लिए एक सामान्य योजना प्रदान करने के लिए संयुग्मित। हालांकि, ईवी उप-विशिष्ट मार्करों पर आम सहमति अभी तक 17 पहुँचा जा करने के लिए किया गया है। NeutrAvidin जैसे ईवीएस की सतह बायोटिन के लिए एक बहुत मजबूत संबंध है और एक के पास तटस्थ समविद्युतविभव बिंदु (पीएच 6.3), नकारात्मक आरोप लगाया वस्तुओं के साथ अविशिष्ट बातचीत कम से कम है। इसके विपरीत, 10.5 के एक समविद्युतविभव बिंदु के साथ avidin तटस्थ पीएच पर सकारात्मक आरोप वहन करती है। विरोधी CD63 एंटीबॉडी के एक उच्च एकाग्रता कारण मुख्य रूप से लागू किया छोटी मात्रा और कागज डिवाइस का बड़ा सतह-से-मात्रा के अनुपात में, चेन एट अल। 20 में है कि अधिक से प्रयोग किया जाता है। हालांकि, राशि और कागज फाइबर पर adsorbed प्रोटीन की रचनाओं की विशेषता नहीं किया गया है, नमूना पर निर्भर हो सकता है। प्रोटीन विश्लेषण के परिणामों की व्याख्या इसलिए, जब ध्यान रखा जाना चाहिए।

एकत्रित द्विological नमूने धीरे संभाला और artifactually वृद्धि हुई ईवी के स्तर को रोकने के लिए तेजी से कार्रवाई की जानी चाहिए। यह -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले, यदि कोई हो, कोशिकाओं और प्लेटलेट्स दूर करने के लिए सिफारिश की है। ईवी अनुसंधान में नमूना से निपटने का एक वर्तमान मानकीकरण इस समीक्षा 17 में पाया जा सकता है।

उचित प्रयोगशाला स्वच्छता अभ्यास नियोजित किया जाना चाहिए। हमेशा धूल कणों और ribonucleases की शुरूआत के लिए कम से कम करने के लिए अक्सर दस्ताने और परिवर्तन दस्ताने पहनते हैं। ईवीएस ultracentrifuge विधि (अप्रकाशित) का उपयोग केंद्रित से निकाले गए की तुलना में सेल संस्कृति वातानुकूलित मीडिया में ईवीएस से शाही सेना के अलगाव कागज उपकरणों का उपयोग कर अधिक से अधिक 70 गुना अधिक सांद्रता प्राप्ति कर सकते हैं।

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल ईवीएस के विभिन्न उपसमूहों अलग करने के लिए कब्जा अणुओं के साथ रासायनिक संशोधित सेलूलोज़ कागज उपकरणों का उपयोग करता है। नमूना मात्रा सीमित है जब विधि सरल, कुशल, और विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

इस काम ताइवान राष्ट्रीय विज्ञान परिषद grants- एनएससी 99-2320-बी-007-005-MY2 (सीसी) और एनएससी 101-2628-ए-007-011-MY3 (सीएमसी), और दिग्गजों जनरल द्वारा समर्थित किया गया था अस्पताल और ताइवान संयुक्त अनुसंधान कार्यक्रम के विश्वविद्यालय प्रणाली (सीसी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

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References

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कोशिकी vesicles के अलगाव और विशेषता के लिए कागज आधारित उपकरणों
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Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

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