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Bioengineering

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

이 프로토콜은 적게 10 μL의 혈청 샘플에서 세포 외 소체 (전기 자동차), 셀로부터 방출 멤브레인 작은 입자를 분리하는 방법을 자세히 설명. 이 접근법은, 초 원심 분리의 필요성을 회피 분석 시간의 몇 분을 필요로하고, 제한된 양의 시료로부터 전기차의 분리를 가능하게한다.

Abstract

세포 외 소포 (전기 자동차), 각종 세포에서 방출 막의 입자는, 임상 적용을위한 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그들은 핵산과 단백질화물을 포함 점점 진핵​​ 생물과 원핵 세포 모두에 의해 사용되는 세포 간 의사 소통의 수단으로 인식하고 있습니다. 그러나, 작은 크기로, 전기 자동차의 분리를위한 현재의 프로토콜은 종종 시간이 소요, 복잡하고, 이러한 초 원심 분리기와 같은 큰 샘플 볼륨과 고가의 장비를 필요로합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 쉽게 효율적이고, 10 μL로 낮은 샘플 볼륨을 필요 전기차의 서브 그룹들을 분리하기위한 종이 기반 면역 플랫폼을 개발했다. 생물학적 시료는 화학적으로 특정한 EV 표면 마커에 높은 친 화성을 가지고 포획 분자로 변성 된 종이 테스트 존에 직접 피펫 팅 될 수있다. 우리는 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 분석의 유효성을 확인, 종이 기반 효소 결합 immunosorbent 분석 (P-ELISA)과 전 사체 분석. 이 종이 기반의 디바이스는 건강과 질병에 EV 기능에 대한 우리의 이해를 발전하기 위해 병원과 연구 환경에서 전기 자동차의 연구를 가능하게 할 것이다.

Protocol

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작업 절차의 일반 다이어그램 그림 1에 제공됩니다. 윤리 실천을 사용하여, 우리는 (정상인의 혈액 샘플을 수집하고, IRB는 프로토콜을 승인 대만에서 타이 재향 군인 병원 (TCVGH), 타이 통해 환자의 방수 샘플을 얻을 IRB TCVGH 번호 CF11213-1).

종이 장치 1. 제작

  1. 96- 웰 마이크로 타이 터 플레이트와 같은 레이아웃을 제공하도록 직경 5mm의 원으로 크로마토 종이 잘라. 등록 관통 구멍, 라미네이트 두 폴리스티렌 시트 이러한 종이 조각을 샌드위치.
  2. 다음 28 단계에서 설명한 화학적 컨쥬 게이션 방법을 사용하여 용지를 수정 장치.
    1. 플라즈마 챔버에서의 산소 플라즈마 (100 mW의 1 % 산소, 30 초)와 함께 종이 취급 장치.
      주의 : 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란 및 N -γ 말레이 미도 숙신이 미드로 작업 할 때 특별한주의를 기울여야합니다에스테르 (GMBS), 그들은 모두 습기에 민감하고 독성이 있기 때문이다. 보호 장갑을 착용하고 흡입을 피하거나 피부 및 눈에 접촉. 밀폐하여 주식 병을 유지하고 결로를 방지하기 위해 열기 전에 RT 평형 수 있습니다. 또한, 질소 충전 장갑 가방이나 상자 안에 주식 병을 엽니 다. 작은 튜브로 나누어지는 주식 병을 자주 개방을 방지 할 수 있습니다.
    2. 바로 30 분 동안 에탄올 (200 증명)에 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란의 4 % (v / v)의 용액에 용지 처리 장치를 배양한다.
    3. 에탄올로 종이 장치를 씻어 15 분간 에탄올에 0.01 μmol / ㎖ GMBS으로 그들을 품어.
    4. 에탄올 (200 증명) 헹군 후 4 ℃에서 1 시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS)에 10 ㎍ / ml의 아비딘 용액을 종이 장치를 품어. 4 ° C에서 보관이 필요한 경우, 4 주 이내에 사용한다.
  3. (BSA를 PBS 10 μL가 소 혈청 알부민 (/ V W) 1 %를 함유하는 각 용지 테스트 존 적셔) 3 × 10 분 동안 캡처 분자를 바이오틴 10 μl를 안보 전에 3 × 10 분. 또는 아 넥신 V (1:20 넥신 V 결합 버퍼에 v / v)의 항 CD63 항체를 사용하여 (PBS는 w / v)의 BSA와 0.09 % (/ v)의 아 지드 화 나트륨 w (1 %를 포함하는 20 μg의는 / ㎖) 포획 분자.
  4. PBS는 각각 3 × 1 분간 완충액 결합 BSA 또는 아 넥신 V (/ V W) 1 %를 함유하는 상응하는 10 μl를 이용하여 결합되지 않은 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자를 씻어.

2. 혈청 및 방수 샘플 수집 및 처리

  1. 혈청 수집.
    1. 혈청 분리 튜브에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 10 ㎖를 수집하고 부드럽게 튜브 다섯 번 반전. 수직으로 튜브를 설정하고 30 분 동안 기다립니다.
    2. 15 분 동안 1,200 × g에서 원심 분리기. 30 분 동안 3,000 × g에서 다시 깨끗한 튜브 가기 층에서 혈청, 원심 분리기를 전송합니다.
    3. 0.8 μm의 FIL 통해 뜨는을 전달터. 사용할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
  2. 수성 유머 컬렉션 : 사용할 때까지 -80 ° C에서 직접 절차 및 샘플을 저장 침략을 통해 안과 의사에 의해 진단 된 환자에서 방수 샘플을 수집합니다.

세포 외 소포 3. 분리

  1. 5 μL / 분의 속도로 각각의 용지 상에 테스트 존 순간 표본.
  2. BSA 또는 넥신 V 각각 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자로 기능화 된 종이 장치의 3 × 1 분간 완충액 바인딩 (/ V는 W) PBS 1 % 함유 대응 10 μL와 언 바운드 전기차 헹구어. 다음과 같은 다운 스트림 분석을 수행합니다.

4. 다운 스트림 분석 예 1 : 스캔 Electromicrographs

  1. 10 분 동안 10 μL 0.5 × Karnovsky의 정착을 사용하여 작용 종이 테스트 존에서 캡처 한 전기 자동차를 수정합니다.
  2. 2 × 5 분 동안 충분한 PBS로 샘플을 씻어.
  3. 탈수10 분, 2 × 10 분, 50 % 에탄올, 2 × 10 분, 70 % 에탄올, 2 × 10 분, 95 % 에탄올, 4 × 10 분 동안 100 % 에탄올 이후 35 % 에탄올로 샘플.
  4. 건조 및 코트에게 긴급 팔라듐 / 금으로 샘플을 스퍼터링하고, 저 전자 가속 전압에서 작동 사형 전자 현미경을 사용하여 검사 (~ 5 kV로).

5. 다운 스트림 분석 예 2 : 종이 기반의 ELISA

  1. 1 항 CD9 차 항체를 함유하는 5 μL 솔루션을 추가 : 1000 희석 PBS에서 캡처 전기 자동차를 포함하는 각 시험 영역에. 1 분을 기다립니다.
  2. PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어.
  3. 5 μL 솔루션을 포함하는 고추 냉이 과산화 효소 (HRP)를 1 차 항체를 -linked 추가 PBS 1,000 희석하고 1 분을 기다립니다.
  4. PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어.
  5. 과산화수소의 부피비 1 : 1를 함유하는 5 μL 비색 기질 추가D의 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)와 데스크탑 스캐너를 사용하여 스캔.

6. 다운 스트림 분석의 예 3 : RNA 분리

  1. 캡처 된 전기 자동차를 용해하는 버퍼를 바인딩 / 폴리 비닐 피 롤리 돈 기반 RNA 분리 원조의 35 μL와 용해의 265 μL에 샘플을 담가. 소용돌이 적극적으로.
  2. 해물에 격리 키트에 30 μL 균질를 추가합니다. 소용돌이는 적극적으로 10 분 동안 얼음에 넣어.
  3. 다음 단계에 설명 된 산 페놀 - 클로로포름 분리를 사용하여 RNA를 추출합니다.
    1. 병의 바닥 층에서 페놀 - 클로로포름 330 μl를 타고 균질 / 해물을 추가 할 수 있습니다. 소용돌이 적극적으로.
    2. 5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 깨끗한 튜브로 수성 (위)의 위상을 전송하고 제거 볼륨을 확인합니다.
  4. 이전 단계에서 제거 및 CO 성상의 1.25 배 부피 100 부피 % 에탄올 총 RNA를 침전95 ° C로 예열 용출 용액에서 RNA를 llect.
  5. 농축시키고, 상기의 제조 프로토콜에 따라 RNA 정리 키트를 사용하여 RNA를 정제.

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Representative Results

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전기차의 하위 그룹을 분리하는 종이 장치의 기능을 효율적으로 EV 표면 마커의 민감하고 특이 인식에 의존한다. 포획 분자와 종이 섬유의 안정한 다른 변형 28-30 바와 같이 아비딘 - 비오틴 화학 제를 사용함으로써 달성된다. 물리적 흡착 방법의 화학적 결합의 효과와 그 형광 기반의 판독을 사용하여 평가한다. 종이 시험 영역은 단계 1.3에서 20 ㎍ / ml의 형광 단의 R 피코 에리 트린 - 복합 비타민 B 복합체 분자 (PE-비오틴)로 대체 캡처 분자를 제외하고 프로토콜 1 단계)에 따라 제조된다. 종이 시험 영역은 다음 언 바운드 PE-비오틴 분자를 제거하는 PBS로 세척한다. 대조적으로, PBS를 1 % 함유하는 10 ㎕를 20 ㎍ / ml의 PE 비오틴 (w / v)의 BSA 및 0.09 % (w / v)의 아 지드 화 나트륨을 직접 PBS이어서, 3 × 10 분간 종이 테스트 존에서 목격되고 PE 비오틴 염료 분자의 물리적 흡착을 수행하기위한 린스. 화학적수정 된 종이 장치 ( "종이 + 가교제 + 염료") 처리되지 않은 종이 장치와 함께 ( "종이"), PE-비오틴 분자 ( "종이 + 가교제")와 physisorbed 종이 장치의 응용 프로그램없이 같은 프로토콜을 사용하여 수정 된 종이 장치 PE 비오틴 분자 ( "physisorbed 염료") 540-560 nm의 여기로 설정된 화상 기록 시스템을 이용하여 스캐닝된다, 575 nm의 롱 패스 배기 가스 및 데이터는 16 비트 파일의 형태로 저장 및 분석 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여. 도 2a에 도시 된 바와 같이 물리적으로 코팅지 테스트 존에 비해, 화학 결합 법에 의해 제조 된 테스트 영역의 형광 강도 (p 값 <0.0005 N = 5, 스튜던트 t 검정), 실질적으로 더 높다. 캡처 분자가 PBS 용액으로 대체 할 때 몇 전기차 용지 장치에 유지됩니다 그림 2B, C,에 예시 된 바와 같이 전기 자동차의 캡처도 다릅니다.

전기 자동차는시에서 이질적ZES, 구체적인 내용 및 생합성 경로. 바인드하기 위해 두 개의 다른 EV 포획 분자, 항 CD63 항체 및 아 넥신 V로 코팅 된 종이 장치가 준비되었다. CD63, tetraspanin 가족의 일원은 (CD9, CD63, CD81 및 CD82 분자를 포함) EV 막 (31)에 충실하고, 아 넥신 V는 포스파티딜 세린 (PS) 32, 33에 대한 강한 친 화성을 ​​가지고있다. 이 전기차가되는 과정 정상 세포 인지질의 비대칭이 EV 막의 외부 전단지에 PS의 노출 증가로 이어지는, 손실, 조기 사멸 중 또는 스트레스 조건 하에서 구조적으로 출시되는 것을 알 수있다. SEM 이미지의 분석은 국지적 인 두 꼬리 학생의 t- 테스트 통계 p- 값을 결정하는 데 사용되는 CD63 + 전기 자동차 및 PS + 전기 자동차의 크기 분포는 평균 80의 직경이 각각 43 나노 미터로, 다른 것을 (그림 3) 표시 (p- 값 <0.0001). 놀랍게도, CD63 + 전기 자동차는 라운드 나타나고, 생물학적하는 평균 + 전기 자동차 PS보다 큰의미는 밝혀지지 남아있다.

종이에 캡처 장치 전기차로부터 RNA를 추출 할 수있다. bioanalyzer와 분석은 CD63 +와 PS + 전기 자동차 (그림 4A)에서 추출 된 총 RNA를 비슷한 전체 프로필을 보여 주었다. 각각 약 배 혈청 시료의 단위 부피당 39 배 더 혈 작은 샘플 량 (표 1)를 사용이라도 용지 장치를 이용하여 압축 해제 된 미세 유체와 초 원심 분리 기술을 이용하여 추출 된 RNA의 양에 비해. P-ELISA는 전기차의 검출을 위해 수행 될 수있다. 안티 CD9 일차 항체와 HRP 접합 된 이차 항체는도 4b는 (PBS로 희석) 10 ㎕의 PBS, 50 % 혈청이인가 종이 장치의 HRP의 효소 반응에 의해 생성 된 그레이 값의 변화를 표시한다. 본 연구에서 사용 된, 또는 100 아르 각각 % 혈청. 그레이 값은 시험 혈청 샘플들의 범위에 선형 적으로 증가한다.

예를 들어, 초 원심은, 사용하는 경우 함께 풀링됩니다. SEM 사진에서 볼 수있는 항 CD63 항체로 코팅 용지 장치와 격리 환자 방수 샘플에서 전기 자동차는 그림 5에서 보여있다.

그림 1
그림 1. 분리 및 세포 외 소포의 특성을 목표로 종이 기반 분석의 제조 및 운영 절차. (A) 필터 종이는 원하는 모양으로 절단 및 적층된다. (B) 종이의 표면은 산소 플라즈마의 간단한 처리로 개질 및 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란, N <과 반응시켜/ EM> -γ 말레이 숙신이 미드 에스테르 및 비딘, 순차. 오티 닐화 포획 분자는, 예를 들어, 항체는 비오틴과 다음 비딘 분자간 친화력 통해 고정화 될 수있다. (C)는 Biosamples 기능화 종이 위에 피펫 장치 일 수있다. 소체 세포는 분리 될 수있다. (D) 등 SEM, 사체 및 ELISA (도시)와 같은 다운 스트림 분석, 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 세포 외 소포 (전기 자동차)가 좋은 특이성과 감도 작용 종이 장치에서 캡처 할 수 있습니다. (A) 형광 표지 된 비오틴 분자가 높은 용지에 고정화화학 결합 과정의 물리적 흡착과 달리 ( "종이 + 가교제 + 염료") ( "physisorbed 염색")를 통해 장치. 처리되지 않은 종이 ( "종이")와 접합 분자 ( "종이 + 가교제")는 형광 강도에 작은 기여한다. 포획 분자는 PBS는 BSA (/ V W) 1 %를 함유함으로써 교체 될 때 (B) 약간 전기차를 나타내는 대표적인 SEM 화상은 비특이적 용지 디바이스에서 캡쳐된다. (C) 많은 전기 자동차는 항 CD63 항체로 코팅 된 종이 장치에 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3- 머 캅토
세포 외 소포 그림 3. 하위 그룹 (전기 자동차) 다른 크기 분포를 가질 수있다. (A)(B)는 각각 항 CD63 항체 및 아 넥신 V 분자로 코팅 된 종이에 캡처 장치 전기차 나타내는 SEM 이미지이다. (C) CD63 + 전기 자동차가 본 연구에 사용 된 실험 조건에서 PS + 전기 자동차보다 크게 나타납니다 (p- 값 <0.0001, n은 124, 203, 학생의 t- 테스트 =). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 다운 스트림 사체 및 ELISA 분석. (A) 전기 자동차에서 추출한 형광 표지 된 총 RNA의 분포 캡처 (NT) 뉴클레오티드 (에 X 축) 강도에게 (임의의 단위로 y 축) 및 크기를 보여주는 Bioanalyzer 데이터 안티 CD63에 항체 또는 넥신 필터 논문을 V는 코팅. ~ 25 마이그레이션 피크는 NT를 나타냅니다 내부 표준. (B) (10) PBS ㎕의 샘플, (PBS로 희석) 50 %의 혈청 및 100 %의 혈청이인가 종이 장치의 P-ELISA 분석에서의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제의 효소 반응 (HRP)에 의해 생성 된 그레이 값의 변화. 를 클릭하세요 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 5
방수 샘플 그림 5. 세포 외 소포 (전기 자동차)는 샘플 풀링없이 작용 필터 종이에 캡처 할 수 있습니다. 방수 샘플의 SEM의 고립 된 CD63의 이미지 + 전기 자동차를 환자 (A) 연령 관련 황반 변성, (B) 당뇨 황반부로 부종, 각각 (C) 결절 맥락막 혈관 병증.로드 / 52722 / 52722fig5highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분리 방법 캡처 분자 혈청 권. (μL) 추출 된 평균 RNA (NG) 평균 추출 된 RNA / 혈청
(PG / μL)
평균 RNA / 혈청의 비 심판
미세 유체 장치 항 인간 CD63 (400) 4.14 10.4 (20) (20)
종이 장치 항 인간 CD63 (72) 1.49 ± 0.08 20.7 (39) (22)
종이 장치 아 넥신 V (72) 0.99 ± 0.26 13.8 (26) (22)
초 원심 분리 - 2,000 1.06 ± 0.64 0.53 (1)
혈청 - (72) 1.23 ± 0.58 (17) (32) (22)

건강한 지원자에서 혈청 샘플에서 추출 표 1. 총 RNA는 bioanalyzer (모든 조건 N = 4)로 분석 하였다.

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Discussion

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세포 외 소포의 하위 그룹의 성공적인 분리를위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 용지 1) 좋은 선택; 종이 섬유의 표면 상에 포획 분자의 2)에 따르면 안정적이고 높은; 3) 시료의 적절한 처리; 4) 일반 실험실 위생 기준.

다공성 물질은 많은 저렴하고 장비가없는 분석에 사용되어왔다. 이들은 가변 공경, 다목적 기능, 저가 및 높은 표면 대 부피 비율 유체의 수동적 위킹을 허용을 가질 수도있다. 우리는 주로 적절한 기공 크기와 낮은 단백질 흡착 크로마토 그래피 셀룰로오스 종이 1 등급을 선택했다. 다른 일반적으로 사용되는 다공성 물질, 니트로 셀룰로오스에 비해, 셀룰로오스 종이 훨씬 낮은 비특이적 단백질 흡착 (34)를 갖는다. 우리는 또한이 연구에서 전기 자동차의 작은 비특이적 캡처를 찾을 수 있습니다. 또한, 그 입자 보유 수준으로 11㎛가 특정 캡쳐를 허용 전기차 (35)의 크기보다 큰전기 자동차의 물리적 트래핑에 대비. 여기서 우리는 큰 전기 자동차가 연구 할 때 변경 될 수있다 단계 0.8 μm의 필터를 통해 혈청 샘플을 전달하여 작은 크기의 전기 자동차에 초점을 맞 춥니 다.

화학, 표면 개질 EV의 분리 효율을 개선하는 수단으로서 표면 상에 포획 분자의 안정성 및 고 커버리지를 달성하기 위해 키가 될 수있다. 셀룰로오스의 표면 수정 (36, 37)을 검토하고있다. 거기 높은 수산기 (-OH) 기의 수는 셀룰로오스의 표면 상에 있으며 이들은 산소 플라즈마 또는 다른 축합 프로세스로 활성화 된 후에 안정시 ​​- OC 화학적 결합을 제공하기 위해 실란과 반응 할 수있다. 본 연구에 사용 된 실란 (3- 머 캅토 프로필) 트리 메 톡시 실란, (MEO) 3의 Si- (CH 2) 3, -SH이다. 티올 (-SH) 그룹은 짧은 아암 (0.73 ㎚) 및 차 아민과 커플 가교기를 제공 GMBS와 반응 할 수있다. 아민 기와 포획 분자는 접합 될 수있다직접 GMBS합니다. 본 연구에서는, 그러나 대신 비딘 비오틴 표지 된 각종 포획 분자 결합체를 일반적인 방식을 제공하기 위해 접합. 그러나, EV 하위 유형 특정 마커에 대한 합의는 아직 (17)에 도달해야한다. 뉴트라는 예를 들어 전기 자동차의 표면 비오틴에 매우 강한 친 화성이 거의 중립 등전점 (PH 6.3), 음으로 대전 된 물체 비특이적 상호 작용을 최소화을 가지고 있습니다. 대조적으로, 10.5의 등전점과 아비딘은 중성 pH에서 양전하를 운반한다. 항 CD63 항체의 높은 농도는 주로인가 작은 부피 및 제지 장치의 더 큰 표면 대 부피 비율, 첸 등. (20)에 비해 사용된다. 그러나, 양 및 종이 섬유에 흡착 된 단백질의 조성물을 특성화되지 않은 샘플 의존적 일 수있다. 단백질 분석의 결과를 해석 할 때 따라서,주의가 필요.

수집 된 양방향학적 샘플 부드럽게 취급 artifactually EV 증가 수준을 방지하기 위해 신속하게 처리해야한다. 그것은 -80 ° C에 저장하기 전에, 어떤 경우, 세포와 혈소판을 제거하는 것이 좋습니다. EV 연구에 시료 처리의 현재 표준화가이 리뷰 17에서 찾을 수 있습니다.

적절한 실험실 위생 기준이 적용되어야한다. 항상 먼지 입자와 리보 뉴 클레아 제의 도입을 최소화하기 위해 자주 장갑 및 변경 장갑을 착용하십시오. 전기차 초원 심법 (미공개)를 사용하여 농축 추출에 비하여 세포 배양 된 배지에서 전기차로부터 RNA의 분리는 종이를 사용하는 장치보다 70 배 이상의 농도를 수득 할 수있다.

본원에 기재된 프로토콜은 전기차의 다른 서브 그룹을 분리하는 포획 분자와 화학적으로 개질 된 셀룰로오스 종이 장치를 사용한다. 샘플 량은 제한되는 경우에있어서, 간단하고 효율적이며 특히 유용하다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 대만 국립 과학위원회 grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) 및 NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) 및 재향 군인의 일반에 의해 부분적으로 지원 병원과 대만의 공동 연구 프로그램의 대학 시스템 (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

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