Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Papirbaserte Enheter for isolering og karakterisering av Ekstracellulær Blemmer

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

Denne protokollen detaljer en metode for å isolere ekstracellulære vesikler (EVS), små membran partikler frigjøres fra celler, fra så lite som 10 pl serumprøver. Denne tilnærmingen omgår behovet for ultrasentrifugering, krever bare noen få minutter av analysen tid, og muliggjør isoleringen av el-biler fra prøver av begrensede volumer.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EVS), membran partikler frigjøres fra forskjellige typer celler, holde et stort potensial for kliniske applikasjoner. De inneholder nukleinsyre og protein last og er i økende grad anerkjent som et middel for intercellulær kommunikasjon benyttes av både eukaryote og prokaryote celler. Men på grunn av sin lille størrelse, aktuelle protokoller for isolering av elbiler er ofte tidkrevende, tungvint, og krever store prøvevolumer og dyrt utstyr, for eksempel en ultrasentrifuge. For å møte disse begrensningene, har vi utviklet et papirbasert immunoaffinitets plattform for å skille undergrupper av elbiler som er enkel, effektiv og krever prøvevolumer så lavt som 10 pl. Biologiske prøver kan pipetteres direkte på papir testsoner som er kjemisk modifisert med fangst molekyler som har høy affinitet til spesifikke markører EV overflate. Vi validere analysen ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM), papir-basert enzymbundet immunosorbent-analyser (P-ELISA), og transkriptomet analyse. Disse papirbaserte enheter vil gjøre studiet av elbiler i klinikken og forskning innstillingen til å hjelpe fremme vår forståelse av EV funksjoner i helse og sykdom.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En generell diagram av operasjonen prosedyren er gitt i figur 1. Ved hjelp av etisk praksis, vi samlet inn blodprøver fra friske personer, og fått kammervæskeprøver fra pasienter gjennom Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan etter IRB godkjent protokoller ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Fabrikasjon av Papir Devices

  1. Skjær kromatografi papir i sirkler av 5 mm i diameter for å tilveiebringe det samme oppsett som en 96-brønners mikrotiterplate. Sandwich disse papir stykker med to isoporplater med registrert gjennom-hull, og laminat.
  2. Endre papir enheter ved hjelp av den kjemiske konjugeringsmetoden beskrevet i følgende trinn 28.
    1. Behandle papir enheter med oksygenplasma (100 mW, 1% oksygen, 30 sek) i en plasmakammer.
      FORSIKTIG: Spesiell forsiktighet må tas når du arbeider med tre-merkaptopropyl trimetoksysilan og N -γ-maleimidobutyryloksy succinimideester (GMBS), ettersom de er både fuktighetsfølsomme og giftig. Bruk vernehansker og unngå innånding og kontakt med hud og øyne. Hold lager flasken tett lukket og la det oppnå til RT før åpning for å unngå vann kondens. Alternativt åpne lager flaske inne i en nitrogenfylt pose eller boks. Delmengde i små ampuller for å unngå hyppig åpning av bestanden flasken.
    2. Umiddelbart Inkuber behandlede papir-enheter i en 4% (v / v) løsning av 3-merkaptopropyl-trimetoksysilan i etanol (200 proof) i 30 min.
    3. Skyll papir enheter med etanol og inkuber dem med 0,01 umol / ml GMBS i etanol i 15 min.
    4. Skyll med etanol (200 proof) og inkuber papir enheter med 10 ug / ml avidin-løsning i fosfatbufret saltvann (PBS) i 1 time ved 4 ° C. Oppbevar ved 4 ° C hvis det er nødvendig, og bruk innen 4 uker.
  3. Våt hver papirtestsoner med 10 ul PBS inneholdende 1% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) For 3 × 10 min før spotting 10 pl biotinylerte fange molekyler for 3 × 10 min. Bruke anti-CD63-antistoff (20 ug / ml i PBS inneholdende 1% (vekt / vol) BSA og 0,09% (w / v) natriumazid) eller annexin V (1:20, v / v i annexin V bindingsbuffer) så fange molekyler.
  4. Skyll av ubundet anti-CD63-antistoff eller annexin V-molekyler ved anvendelse av 10 ul tilsvarende PBS inneholdende 1% (w / v) BSA eller annexin V bindingsbufferløsninger for 3 x 1 min, respektivt.

2. Serum og Vandig humor Prøvetaking og prosessering

  1. Serum samling.
    1. Samle 10 ml perifert blod ved venepunksjon i serumseparasjons rør og forsiktig Snu røret fem ganger. Sette røret i vertikal stilling og vente på 30 min.
    2. Sentrifuger ved 1200 x g i 15 min. Overfør serum fra topplaget til et rent rør, og sentrifuger på nytt ved 3000 x g i 30 min.
    3. Passere supernatanten gjennom en 0,8 mikrometer filter. Holde prøven ved -80 ° C inntil bruk.
  2. Kammer samling: samle kammervæskeprøver fra pasienter diagnostisert av en øyelege direkte gjennom invasive prosedyrer og lagre prøvene ved -80 ° C inntil bruk.

3. Isolering av Ekstracellulær Blemmer

  1. Spot prøver over på hver enkelt papir test sone med en hastighet på 5 mL / min.
  2. Skyll av ubundne EV med 10 ul PBS inneholdende tilsvarende 1% (w / v) BSA eller annexin V bindingsbufferløsninger for 3 x 1 min for papir enheter funksjonalisert med anti-CD63-antistoff eller annexin V-molekyler, respektivt. Utfør følgende nedstrøms analyser.

4. Nedstrøms Analyseeksempel 1: Skanne Electromicrographs

  1. Fix elbiler fanget på funksjon papir test sone ved hjelp av 10 pl 0,5 × Karnovsky sin fiksativ i 10 min.
  2. Skyll prøvene med rikelig PBS for 2 × 5 min.
  3. Dehydrererprøver med etterfølgende 35% etanol i 10 min, 50% etanol i 2 x 10 min, 70% etanol i 2 x 10 min, 95% etanol i 2 x 10 minutter, og 100% etanol i 4 x 10 min.
  4. Kritisk tørr og frese belegge prøvene med palladium / gull, og undersøke ved hjelp av et scanning elektronmikroskop drives med lav elektronakselerasjonsspenning (~ 5 kV).

5. Nedstrøms Analyseeksempel 2: Papirbasert ELISA

  1. Legg en 5 mL løsning som inneholder anti-CD9 primær antistoff ved 1: 1000 fortynning i PBS til hver test sone som inneholder fanget elbiler. Vent 1 min.
  2. Skyll prøvene med 30 ml PBS ristet ved 100 opm i 30 sek.
  3. Legg til en 5 ul løsning som inneholdt pepperrot-peroxydase (HRP) -bundne sekundært antistoff i 1: 1000-fortynning i PBS, og vent 1 minutt.
  4. Skyll prøvene med 30 ml PBS ristet ved 100 opm i 30 sek.
  5. Legg til en 5 mL kolorimetrisk substrat inneholdende 1: 1 volumforhold av hydrogenperoksyd end 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) og skanne med en stasjonær scanner.

6. Nedstrøms Analyseeksempel 3: RNA Isolation

  1. Fordyp prøvene i 35 mL av polyvinylpyrrolidon-basert RNA isolering hjelpemiddel og 265 mL av lysis / bindingsbuffer for å lysere elbiler fanget. Vortex kraftig.
  2. Tilsett 30 ul homogenat gitt i isoleringssettet til lysatet. Vortex kraftig og satt på is i 10 min.
  3. Pakk ut RNA ved hjelp av syre fenol-kloroform separasjon beskrevet i følgende trinn.
    1. Ta 330 mL av fenol-kloroform fra det nederste laget av flasken og legge til homogenate / lysatet. Vortex kraftig.
    2. Sentrifuger ved 10000 x g i 5 min. Overfør vandig (øvre) fasen til et rent rør og merk volumet fjernet.
  4. Utfelling av total RNA med 100% etanol av volumet som er 1,25 ganger volumet av den vandige fasen fjernet i det foregående trinn og collect RNA i elueringsoppløsningen forvarmet til 95 ° C.
  5. Oppkonsentrer og rens ytterligere RNA ved hjelp av en RNA-rensesett ifølge fremstilling protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Muligheten av papir enheten for å isolere undergrupper av elbiler effektivt er avhengig av sin følsomme og innpassing av EV overflatemarkører. Den stabile modifikasjon av papirfibre med fangst-molekyler oppnås ved å bruke avidin-biotin kjemi som beskrevet andre steder 28-30. Effektiviteten av kjemisk konjugering, og at av de fysisorpsjon metoden er vurdert ved hjelp av fluorescens-basert avlesninger. De papirtest soner er fremstilt ved å følge protokollen trinn 1), bortsett fra fangst molekylet er erstattet med 20 pg / ml fluorofor R-fykoerytrin-konjugert biotin molekyler (PE-biotin) i trinn 1.3. De papirtestsoner blir deretter skylt med PBS for å fjerne ubundet biotin PE-molekyler. I motsetning til dette, 10 ul 20 ug / ml PE-biotin i PBS inneholdende 1% (vekt / vol) BSA og 0,09% (w / v) natriumazid er direkte flekket på papirtestsonen for 3 x 10 min, etterfulgt av PBS skyll for å gjennomføre physisorption av PE-biotin fargestoffer. Kjemiskmodifiserte papir enheter ("paper + tverrbindingsmiddel + dye") sammen med ubehandlet papir-enheter ("papir"), papir enheter modifisert med den samme protokollen uten anvendelse av PE-biotin-molekyler ("paper + tverrbindingsmiddel") og papir enheter med physisorbed PE-biotinmolekyler ("physisorbed-dye") er skannet ved hjelp av et bilde-rekord system satt til 540-560 nm eksitasjon, 575 nm lange-pass utslipp, og dataene er lagret i form av 16-bits filer og analysert hjelp ImageJ programvare. Som vist i figur 2A, fluorescens-intensiteten av testsoner fremstilt ved kjemisk konjugering metoden er vesentlig høyere, sammenlignet med fysisk belagte papirtestsoner (p-verdi <0,0005, n = 5, T-test). Fange av elbiler er også spesifikk som eksemplifisert i figur 2B, C, der få elbiler beholdes på papiret enheten når fangstmolekylene erstattes av PBS løsning.

Elbiler er heterogene i sizes, spesifikke innhold, og BIOGENESIS ruter. Å binde dem, papir enheter belagt med to forskjellige EV fangst molekyler, anti-CD63 antistoff og annexin V, var forberedt. CD63, et medlem av tetraspanin familien (som inkluderer CD9, CD63, CD81 og CD82 molekyler) er beriket på EV membran 31, og annexin V har en sterk affinitet for fosfatidylserin (PS) 32,33. Det er funnet at elbiler er utgitt konstitutivt under tidlig apoptose eller under stressbetingelser, i hvilken prosess normal celle fosfolipid asymmetri er tapt, noe som fører til økt eksponering av PS på den ytre vedlegget EV membran. Analyser av SEM-bilder viser at størrelsen distribusjoner av CD63 + elbiler og PS + elbiler er forskjellige, med gjennomsnittlige diameter på 80 og 43 nm, henholdsvis (figur 3) .Den tosidige T-test brukes til å bestemme den statistiske p-verdi (p-verdi <0,0001). Overraskende, CD63 + elbiler noe rundere og større enn PS + elbiler i gjennomsnitt, som biologiskbetydning er ikke klarlagt.

RNA fra elbiler fanget på papiret enhet kan utvinnes. Analyser med en Bioanalyzer viste lignende generelle profiler for total RNA hentet fra CD63 + og PS + elbiler (Figur 4A). Sammenlignet med de mengder av RNA ekstrahert ved hjelp av de microfluidic og ultra-sentrifugeringsteknikker, henholdsvis omtrent to ganger og 39 ganger mer RNA per volumenhet av serumprøven ble ekstrahert benytte papirenhet, riktignok ved hjelp av et mindre prøvevolum (Tabell 1). P-ELISA kan utføres for påvisning av elbiler. Anti-CD9 primært antistoff og HRP-konjugert sekundært antistoff blir anvendt i denne studien. Figur 4B viser grå verdi endres fremstilt ved enzymatisk reaksjon av HRP for papir enheter påføres med 10 pl PBS, 50% serum (fortynnet med PBS), eller 100 % serum, respektivt. Den grå verdi øker lineært innenfor området fra serumprøver testet.

f.eks, ultrasentrifugering, som skal benyttes. Elbiler fra pasientkammervæskeprøver isolert med papir enheter belagt med anti-CD63 antistoff kan sees i SEM-bilder som viste i figur 5.

Figur 1
Figur 1. fabrikasjon og betjeningsmåten av papirbaserte analyser rettet mot isolering og karakterisering av ekstracellulære vesikler. (A) filterpapir er kuttet til den ønskede form og laminert. (B) på overflaten av papiret er modifisert med en kort behandling med oksygenplasma og omsatt med 3-merkaptopropyl-trimetoksysilan, N </ Em> -γ-maleimidobutyryloksy succinimidester, og NeutrAvidin, i den rekkefølgen. Biotinylert capture-molekyler, for eksempel, antistoffer, kan så immobiliseres via den sterke affinitet mellom biotin og NeutrAvidin molekyler. (C) Biosamples kan være pipette på det funksjonaliserte papirenheten. Ekstracellulære vesikler kan bli isolert. (D) Nedstrøms analyser, for eksempel SEM, transkriptomet, og ELISA (vist), kan utføres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Ekstracellulære vesikler (EVS) kan fanges på funksjonpapir enheter med god spesifisitet og sensitivitet. (A) fluoresceinmerket biotinmolekyler er høyt immobilisert på papiretenhet via kjemisk konjugeringsprosessen ("papir + crosslinker + dye") i motsetning til fysisk adsorpsjon ("physisorbed-dye"). Ubehandlet papir ("papir") og konjugasjon molekyler ("papir + tverrbindings") bidrar lite til den fluorescens intensitet. (B) En representativ SEM-bilde som viser noen EV blir fanget på papir enheten ikke-spesifikt da registrerings molekyler er erstattet med PBS inneholdende 1% (w / v) BSA. (C) Mange elbiler beholdes på papir enheter belagt med anti-CD63 antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3-merkaptopropyl
Figur 3. undergrupper av Ekstracellulære vesikler (EVS) kan ha forskjellig størrelse distribusjoner. (A)og (B) er representative SEM bilder av el-biler har tatt på papir-enheter som er belagt med anti-CD63-antistoffer og annexin V molekyler hhv. (C) CD63 + elbiler virke større enn PS + elbiler under eksperimentelle forhold brukt i denne studien (p-verdi <0,0001, n = 124 og 203, T-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Nedstrøms transkriptom og ELISA-analyser. (A) Bioanalyzer data som viser intensiteten (y-aksen i vilkårlige enheter) og størrelse (x-aksen, i nukleotider (nt)) fordelinger av fluorescens-merket total-RNA ekstrahert fra EV fangede på anti-CD63 antistoff eller annexin V-belagt filterpapir. Den utvandrende topp på ~ 25 nt representerer en intern standard. (B) Grey verdiendringer fremstilt ved enzymatisk reaksjon av pepperrotperoksidase (HRP) i P-ELISA-analysen for papir enheter påføres med 10 ul prøver av PBS, 50% serum (fortynnet med PBS), og 100% serumprøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Ekstracellulære vesikler (EVS) i vandige humor prøver kan fanges på funksjon filter papir uten prøve pooling. SEM bilder av isolerte CD63 + elbiler i vandige humor prøver fra pasienter med (A) aldersrelatert makuladegenerasjon, (B) diabetiker macula ødem, og (C) polypoidal koroidal vaskulopati, henholdsvis.belastning / 52722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

isolasjonsmetoden fangst molekylet serum vol. (Pl) gjennomsnittlig RNA ekstrahert (ng) gjennomsnittlig ekstrahert RNA / serum
(Pg / mikroliter)
forholdet mellom gjennomsnittlig RNA / serum ref
microfluidic enhet anti-human CD63 400 4.14 10.4 20 20
papir enhet anti-human CD63 72 1.49 ± 0.08 20.7 39 22
papir enhet annexin V 72 0.99 ± 0.26 13.8 26 22
ultracentrifugation - 2000 1.06 ± 0.64 0.53 1
serum - 72 1,23 ± 0,58 17 32 22

Tabell 1. Total RNA ble ekstrahert fra serumprøver fra friske frivillige analysert med en Bioanalyzer (n = 4 i alle forhold).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De mest kritiske trinn for vellykket isolering av undergrupper av ekstracellulære vesikler er: 1) et godt valg av papir; 2) stabil og høy dekning av fangst-molekyler på overflaten av papirfibrene; 3) riktig håndtering av prøver; og 4) generell laboratoriehygienepraksis.

Porøse materialer er blitt benyttet i mange billig og utstyr fritt assays. De kan ha avstembar porestørrelse, allsidig funksjonalitet, lav kostnad og høy overflate-til-volum-forhold tillater passiv veke av fluider. Vi valgte kromatografi cellulosepapir av grad 1 hovedsakelig for sin riktige porestørrelse og lav protein adsorpsjon. Sammenlignet med en annen vanlig anvendte porøse materialer, nitrocellulose, har cellulosepapir mye lavere spesifikk protein adsorpsjon 34. Vi finner også litt uspesifikk fangst av elbiler i denne studien. I tillegg er dens partikkelansamlinger nivå, 11 um, større enn størrelsen på EV 35, slik at for bestemte fangst ikontrast til fysisk fangst av elbiler. Her fokuserer vi på elbiler av en mindre størrelse ved å sende serumprøver gjennom en 0,8 mikrometer filter, som trinnet kan bli endret når større elbiler er å bli undersøkt.

Kjemisk overflatemodifikasjon kan være en nøkkel til å oppnå en stabil og høy dekning av fangst-molekyler på overflaten som et middel til å forbedre effektiviteten av EV isolasjon. Overflate modifikasjoner av cellulose har blitt anmeldt 36,37. Det er et høyt antall hydroksyl (-OH) grupper på overflaten av cellulosen, og de kan reagere med silan for å gi stabile kjemiske bindinger Si-OC etter å ha blitt aktivert med oksygenplasma eller andre kondensprosessen. Silanet anvendes i denne studien er (3-merkaptopropyl) trimetoksysilan, (MeO) 3-Si- (CH2) 3-SH. Den tiol (-SH) -gruppen kan reagere med GMBS å tilveiebringe en kort arm (0,73 nm) og et tverrbindingsgruppe som par med primære aminer. Capture molekyler med amingrupper kan konjugereså GMBS direkte. I denne studien, men konjugert vi NeutrAvidin i stedet for å gi en generell ordning for å bøye forskjellige fangst molekyler som er biotinmerkede. Men konsensus på EV subtype-spesifikke markører har ennå ikke nådd 17. NeutrAvidin har en veldig sterk affinitet til biotin og en nær-nøytral isoelektrisk punkt (pH 6,3), minimering uspesifikke interaksjoner med negativt ladede objekter, for eksempel overflaten av elbiler. I motsetning til dette, avidin med et isoelektrisk punkt på 10,5 bærer positive ladninger ved nøytral pH. En høyere konsentrasjon av anti-CD63-antistoff anvendes enn i Chen et al. 20, hovedsakelig på grunn av lite volum påføres og den større overflate-til-volum-forhold på papirenheten. Imidlertid vil mengden og sammensetninger av proteiner adsorberes på papirfibrene ikke har blitt karakterisert, som kan være sample-avhengig. Derfor må man være forsiktig når man tolker resultatene av protein analyse.

Innsamlet biological prøvene skal håndteres forsiktig og behandles raskt for å hindre artifactually økt EV nivåer. Det anbefales å fjerne celler og blodplater, hvis noen, før lagring ved -80 ° C. En aktuell standardisering av prøvehåndtering i EV forskning kan bli funnet i denne anmeldelsen 17.

Riktig laboratorium hygienepraksis bør benyttes. Bruk alltid hansker og skift hansker ofte for å minimere innføring av støvpartikler og ribonucleases. Isolering av RNA fra elbiler i cellekultur med aircondition media kan gi mer enn 70 ganger større konsentrasjoner ved hjelp av papir enheter i forhold til det hentet fra elbiler konsentrert bruke ultrasentrifugen metoden (upublisert).

Protokollen er beskrevet her bruker cellulosepapir enheter modifisert kjemisk med fangst molekyler å isolere ulike undergrupper av elbiler. Metoden er enkel, effektiv, og spesielt verdifulle når prøvevolumet er begrenset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av Taiwan National Science Council grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) og NSC 101-2628-E-007-011-My3 (CMC), og den Veterans general sykehus og University System of Taiwan Joint Research Program (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
Papirbaserte Enheter for isolering og karakterisering av Ekstracellulær Blemmer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter