Summary
Detta protokoll detaljer en metod för att isolera cellulära vesiklar (EVT), små membranpartiklar som frigörs från celler, från så lite som 10 | il serumprov. Detta tillvägagångssätt kringgår behovet av ultracentrifuge, kräver bara några minuter av analystiden, och möjliggör isolering av elbilar från prover av begränsade volymer.
Abstract
Cellulära vesiklar (EVS), membranpartiklar som frigörs från olika typer av celler, hålla en stor potential för kliniska tillämpningar. De innehåller nukleinsyra och protein last och erkänns alltmer som ett medel för kommunikationen mellan utnyttjas av både eukaryota och prokaryota celler. Men på grund av sin ringa storlek, nuvarande protokoll för isolering av elbilar är ofta tidskrävande, besvärlig, och kräver stora volymer prov och dyr utrustning, till exempel en ultracentrifug. För att lösa dessa begränsningar, utvecklade vi en pappersbaserad immunoaffinitets plattform för att separera undergrupper av elbilar som är enkelt, effektivt och kräver provvolymer så låga som 10 pl. Biologiska prover kan pipetteras direkt på papperstestzoner som har modifierats kemiskt med infångningsmolekyler som har hög affinitet till specifika EV ytmarkörer. Vi validera analysen genom användning av svepelektronmikroskop (SEM), pappersbaserad enzymkopplad immunosorbent analyser (P-ELISA) och transkriptomanalys. Dessa pappersbaserade enheter kommer att möjliggöra studier av elbilar i kliniken och inställningen forskning för att hjälpa öka vår förståelse av EV funktioner i hälsa och sjukdom.
Protocol
Ett allmänt schema över operationen förfarandet ges i figur 1. Med hjälp av etiska metoder, samlade vi blodprover från friska personer, och fick kammarvatten prover från patienter genom Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan enligt IRK godkända protokoll ( IRB TCVGH No. CF11213-1).
1. Tillverkning av papper Devices
- Skär kromatografi papper i cirklar av 5 mm i diameter för att ge samma layout som en 96-brunnsmikrotiterplatta. Sandwich dessa pappers bitar med två polystyren ark med registrerat genomgående hål, och laminat.
- Ändra pappers enheter med kemisk konjugering metod som beskrivs i följande steg 28.
- Behandla pappers enheter med syreplasma (100 mW, 1% syre, 30 sek) i en plasmakammare.
VARNING: Särskild försiktighet bör beaktas när man arbetar med 3-merkaptopropyl trimetoxisilan och N -γ-maleimidobutyryloxy succinimidester (GMBS), eftersom de är både fuktkänsliga och giftigt. Bär skyddshandskar och undvik inandning eller kontakt med hud och ögon. Håll beståndet flaskan väl tillsluten och låt det utjämna till RT innan du öppnar för att undvika kondens. Alternativt öppnar förrådsflaskan inuti en kvävefylld handskpåse eller låda. Alikvotera i små flaskor för att undvika frekvent öppnande av beståndet flaskan. - Omedelbart inkubera behandlat papper anordningar i en 4% (volym / volym) lösning av 3-merkaptopropyl-trimetoxisilan i etanol (200 proof) i 30 min.
- Skölj pappersanordningar med etanol och inkubera dem med 0,01 umol / ml GMBS i etanol under 15 min.
- Skölj med etanol (200 proof) och inkubera pappersanordningar med 10 | ig / ml avidin lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 1 h vid 4 ° C. Förvaras vid 4 ° C om det behövs, och använd inom 4 veckor.
- Behandla pappers enheter med syreplasma (100 mW, 1% syre, 30 sek) i en plasmakammare.
- Blöt varje pappersprovningszoner med 10 pl PBS innehållande 1% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) För 3 × 10 min före observation 10 | il biotinylerad infångningsmolekyler för 3 × 10 min. Använda anti-CD63-antikropp (20 pg / ml i PBS innehållande 1% (vikt / volym) BSA och 0,09% (vikt / volym) natriumazid) eller annexin V (1:20, vol / vol i annexin V bindningsbuffert) som infångningsmolekyler.
- Skölj av obundna anti-CD63-antikropp eller annexin V-molekyler med användning 10 pl motsvarande PBS innehållande 1% (vikt / volym) BSA eller annexin V bindande buffertlösningar för 3 × 1 min.
2. Serum och kammarvatten Provtagning och behandling
- Serum samling.
- Samla 10 ml perifert blod genom venpunktion i serumseparationsrören och vänd försiktigt röret fem gånger. Ställ röret i vertikalt läge och vänta 30 min.
- Centrifugera vid 1200 x g under 15 min. Överför serumet från toppskiktet till ett rent rör och centrifugera igen vid 3000 x g under 30 minuter.
- Passera supernatanten genom ett 0,8 um filTer. Håll provet vid -80 ° C fram till användning.
- Kammarvatten samling: samla kammarvatten prover från patienter som diagnostiserats med en ögonläkare direkt genom invasiva procedurer och butiksprover vid -80 ° C fram till användning.
3. Isolering av extracellulär Blåsor
- Spot prover på varje pappers testzon med en hastighet av 5 ml / min.
- Skölj av obundna elbilar med 10 | il motsvarande PBS innehållande 1% (vikt / volym) BSA eller annexin V bindande buffertlösningar för 3 × 1 min för pappersanordningar funktionaliserats med anti-CD63-antikropp eller annexin V-molekyler, respektive. Utför följande analyser nedströms.
4. Nedströms analys Exempel 1: Skannings Electromicrographs
- Fix elbilar fångat på funktion papper testzon använder 10 pl 0,5 × Karnovsky fixativ i 10 min.
- Skölj proverna med gott PBS för 2 × 5 min.
- Torka utprover med efterföljande 35% etanol under 10 minuter, 50% etanol under 2 x 10 min, 70% etanol under 2 x 10 min, 95% etanol under 2 x 10 min och 100% etanol under 4 x 10 min.
- Kritisk torr och spotta päls proverna med palladium / guld, och undersöka med hjälp av en svepelektronmikroskop som drivs vid låg elektronaccelerationsspänning (~ 5 kV).
5. Nedströms Assay Exempel 2: Pappersbaserade ELISA
- Lägg en 5 pl lösning innehållande anti-CD9 primär antikropp vid 1: 1000 utspädning i PBS till varje testzonen innehåller fångade elbilar. Vänta en minut.
- Skölj proverna med 30 ml PBS skakas vid 100 rpm under 30 sek.
- Lägg en 5 pl lösning innehållande pepparrotsperoxidas (HRP) -länkade sekundär antikropp vid en: 1000 spädning i PBS och vänta en minut.
- Skölj proverna med 30 ml PBS skakas vid 100 rpm under 30 sek.
- Lägg en 5 pl kolorimetriskt substrat innehållande ett: 1 volymförhållande av väteperoxid end 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) och skanna med en bordsskanner.
6. Nedströms Analys Exempel 3: RNA Isolering
- Sänk proverna i 35 pl polyvinylpyrrolidon baserad RNA isolering stöd och 265 pl lys / bindningsbuffert för att lysera elbilar tagna. Skaka kraftigt.
- Lägg 30 l homogenatet tillhandahålls i isoleringssatsen till lysatet. Skaka kraftigt och sätta på is i 10 min.
- Utdrag RNA användning av syra fenol-kloroform separation beskrivs i de följande stegen.
- Ta 330 pl fenolkloroform från bottenskiktet av flaskan och lägg till homogenatet / lysatet. Skaka kraftigt.
- Centrifugera vid 10000 xg under 5 minuter. Överför vatten (övre) fasen till ett rent rör och notera volymen avlägsnas.
- Fällning totalt RNA med 100% etanol av den volym som är 1,25 gånger volymen av den vattenhaltiga fasen avlägsnades i föregående steg och collect RNA i elueringslösningen förvärmd till 95 ° C.
- Koncentrera och ytterligare rena RNA med användning av en RNA-rensning kit enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan hos pappersanordningen för att isolera undergrupper av elfordon förlitar effektivt på dess känsliga och specifika erkännandet av EV ytmarkörer. Den stabila modifieringen av pappersfibrer med infångningsmolekyler uppnås med användning av avidin-biotin-kemi såsom beskrivits på annat ställe 28-30. Effektiviteten av kemisk konjugering och den för fysisorption metod bedöms med användning av fluorescensbaserade avläsningar. De papperstestzoner bereds efter protokoll steg 1) med undantag infångningsmolekylen ersätts med 20 mikrogram / ml fluorofor R-fykoerytrinkonjugerade biotinmolekyler (PE-biotin) i steg 1.3. De papperstestzoner sköljs sedan med PBS för att avlägsna obundna PE-biotin molekyler. I motsats härtill 10 | il 20 | ig / ml PE-biotin i PBS innehållande 1% (vikt / volym) BSA och 0,09% (vikt / volym) natriumazid är direkt fläckvis på papperstestzonen för 3 x 10 min, följt av PBS Skölj för att genomföra fysisorption av PE-biotin färgämnesmolekyler. Kemisktmodifierade pappersheter ("papper + tvärbindare + dye") tillsammans med obearbetade pappersheter ("papper"), pappers enheter modifierade med samma protokoll utan tillämpning av PE-biotin molekyler ("papper + tvärbindare") och pappers enheter med physisorbed PE-biotinmolekyler ("physisorbed-dye") skannas med hjälp av en bild-registreringssystem inställd på 540-560 nm excitation, 575 nm-lång-pass utsläpp, och data sparas i form av 16-bitars filer och analyseras med ImageJ programvara. Såsom visas i fig 2A, är fluorescensintensiteten hos testzonerna framställda genom kemisk konjugering metoden väsentligt högre, i jämförelse med fysiskt belagda papperstestzoner (p-värde <0,0005, n = 5, T-test). Upptagning av elbilar är också specifik som exemplifieras i figur 2B, C, där få elbilar behålls på pappers enheten när infångningsmolekylerna ersätts av PBS-lösning.
Elbilar är heterogena i sizes, specifika innehåll och biogenes vägar. För att binda dem, pappers enheter belagda med två olika EV infångningsmolekyler, anti-CD63-antikroppar och annexin V, framställdes. CD63, en medlem av tetraspanin familjen (som inkluderar CD9, CD63, CD81 och CD82-molekyler) anrikas på EV-membran 31, och annexin V har en stark affinitet för fosfatidylserin (PS) 32,33. Man har funnit att elbilar släpps konstitutivt under tidig apoptos eller under stressförhållanden, där processen normal cell fosfolipid asymmetri förloras, vilket leder till ökad exponering av PS på den yttre bipacksedel för EV-membran. Analyser av SEM-bilder visar att de storleksfördelningar av CD63 + elfordon och PS + EVs är olika, med medeldiametrar av 80 och 43 nm, respektive (Figur 3) .Den två-tailed Students t-test används för att bestämma den statistiska p-värdet (p-värde <0,0001). Överraskande, CD63 + elbilar verkar rundare och större än PS + elbilar i genomsnitt, vilket biologiskbetydelse ännu inte är utredd.
RNA från elfordon infångade på pappersanordningen kan extraheras. Analyser med bioanalyzer visade liknande övergripande profiler för total RNA extraherade från CD63 + och PS + elbilar (Figur 4A). Jämfört med de mängder RNA extraherade med hjälp av mikroflödes och ultracentrifugeringsteknik, respektive cirka två gånger och 39 gånger fler RNA per volymenhet serumprov extraherades utnyttjar pappersanordningen, om än med hjälp av en mindre provvolym (tabell 1). P-ELISA kan utföras för detektering av elbilar. Anti-CD9 primär antikropp och HRP-konjugerad sekundär antikropp användes i denna studie. Figur 4B visar gråvärdesförändringar produceras av den enzymatiska reaktionen av HRP för pappers anordningar som tillämpas med 10 pl PBS, 50% serum (spädda med PBS), eller 100 % serum, respektive. Den grå värde ökar linjärt inom intervallet serumprov testas.
till exempel, ultracentrifuge, skall användas. Elfordon från patientens kammarvatten prover isolerade med pappersanordningar täckta med anti-CD63-antikroppar kan ses i SEM-bilder som visade i fig 5.
Figur 1. tillverkning och funktion som förfarandet för pappersbaserade analyser som syftar till isolering och karakterisering av extracellulära vesiklar. (A) Filtrerpapper skärs till önskad form och laminerade. (B) Den yta av papperet är modifierad med en kort behandling av syreplasma och omsattes med 3-merkaptopropyl-trimetoxisilan, N </ Em> -γ-maleimidobutyryloxy succinimidester och neutravidin, i den ordningen. Biotinylerade infångningsmolekyler, t.ex., antikroppar, kan sedan immobiliseras via den starka affiniteten mellan biotin och neutravidin molekyler. (C) Biosamples kan vara pipett på funktionpappersanordningen. Cellulära blåsor kan isoleras. (D) Nedströms analyser, såsom SEM, transkriptom, och ELISA (visas), kan utföras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cellulära vesiklar (EVS) kan fångas på funktionpappers enheter med god specificitet och sensitivitet. (A) Fluorescensmärkta biotinmolekyler är mycket immobiliserade på papperetenhet via kemisk konjugering process ("papper + tvärbindare + färgämne") i motsats till fysisk adsorption ("physisorbed-dye"). Obearbetade papper ("papper") och konjugation molekyler ("papper + tvärbindande") bidrar lite till fluorescensintensiteten. (B) En representant SEM-bild visar några elbilar fångas på pappersanordningen ospecifikt när infångningsmolekylerna ersätts av PBS innehållande 1% (vikt / volym) BSA. (C) Många elbilar behålls pappers enheter belagda med anti-CD63-antikroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Undergrupper av extracellulära vesiklar (EVS) kan ha olika storleksfördelningar. (A)och (B) är representativa SEM bilder av elbilar tagna på pappers enheter belagda med anti-CD63-antikroppar och annexin V molekyler, respektive. (C) CD63 + elbilar verkar större än PS + elbilar under experimentella betingelser som används i denna studie (p-värde <0,0001, n = 124 och 203, T-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Nedströms transkriptom och ELISA-analyser. (A) Bioanalyzer data som visar intensitet (y-axeln, i godtyckliga enheter) och storlek (x-axeln, i nukleotider (nt)) fördelningar av fluorescensmärkt total-RNA extraherade från elbilar infångade på anti-CD63 antikropps eller annexin V-belagd filterpapper. Den vandrande toppen vid ~ 25 nt representerar en inre standard. (B) Grey värdeförändringar som produceras av den enzymatiska reaktionen pepparrot (HRP) i P-ELISA-analys för pappers enheter appliceras med 10 pl prover av PBS, 50% serum (utspätt med PBS) och 100% serumprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Cellulära vesiklar (EVS) i kammarvatten prover kan fångas på funktionfilterpapper utan prov pooling. SEM bilder av isolerade CD63 + EVs i kammarvatten prover från patienter med (A) åldersrelaterad makuladegeneration, (B) diabetisk macular ödem, och (C) polypoidal koroidal vaskulopati, respektive.belastning / 52722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| isoleringsmetoden | infångningsmolekylen | serum vol. (Il) | genomsnittliga RNA extraherat (ng) | genomsnittliga extraherade RNA / serum (Pg / il) | förhållandet mellan genomsnittlig RNA / serum | ref |
| mikrofluidikanordning | anti-human CD63 | 400 | 4,14 | 10,4 | 20 | 20 |
| pappersanordning | anti-human CD63 | 72 | 1,49 ± 0,08 | 20,7 | 39 | 22 |
| pappersanordning | annexin V | 72 | 0,99 ± 0,26 | 13,8 | 26 | 22 |
| ultracentrifugering | - | 2000 | 1,06 ± 0,64 | 0,53 | 1 | |
| serum | - | 72 | 1,23 ± 0,58 | 17 | 32 | 22 |
Tabell 1. Totalt RNA extraherat från serumprover från friska frivilliga försökspersoner analyserats med en bioanalyzer (n = 4 för alla förhållanden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik isolering av subgrupper av extracellulära blåsor är: 1) ett bra val av papper; 2) stabil och hög täckning av infångningsmolekyler på ytan av pappersfibrer; 3) korrekt hantering av prover; och 4) allmän laboratoriehygien.
Porösa material har utnyttjats i många billiga och utrustningsfria analyser. De kan ha avstämbar porstorlek, mångsidig funktionalitet, låg kostnad och hög yta-till-volymförhållande medger passiv uppsugning av fluider. Vi valde kromatografi cellulosapapper grad 1 främst för dess rätta porstorlek och låg protein adsorption. Jämfört med annan vanligen använda porösa material, nitrocellulosa, har cellulosapapper mycket lägre ospecifik proteinadsorption 34. Vi finner också lite ospecifik infångning av elbilar i denna studie. Dessutom är dess partikelkvarhållande nivå, 11 | im, större än storleken på EO 35, vilket möjliggör för specifik infångning ikontrast till fysisk fångst av elbilar. Här fokuserar vi på elbilar med en mindre storlek genom att serumprover genom ett 0,8 m filter, vilket steg kan modifieras när större elbilar ska studeras.
Kemisk ytmodifiering kan vara en nyckel för att uppnå en stabil och hög täckning infångningsmolekyler på ytan som ett sätt att förbättra effektiviteten i EV isolering. Ytmodifieringar av cellulosa har granskats 36,37. Det finns ett stort antal hydroxyl- (-OH) grupper på ytan av cellulosa och de kan reagera med silan för att ge stabila kemiska Si-OC bindningar Sedan den aktiverats med syreplasma eller annan kondensationsprocessen. Den silan som användes i denna studie är (3-merkaptopropyl) trimetoxisilan, (MeO) 3 Si- (CH2) 3 -SH. Den tiol (-SH) grupp kan reagera med GMBS att tillhandahålla en kort arm (0,73 nm) och en tvärbindningsgrupp som par med primära aminer. Capture molekyler med amingrupper kan konjugerasatt GMBS direkt. I denna studie, dock konjugerat vi neutravidin stället för att ge ett generellt system för att böja olika fånga molekyler som är biotin-märkta. Men konsensus om EV subtyp specifika markörer har ännu inte nått 17. Neutravidin har en mycket stark affinitet till biotin och en nära-neutrala isoelektriska punkten (pH 6,3), vilket minimerar ospecifika interaktioner med negativt laddade föremål, exempelvis ytan av elfordon. Däremot avidin med en isoelektrisk punkt av 10,5 uppbär positiva laddningar vid neutralt pH. En högre koncentration av anti-CD63-antikropp används än den i et al. Chen 20, främst på grund av den lilla volymen tillämpas och den större yta-till-volymförhållande på pappersanordning. Men mängden och kompositioner av proteiner adsorberade på pappersfibrerna har inte karakteriserats, kan som vara provberoende. Därför måste man vara försiktig när man tolkar resultaten av proteinanalys.
Insamlade bigiska prover ska hanteras varsamt och bearbetas snabbt för att förhindra artifactually ökade EV nivåer. Det rekommenderas att avlägsna celler och blodplättar, om några, före lagring vid -80 ° C. En aktuell standardisering av provhantering i EV forskningen kan hittas i denna översyn 17.
Korrekt laboratoriehygien bör användas. Använd alltid handskar och förändrings handskar ofta för att minimera införandet av dammpartiklar och ribonukleaser. Isolering av RNA från elfordon i cellodling konditionerade medier kan ge mer än 70 gånger högre koncentrationer med pappersanordningar jämfört med den som extraheras från elfordon koncentrerades med användning ultracentrifugen metoden (opublicerad).
Protokollet som beskrivs häri använder cellulosapapper enheter modifierade kemiskt med infångningsmolekyler för att isolera olika subgrupper av elbilar. Metoden är enkel, effektiv och särskilt värdefullt när prowolymen är begränsad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av Taiwan National Science Council grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) och NSC 101-2628-E-007-011-My3 (CMC), och Veterans General Sjukhus och universitet System of Taiwan Joint Research Program (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatography Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Grade 1 cellulose paper |
| (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane | Sigma Aldrich | 175617 | This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | Absolute, 200 Proof, molecular biology grade |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Often referred to as Cohn fraction V. |
| N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive. |
| Avidin | Pierce Biotechnology | 31000 | NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin |
| Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 | Ancell | 215-030 | clone AHN16.1/46-4-5 |
| biotinylated annexin V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS) |
| Primary anti-CD9 and secondary antibody | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated |
| Serum separation tubes | BD Biosciences | 367991 | Clot activator and gel for serum separation |
| Annexin V binding buffer | BD Biosciences | 556454 | 10x; dilute to 1x prior to use. |
| TMB substrate reagent set | BD Biosciences | 555214 | The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA isolation kit | Life Technologies | AM1560 | MirVana RNA isolation kit |
| Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid | Life Technologies | AM9690 | Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides. |
| RNA cleanup kit | Qiagen Inc. | 74004 | MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA. |
| Plasma chamber | March Instruments | PX-250 | |
| Scanning electron microscope | Hitachi Ltd. | S-4300 | |
| Desktop scanner | Hewlett-Packard Company | Photosmart B110 | 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used. |
| Image-record system | J&H Technology Co | GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used. |
References
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
- Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
- Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
- Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
- Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
- Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
- Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
- Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
- Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
- Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
- Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
- Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
- Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
- Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
- Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
- Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
- Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
- Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
- Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
- Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
- Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
- Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
