Abstract
La sintesi proteica è un processo fondamentale per l'espressione genica impattare diversi processi biologici particolare adattamento alle condizioni ambientali. La fase di inizio, che prevede il montaggio delle subunità ribosomali del mRNA codone di iniziazione, iniziazione fattore coinvolto compreso eIF4G1. Difetti di questo fattore limitante della traduzione sono legate a disturbi diversi. Per studiare le possibili conseguenze di tali liberalizzazioni, Xenopus laevis oociti costituiscono un modello attraente con un alto grado di conservazione dei meccanismi cellulari e molecolari essenziali con umana. Inoltre, durante la maturazione meiotica, ovociti vengono trascrizionalmente repressi e tutte le proteine necessarie sono stati tradotti dal preesistenti, mRNA di origine materna. Questo modello economico consente di mRNA esogena di diventare perfettamente integrati con una traduzione efficace. Qui viene descritto un protocollo per valutare traduzione con un fattore di interesse (qui eIF4G1) utilizzando storcato mRNA materno che sono il primo ad essere poliadenilato e tradotti durante la maturazione degli ovociti come una lettura fisiologico. In un primo momento, mRNA sintetizzato mediante trascrizione in vitro di plasmidi di interesse (qui eIF4G1) vengono iniettati in ovociti e cinetica di maturazione degli ovociti di rilevamento Ripartizione Germinal Vesicle è determinata. Il target mRNA materno studiato è la serina / treonina mos-proteina-chinasi. La sua poliadenilazione e la sua successiva traduzione sono studiati insieme con l'espressione e la fosforilazione delle proteine dei mos segnalazione cascata coinvolti nella maturazione degli ovociti. Variazioni del protocollo corrente a presentare difetti traslazionali sono proposti anche per sottolineare la sua applicabilità generale. Alla luce delle prove che aberrante la sintesi proteica può essere coinvolto nella patogenesi di disordini neurologici emergenti, tale modello offre l'opportunità di valutare facilmente questo deterioramento e identificare nuovi bersagli.
Introduction
Le proteine sono elementi essenziali della vita cellulare, e quindi a più ampia scala dell'organismo. Essi assicurano la maggior parte delle funzioni cellulari tra cui struttura, il trasporto, la reazione di catalisi, regolazione, ecc genica La loro espressione è il risultato di un complesso meccanismo di traduzione che consente la conversione di un mRNA in proteine. La traduzione viene sottoposta a diversi controlli di adattarsi e di regolare l'espressione genica secondo le esigenze cellulari, durante lo sviluppo e differenziamento, invecchiamento, stress fisiologici o manifestazioni patologiche.
Traduzione è diviso in 3 fasi (inizio, allungamento e terminazione) e presenta 3 sistemi di traduzione iniziazione al fine di rispondere a queste esigenze: cap-dipendente, cap-indipendenti con interno ribosoma Entry Segment (IRES) strutture ed esaltatori di traduzione cap-indipendente ( CITE).
La maggior parte dei mRNA eucarioti sono tradotti in un cap-Dependent modo tramite il 7-methylguanosine cap 5'-trifosfato, che serve come una funzione di riconoscimento durante la sintesi proteica. Questo cappuccio si lega a eIF4E, un componente del complesso eIF4F con eIF4G1 e eIF4A. Associato con altri partner come poli (A) binding protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, questi fattori inizio della traduzione permette di circularize mRNA e migliorarne l'accessibilità a forme 43S complesso fino a quando l'inizio codone AUG riconoscimento 1. Questo evento corrisponde alla fine del cioè inizio della traduzione, il primo passo della traduzione.
Traduzione Cap-indipendente è utilizzato da codifica mRNA per proteine essenziali in condizioni di stress che inducono per la proliferazione cellulare e l'apoptosi esempio. Questo meccanismo coinvolge strutture secondarie in mRNA 5'regione non tradotta (UTR) chiamato IRES, l'estremità carbossi-terminale di eIF4G1 associata con eIF4A e il complesso 43S. Il legame di questo 43S di pre-apertura complex all'IRES inizia il tappo traduzione indipendente senza la necessità di fattore eIF4E 2,3.
Infine, un altro meccanismo di traduzione ancora non ben compreso supporta questa attività di traduzione cap-indipendente in condizioni di stress attraverso CITE strutture situate all'interno mRNA UTR 4.
Attraverso queste diverse modalità di traduzione diverso da loro passi di iniziazione, la traduzione gioca un ruolo fondamentale nella omeostasi cellulare e qualsiasi modifica di uno di questi processi sarebbe quindi un impatto l'organismo con piccole e gli effetti su larga scala. In effetti, l'avvio è un fattore limitante che disciplina i processi di traduzione corretta di mRNA in proteine ed è quindi l'obiettivo di numerosi controlli e punti di regolazione 5. Sia che si tratti per quest'ultimo o per i componenti di questi processi, se si risulta essere difettoso, sarà perturbare l'equilibrio stabilito nella cella e quindi potrebbe portare a Condi patologicazioni. In questo contesto, le mutazioni in fattori di traduzione sono stati coinvolti in diverse patologie, tra cui malattie neurodegenerative come `leucoencefalopatia con vanishing bianco matter' (eIF2B1-5 subunità) 6, nella sindrome di Walcott-Rallison (gene che codifica per EIF2AK3 PERK) 7, potenzialmente in malattia (eIF4G1 p.R1205H) di Parkinson 8. E 'quindi importante per condurre studi cellulari e molecolari di queste proteine mutanti di aumentare le nostre conoscenze sullo sviluppo della malattia e sul processo generale di inizio della traduzione.
Per eseguire questi studi, è fondamentale scegliere i modelli più adeguati per osservare le conseguenze di queste mutazioni Xenopus laevis oociti sono particolarmente adatti per le loro proprietà fisiologiche e biochimiche. Sincronicità fisiologica (bloccato in fase G2 del ciclo cellulare) , elevata capacità di sintesi proteica (200-400 ng / giorno / ovocita), elevato numero di OOC estrattoytes da uno stesso animale (800-1000 ovociti / femmina) e la dimensione della cella (1,2-1,4 mm di diametro) che facilita la loro manipolazione. Microiniezione degli ovociti di Xenopus con sintetizzato mRNA può essere facilmente eseguita per sezionare passi di traduzione. In questa vista si presenta altri vantaggi. Data la velocità di progressione meiosi e della traduzione dell'mRNA dopo microiniezione (~ 24 ore), Xenopus ovociti rappresenta un sistema veloce rispetto ai sistemi ricostituiti cellulari (estratti da E.coli, germi di grano o di coniglio reticolociti ...) in cui un mRNA è tradotto con un tasso di traduzione ridotta e ad una velocità inferiore. Quindi, gli effetti di una mutazione introdotta in un mRNA saranno rapidamente e facilmente osservabile studiato in molti ovociti. Un altro vantaggio di ovociti di Xenopus è che mRNA materni sono latenti e la traduzione delle proteine è bloccato prima della stimolazione progesterone. L'aggiunta di progesterone è quindi un buon mezzo per controllare l'induzione di traduzione. Citoplasmatica polyadenylation non si verifica durante l'oogenesi. Inizia la maturazione degli ovociti in durante ovociti progesterone stimolata in un ordine temporale e continua durante tutto lo sviluppo precoce e potrebbe essere utilizzato per studiare le diverse fasi della traduzione.
La poliadenilazione di mos mRNA è tra i primi a verificarsi e appartiene con Aurora A / Eg2, istoni-Like B4 mRNA alla classe dei geni "di maturazione precoce" come definite nel Charlesworth et al. (2004) 9. L'induzione di traslazione dell'mRNA "tardive", come ciclina A1 e ciclina B1 si verifica intorno al momento della ripartizione vescicola germinale (GVBD). Mos mRNA codifica per una chinasi serina / treonina-proteine. La sua traduzione è di fondamentale importanza in quanto induce la chinasi MAP cascata che attiva indirettamente la maturazione dell'ovocita. Infatti, in risposta al progesterone, poliadenilazione di mRNA mos è migliorata tramite un processo che coinvolge Aurora A / Eg2 proteine regolatrici e di altre proteine di legame con RNA the 3'UTR di mRNA mos. Questo aumento di poliadenilazione mos mRNA porta ad un aumento del livello di proteina MOS, che a sua volta attiva MEK1. Questo processo media l'attivazione della chinasi di segnalazione regolata extracellulare 2 (ERK2) (Figura 1). Questa cascata di segnalazione può quindi innescare la maturazione fase M promuovere fattori, un complesso formato da ciclina B e Cdc2 chinasi, e alla fine si traduce in ripresa meiotica.
Quindi in Xenopus laevis ovociti, lo studio di mRNA materni quali mesi potrebbe facilmente essere usato per testare la loro traducibilità con diversi endpoint dal loro poliadenilazione efficiente alla traduzione di alcuni mesi di segnalazione componenti, tra cui anche la determinazione del tasso GVBD. Questo sistema è quindi interessante valutare le prime conseguenze delle mutazioni dei fattori di inizio della traduzione senza interferenze di recente trascritto mRNA o di efficienza di trasfezione, i problemi spesso si verificano con eukarystudi sulle cellule otic.
Qui, un protocollo si stabilisce dove mRNA eIF4G1 mutanti sono microiniettati in Xenopus laevis ovociti e la traduzione di mRNA materno è testato. In presenza di un difetto nel GVBD progressione, mos mRNA poliadenilazione che è essenziale per la progressione attraverso il ciclo cellulare meiotica ovocita e per la successiva traduzione di mRNA precoci e tardivi classe è accertata. La fosforilazione Aurora A / Eg2 e ERK è anche studiato per confermare la conseguenza di mos deregulation.Thus, ovociti di Xenopus rappresentano un modo semplice per analizzare diverse fasi di traduzione dell'mRNA.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti Xenopus allo stabulario del Lille 1 Università secondo le regole degli orientamenti del Consiglio della Comunità europea (86/609 / CEE) per la sperimentazione degli animali da laboratorio. Il protocollo di origine animale è stato approvato dal comitato istituzionale di revisione locale (Comité d'Ethique en Sperimentazione animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).
1. Gestione degli ovociti
- Preparare la soluzione di anestetico: sciogliere 1 g di tricaine metansolfonato polvere in un 1 L di acqua sterile.
- Plunge femminile Xenopus laevis in questa soluzione, coprire il bicchiere per evitare la fuga e attendere circa 45 minuti per l'animale di essere completamente sedato (senza alcuna reazione a un pizzico gamba).
- Lavare la rana con sapone e risciacquare con acqua corrente poi posto l'animale sul dorso su un foglio di alluminio pulito.
- Fissare la pelle della parte laterale dell'addome ea livello ovaie con una pinza.Effettuare un'incisione di circa 1 cm con le forbici puliti prima di utilizzarlo con etanolo al 70%. Assicurarsi che la sezione è abbastanza profonda e per raggiungere la parete addominale sottostante per permettere l'asportazione del tessuto ovarico in cui si trovano diversi ovociti in varie fasi di sviluppo.
- Sezionare i lobi ovaio, lavarli 4 volte in una capsula di Petri (50 mm) con ND96 media (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES a pH 7,4 con NaOH, integrato con 50 ug / ml di streptomicina / penicillina, 225 mg / ml di sodio piruvato, 30 ug / ml inibitore della tripsina di soia, 1 ml / ml di tetraciclina) per rimuovere tutte le tracce di sangue e detriti.
Nota: Tetraciclina consente una conservazione ottimale e un buon recupero dopo il trattamento microiniezione. - Memorizzarli in una capsula Petri coperta sommerso nel mezzo a 14 ° C, consentendo la loro conservazione per una settimana.
- Stitch la parete addominale e la pelle con veterinario riassorbibile thread e un ago sutura (3 o 4 punti di sutura saranno necessari).
- Posto l'animale in un bicchiere d'acqua e umido, senza la pelle con acqua di rubinetto fino a quando la rana è di nuovo in movimento. Coprire il bicchiere per evitare la fuga.
- Separare con attenzione i lobi ovaio nel mezzo in gruppi da 5 a 10 ovociti tramite 2 coppie di pinze allo stereomicroscopio con un ingrandimento di 10 volte. Selezionare ovociti allo stadio VI. Essi possono essere riconosciuti: i) la loro forma e colore con un marrone polo animale pigmentato e giallo polo vegetativo separati da una fascia chiara ii) la loro dimensione superiore a 1,2 mm di diametro 10.
- Incubare le ovociti selezionati in una soluzione di collagenasi (1 mg / ml di collagenasi A da Clostridium histolyticum, disciolto in ND96 senza tetraciclina) in una capsula di Petri sotto blanda agitazione durante 45 min per facilitare il defolliculation ovocita (collagenasi digerisce connessioni delle cellule follicolari ovociti /). Lavare la oociti 3 o 4 volte con ND96 medio mantenuti a 14° C.
Nota: Non incubare gli ovociti meno o più di 45 minuti a causa del rischio di distruggere proteine di superficie dell'ovocita e di provocare scarsa redditività. Trattamento Collagenase può indurre GVBD spontanea. - Incubare ovociti nel medio per 3-4 ore. Rimuovere le cellule follicolari con una pinzetta sottile sotto lente di ingrandimento binoculare e tenerli a 19 ° C in ND96 medio.
2. Preparazione dell'mRNA Sintesi
- Linearizzare 5 mg dei seguenti plasmidi per digestione enzimatica utilizzando Pme io enzima.
NOTA: pcDNA6.2 / V5-dest contenente un amminoacidi eIF4G1 cDNA wild type 1599 (eIF4G1-WT, NM_198241), pcDNA6.2 / V5-dest contenente un cDNA dominante negativo eIF4G1 (eIF4G1-DN) con mutazioni c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - e c.2126T> G nella regione di interazione tra eIF4G1 e eIF4E alla posizione 612 al 618 della corrispondente proteina disturbare la interazione betweit eIF4G1 e eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP contenente cloramfenicolo acetil transferasi (GFP). Preparare 2 miscele per ciascuno dei 3 plasmidi: il primo compreso Pme I enzima e il secondo senza enzima come controllo. - Precipitare plasmide DNA utilizzando una procedura di etanolo classica e risospendere in 20 ml di H priva di nucleasi 2 O.
- Determinare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro. La concentrazione deve essere superiore a 150 ng / ml per trascrivere cRNA.
- Eseguire 1 ml di campioni e loro controlli con 5 ml di tampone di caricamento su un gel di agarosio 0,8% per verificare la linearizzazione plasmide.
- Utilizzare un kit per la trascrizione in vitro e cRNA purificazione secondo le istruzioni del produttore. I cRNA trascritte sono risospese in 20 ml di H priva di nucleasi 2 O. I campioni possono essere conservati a -80 ° C, se necessario.
- Preparare il tampone di migrazione MOPS 10X contenente 0,2 M MOPS (pH 7.0), 20 mM acetato di sodio e 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterilizzare soluzione con un filtro da 0,45 micron. Rifornire la soluzione al riparo dalla luce a temperatura ambiente per evitare l'ossidazione soluzione.
- Pulire la vasca di elettroforesi successivamente con NaOH, HCl e accuratamente sciacquati con acqua doppio-filtrata per un O / N per evitare RNasi e prevenire la degradazione dell'RNA.
- Cast un gel di agarosio 1,5% contenente MOPS e formaldeide. Caldo fino a completa dissoluzione agarosio e lasciarlo raffreddare a 55 ° C. Sotto cappa, aggiungere 0,1 volume di MOPS 10X, 6,6% di formaldeide e 4 mg di bromuro di etidio (10 mg / ml). Versare il gel sotto la cappa e aspettare circa 1 ora per il gel per indurire.
Nota: La formaldeide e il bromuro di etidio sono tossici. - Preparare i campioni per la migrazione in un tubo di 0,2 ml di 1 ml di cRNA, 8,8% di formaldeide, il 60% di formammide e 0,1 volume di MOPS 10X. Incubare per 3 min a 70 ° C e mettere i tubi in ghiaccio per 10 min. Centrifugare i campioni pochi secondi a5.000 x g. Aggiungere 2 ml di tampone di caricamento del gel.
Nota: Formammide è tossico. - Eseguire i campioni per 20 minuti a 90V. Immergere il gel in libera-nucleasi H 2 OO / N per Decolorare il gel prima di analizzarla per verificare la qualità cRNA.
- Determinare la concentrazione cRNA utilizzando uno spettrofotometro e conservarli a -80 ° C.
3. Microiniezione di sintesi di RNA e ovociti Maturazione Stimolazione
- Preparare le attrezzature necessarie per ovociti microiniezione. Utilizzare un estrattore micropipetta per tirare piccolo capillare di vetro. Sotto stereomicroscopio, rompere l'estremità del capillare con la pinzetta per creare una punta smussata. Riempire la micropipetta capillare con olio minerale con una siringa da 1 ml con un filtro Millipore 0,45 micron all'estremità opposta. Montare la micropipetta sul pipetta microiniezione. Scegli una micropipetta preciso calibrato dal fabbricante per dare una buona precisione se usato con appropriata capillare di vetro.
- Eseguire microiniezione 1-2 ore dopo defolliculation, tempo necessario per il recupero degli ovociti su ovociti mantenuta a 14 ° C. Utilizzare piatti di Petri con il fondo raschiato con una pinza per creare una superficie adesiva per ovociti e riempirli con ND96 media.
- Disporre ovociti lungo una corsia raschiato in una capsula di Petri permettendo una successiva iniezione di ovociti con micropipetta capillare con un angolo di 45 ° C.
- Iniettare nella zona equatoriale ovocita, sotto l'area animale pigmentata per una diffusione ottimale dei campioni nel citoplasma. Inserire solo la parte più sottile di punta capillare su circa 150-200 micron di profondità.
- Iniettare 30 ng di cRNA ottenuti rispettivamente dai diversi plasmidi in un volume di 60 nl in una prima ovocita. Dopo l'iniezione, attendere 5-10 secondi prima di rimuovere la punta capillare per evitare la fuga del campione (Figura 2A).
Nota: non superare i 120 nl. Iniettare più lentamente possibile. Si raccomanda un controllo con acqua distillata. - Spostare manualmente la piastra di Petri per iniettare il prossimo ovocita.
Nota: Assicurarsi che la punta non sia intasato generando un piccolo impulso dalla soluzione bagno dopo 2 o 3 microiniezioni. - Trasferimento iniettato ovociti in 24 pozzetti piastre di coltura (10 ovociti / pozzetto) riempito con 3 ml di fresco medio ND96 e lasciarli a 19 ° C.
- Incubare gli ovociti in ND96 con progesterone (PG) (2 mg / ml) per indurre la maturazione meiotica (GVBD) a 19 ° C, 15 ore o 4 ore dopo la microiniezione di CRNAs poliadenilato ottenuti rispettivamente da pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 e pcDNA6 .2 / C-EmGFP usato come controllo (Figura 2A).
Nota: Co-iniezione di marcatore fluorescente con il cRNA è uno strumento piacevole di assicurare che il cRNA è stato iniettato e rimase nell'oocita. Effettuare tali esperimenti preliminari con un cRNA di interesse con un tag GFP. - Microinject come in # 3.5 diversi rapporti (1: 3, 2: 2, 3: 1) di poliadenilato eIF4G1-WT e eIF4G1-DN CRNAs per TEst l'effetto cambio di CRNAs eIF4G1-WT sul fenotipo mutante (Figura 2D).
4. Germinal Vesicle Ripartizione Determinazione
- Contare il numero di ovociti maturi dopo la stimolazione PG osservando la presenza di una macchia bianca al polo animale nero con uno stereomicroscopio. Ripetere l'contando ogni ora fino alla ventiquattresima ora (Figura 2B, 2C).
5. Western Blot (WB) Analisi
- Omogeneizzare il gruppo di 10 oociti mediante movimenti avanti e indietro con una punta micropipetta, a 4 ° C in 200 microlitri nel seguente buffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, NaCl 500 mM, 0,05% SDS, 5 mM MgCl 2, 1 mg / ml di albumina di siero bovino, 10 mg / ml leupeptina, 10 mg / ml aprotinina, 10 mg / ml inibitore di tripsina di soia, 10 mg / ml benzamidine, 1 mM PMSF, 1 mM vanadato di sodio.
- Campioni di centrifugazione per 15 min a 10.000 xg per rimuovere il lipide (fase superiore) e la membrana (fase inferiore) fractions. Raccogliere la frazione citoplasmatica, memorizzare un'aliquota di determinare la concentrazione di proteine e completare la restante con Laemmli o un tampone Bis-Tris (1: 1).
Nota: gel Bis-Tris e tampone di caricamento hanno un pH più neutro che protegge proteine dall'idrolisi - Riscaldare 20 mg di campione a 95 ° C per 10 min. Caricare ciascun campione nei pozzetti del gel di acrilammide. Porre il gel in un serbatoio con tampone appropriato.
- Eseguire un elettroforesi per 1 ora a 200 V.
- Realizzare un WB in TBS pH 8,0 (Tris HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, contenente il 10% di albumina sierica bovina) con una capra anti-Aurora A / Eg2 (1: 3.000, 2 ore) o con un anticorpo di coniglio -Aurora A / Eg2-P (1: 1.000, O / N a 4 ° C), topo anti-ERK2 (1: 3.000, 2 ore), di capra anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3.000, 2 ore ), coniglio anti-mos (1: 5.000, 4 ore), coniglio anti-GFP (1: 3.000, 2 ore) antibodies.Use anticorpi murini anti-V5 (1: 10.000, 2 ore) e di coniglio anti-Rsk (1 : 1.000, 2 ore) (come controlli di carico).
- lavaggiola membrana 3 volte per 10 min in TBS-Tween e incubare 1 ora sia con un anti-mouse o anti-coniglio o anti-capra (IgM) anticorpo secondario perossidasi di rafano marcata a diluizioni di 1: 5.000, 1: 7.500 e 1 : 5.000 rispettivamente.
- Eseguire 3 lavaggi di 10 min in TBS-Tween e rilevare i complessi antigene-anticorpi con il sistema ECL rilevamento avanzato.
6. poliadenilazione Assay
- Esempio 5 ovociti per condizione in un 1,5 ml. Lavare con 1 ml di nucleasi PBS 1X (pH 7,4). Le seguenti operazioni saranno effettuate sotto cappa.
- Estrarre l'RNA utilizzando una procedura organica classica (vedi istruzioni del produttore).
- Recupero RNA mediante centrifugazione (10.000 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aria RNA asciugare per 10 minuti.
- Risospendere RNA pellet in 30 ml di H priva di nucleasi 2 O.
- Prendere 15 ml di campioni in un nuovo tubo e aggiungere 85 ml di H priva di nucleasi 2 O. Pulire lacampioni sé per migliorare la loro qualità della colonna di silice in base alle istruzioni del produttore. Eluire l'RNA con 30 ml di H priva di nucleasi 2 O
- Eseguire 1 ml di campioni con 5 ml di tampone di caricamento su un gel di agarosio 0,8% per controllare l'integrità dell'RNA.
- Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
- Preparare 2 miscele di ligasi per condizione (cioè, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN e il 2 O controllo H) con i seguenti reagenti: 10 U di RNA ligasi, 0,1 volumi di tampone 10X, 1 mM ATP, 10% di PEG8000 50% , 0.1 mg di primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 e portare il volume finale di 10 ml con H priva di nucleasi 2 O. Aggiungere nel primo RNA miscela ottenuta da ovociti senza stimolazione PG e nella seconda RNA miscela ottenuta da PG stimolato oociti.
- Incubare per 1 ora a 37 ° C e poi per 20 min a 65 ° C per inattivare l'enzima.
- NoiEA cDNA trascrizione inversa (RT) Kit. Preparare l'impasto RT, per provetta: 0,1 volume di tampone 10X RT, 0.1 mg di primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, miscela dNTP 4 mm, 50 U di trascrittasi inversa e completo di nucleasi H 2 O a volume finale di 10 ml. Aggiungere 10 ml di reazione di ligasi ottenuti in precedenza. Eseguire la RT nelle condizioni descritte dal costruttore.
- Preparare Polymerase Chain Reaction (PCR) miscela, per provetta: 0,1 volume di tampone 10X, 1,5 mM MgCl 2, 133 micron miscela dNTP, 0,2 micron specifico fondo, 0,2 micron di primer P2, 0.025 U Taq polimerasi, 1 ml di cDNA e completo di priva di nucleasi H 2 O al volume finale di 50 ml. Eseguire la PCR nelle seguenti condizioni: 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 10 min, [95 ° C per 1 min, 56 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec] * 40 cicli, 72 ° C per 10 min 9. I primer specifici sono i seguenti: mos, GB4 TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA istoni-like, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; La ciclina A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- Preparare un gel di agarosio al 3%. Aggiungere in ogni PCR prodotti 10 ml di tampone di caricamento. Eseguire il gel con 10 ml di campioni a 110 V per una migrazione ottimale. Analizzare il gel dopo 10 e 20 minuti per osservare un cambiamento di dimensione che riflette la lunghezza della coda di poli (A) e quindi la maturazione RNA che è un prerequisito per la loro traduzione.
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Representative Results
La maturazione degli ovociti di Xenopus cinetica e la determinazione della percentuale di GVBD ovocita dopo 24 ore di stimolazione PG (Figure 2B, 2C):
Al fine di studiare le conseguenze di traslazione della mutazione eIF4G1-DN, la risposta alla PG in Xenopus laevis ovociti microiniettati con cRNA eIF4G1-DN viene confrontato con eIF4G1-WT e ad altre condizioni di controllo (H 2 O, GFP). I controlli consentono di valutare l'incidenza di ovociti microiniezione indipendentemente dalla natura del cRNA iniettata o di eIF4G1 sovraespressione.
Le cinetiche di maturazioni 10 oociti caratterizzati da condizioni di controllo microiniettati (H 2 O e GFP) è simile a WT e il numero di subire GVBD sono molto vicini l'uno all'altro a 12 e 24 ore dopo la stimolazione PG (Figura 2B). Dopo 24 ore, la maturazione degli ovociti raggiunge 95,7% per WT, il 97,1% per H 2 O e 97,5% per GFP (Fi figura 2C). Così, microiniezioni con H 2 O o controllo CRNAs o CRNAs eIF4G1 hanno scarso effetto sul rilascio meiosi ovocitaria. Viceversa 8 ore dopo la stimolazione PG, il numero di ovociti microiniettati con CRNAs eIF4G1-DN sottoposti GVBD è in ritardo rispetto ai eIF4G1-WT CRNAs (Figura 2B) .Il rilascio meiosi di eIF4G1-DN contro ovociti eIF4G1-WT diminuisce significativamente da 85,8% e 77,4% a 12 ore e 24 ore dopo la stimolazione PG rispettivamente (Figura 2C). È inoltre degno di nota che 13 ore dopo la stimolazione PG, il numero di ovociti maturi raggiunge un massimo per tutte le condizioni eccetto eIF4G1-DN per cui il massimo viene raggiunto solamente 20 ore dopo la stimolazione PG. Così, la presenza di eIF4G1-DN mutazione porta a una scarsa ovocita rilascio meiosi rispetto eIF4G1-WT.
Restauro della maturazione in presenza di eIF4G1-DN grazie al eIF4G1-WT (Figura 2D):
_content "> Per determinare se le ostacola eIF4G1-DN cRNA microiniezione o blocca la maturazione dell'ovocita, diversi rapporti di CRNAs eIF4G1-WT e eIF4G1-DN sono co-microiniettati. In queste condizioni, con un incremento di maturazione degli ovociti si osserva come i livelli di eIF4G1-WT cRNA aumentare e quelli di eIF4G1-DN cRNA decrease.While maturazione si osserva nel 17,5% degli ovociti con una dose di CRNAs eIF4G1-DN, questa percentuale raggiunge il 76,7% con la co-microiniezione di 3 dosi di eIF4G1-WT e CRNAs la presenza di una dose di eIF4G1-WT CRNAs porta al 95% di maturazione degli ovociti. Questo esperimento dimostra che il difetto di maturazione degli oociti di Xenopus microiniettati con eIF4G1-DN non è irreversibile e può essere parzialmente ripristinato.Mos Espressione segnalazione proteine osservati su WB come indicatore della capacità di traduzione prima e dopo la stimolazione PG (Figura 2E):
Il livello di proteine di V5-tag in ovociti esprimere eIF4G1-WT e eIF4G1-DN sono simili riflettendo simile efficienza microiniezione. Il livello di proteine Rsk utilizzato come controllo proteina carico è anche simile in tutte le condizioni prima e dopo la stimolazione PG. L'espressione della proteina GFP è presente anche in ovociti microiniettati con GFP cRNA stimolate o meno con PG. Questi dati indicano che la microiniezione e la sovraespressione di eF4G1 non perturbano la traduzione di GFP. Tuttavia, nessuna espressione della proteina GFP è rilevabile prima e dopo PG stimolazione in oociti che esprimono il eIF4G1-DN. Come previsto, nessuna espressione endogena mos è rilevabile in assenza di stimolazione PG. Inoltre, mos espressione viene osservato nel eIF4G1-WT e H 2 O condizioni di controllo dopo PG stimolazione in accordo con i risultati precedenti che mostra che la sovraespressione di eIF4G1-WT ha poco conseguenze sulla mos endogeni 16. Viceversa, una considerevole diminuzione della mos espressione è evidente dopo stimolazione PG.
Il proespressione proteina di alcune componenti del mos segnalazione cascata è anche testato. Ad esempio, Aurora A / proteine Eg2 agisce a monte di Mos induzione e nessun rilevamento della sua deregulation proteina o della sua forma fosforilata indotto dopo stimolazione PG si osserva. Viceversa, una deregolazione di ERK2 fosforilazione indotta da MOS è osservata in presenza di eIF4G1-DN.
Questi risultati suggeriscono che l'espressione endogena di mos RNA in proteine e mesi di attivazione ERK2 dipendente sono colpiti dall'espressione di eIF4G1-DN.
mRNA poliadenilazione (Figura 2F):
Poliadenilazione di alcuni mRNA (mos, ciclina A1, B1 e Ciclina istone-simili B4) necessari per Xenopus ovociti recupero meiosi è stato testato. Il test eseguito consente di definire se un aumento delle dimensioni amplimer corrispondente alla lunghezza del poli (A) coda di mRNA è presente dopo stimolazione PG. Infatti, con PStimolazione G l'aggiunta di un poli (A) coda si osserva in condizioni incluse la mutazione eIF4G1-DN.
Figura 1. Schema di MAPK attivazione a cascata. Su stimolazione ormonale da PG rapidi cambiamenti nelle attività di numerosi enzimi si verificano anche del Aurora A / Eg2 e CPEB percorso. Iperfosforilazione di Aurora A / Eg2 porta a CPEB (citoplasmatica poliadenilazione Element Binding Protein) fosforilazione. CPEB fosforilata riconosce il CPE (poliadenilazione citoplasmatica Element) su 3'UTR di mRNA mos, recluta CPSF (fenditura e poliadenilazione specificità Factor) e attiva mRNA poliadenilazione da PAP (Poly (A) polimerasi). Stimolazione PG promuove anche successivamente Maskin fosforilazione via sia l'azione di PKA e Cdk1, Maskin / eIF4E dissociazione e associazione eIF4E / eIF4G1. eIF4G1 recluta translazione partner iniziazione tra cui PABP che interagisce con eIF4G1 e riconosce la poli (A) coda. Una volta sintetizzato, mos attiva MEK / MAPKK dalla fosforilazione, che a sua volta, attiva ERK2 / MAPK dalla fosforilazione. Questa cosiddetta cascata MAPK è coinvolta nei processi meiotici controllando entrata cinetica M-fase, morfogenesi del fuso e l'inibizione della sintesi del DNA. La cascata è incorporato in un circuito di retroazione positiva che sostiene la sintesi proteica. Si deve notare che il MoS non è l'unica proteina chiesto di essere sintetizzato per l'attivazione GVBD, cioè, Ciclina B sono tenuti da tradurre per la maturazione successo.
Figura 2. La eIF4G1-DN mutante influenza la maturazione degli ovociti e la traduzione in Xenopus laevis. RNA derivati da plasmidi che codificano per proteine eIF4G1 V5-tag (WT e DN) sonomicroiniettati in Xenopus laevis ovociti. Dopo 15 ore, la maturazione degli ovociti è stimolata dal progesterone (PG) (Gli esperimenti sono stati effettuati almeno 3 volte e risultati rappresentativi sono visualizzate). (A) Schematicoverview di protocollo di sperimentazione. Le iniezioni di eIF4G1 e / o GFP CRNAs sono rappresentate da punte di freccia prima della stimolazione PG. Campioni per RNA e proteine analisi sono state ottenute a 2 punti temporali (stimolazione PG e alla fine della cinetica GVBD). (B) Cinetica di maturazione di 10 oociti caratterizzati da GVBD viene testato durante 24 ore dopo la stimolazione PG. Un ritardo nella maturazione degli ovociti è osservata in ovociti microiniettati con eIF4G1-DN CRNAs rispetto a quelli microiniettati con eIF4G1-WT CRNAs (C) Percentuale di ovociti maturi 24 ore dopo la stimolazione PG (n = 4; * p <0,05).. Una diminuzione della maturazione degli ovociti si osserva in quelli con microiniezione eIF4G1-DN CRNAs rispetto ai eIF4G1-WT CRNAs. (D) Reversion valutazione fenotipo di ovociti microiniettati con eIF4G1-DN CRNAs mutanti e CRNAs eIF4G1-WT che dimostrano che il meccanismo di traduzione è ancora funzionante quando eIF4G1-WT viene aggiunto al mutante. (E) Le proteine sono estratti da ovociti e loro livelli determinati mediante immunoblotting analisi . Perturbazioni di ERK2 fosforilazione, mos e l'espressione della GFP nelle condizioni eIF4G1-DN vengono osservate. (F) poliadenilazione di mos, Ciclina A1, Cyclin mRNA B4 B1 e istone-simili da ovociti stimolate o meno con PG osservata dopo amplificazione PCR e migrazione 3% gel di agarosio. Dopo la stimolazione PG, un aumento della dimensione> 100 poliadenilazione viene rilevata per tutte le condizioni. La prima corsia corrisponde alla scala.
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Discussion
La traduzione è un meccanismo coinvolto nella fisiopatologia di numerose patologie umane, tra cui diverse malattie neurodegenerative. Per esempio nella malattia di Parkinson diversi rapporti hanno suggerito la riduzione di valore in traduzione associata a mutazioni ereditarie 8,12,13.
Diversi modelli cellulari sono a disposizione per lo studio di traduzione. Qui, al fine di studiare gli effetti traduzionali di una mutazione in eIF4G1 che agisce come dominante negativo mutazione ridurre l'interazione tra eIF4G1 e eIF4E partner 8, la Xenopus laevis oocita viene utilizzato. Questo modello ha il vantaggio della semplicità in quanto composto di un unico cellule giganti facilitare la microiniezione di mRNA sintetico, portando ad una notevole quantità di materiale per esperimenti biochimici e facilitare osservazioni macroscopiche delle diverse fasi di maturazione degli ovociti. Questo processo è anche tempo efficiente rispetto alla cella stabilegenerazione di linea. Inoltre, diversi protocolli di preparazione ovociti e RNA microiniezioni sono già stati descritti in particolare per lo studio del ciclo cellulare o trasporto nucleocytoplasmic 14,15. Per quanto riguarda i limiti di tali protocolli per studiare traduzione, una particolare attenzione deve essere presa per quanto riguarda la concentrazione di mRNA. Tale concentrazione non dovrebbe essere elevati (non superiore a 30 ng a 120 massima nl) al fine di non saturare il processo di traduzione. Tenendo conto di questo elemento, Xenopus ovociti è un modello interessante per studiare la traduzione delle proteine come attestato dai dati presentati nella figura 2 con una forma mutante di EIF4G1 trascrizione.
Infatti, in presenza del eIF4G1 mutato, insufficienza nella traduzione di proteine mos è osservato e correlata con una diminuzione del 90% di GVBD rispetto al WT e alle condizioni di controllo. Al contrario, l'iperespressione di eIF4G1-WT non ha comportato la modifica del livello otraduzione f mos in accordo con i dati della letteratura 16,17.
Parecchie modificazioni biologiche possono spiegare questi risultati. Sapendo che Mos mRNA sono di origine materna e già trascritto prima dell'attivazione meiosi da PG, i meccanismi perturbati dovrebbero verificarsi tra i gradini trascrizione e traduzione. Degno di nota, la traduzione mos è il risultato di una cascata di eventi molecolari che partono da un mRNA latente senza poly (A) coda per l'aggiunta della coda dopo stimolazione PG alla sua traduzione 18,19. Così, diversi scenari sono possibili tra cui: difetti di inizio della traduzione potrebbero essere sospettate come la causa di questo fallimento, o difetti di fosforilazione del fattore che porta a Mos mRNA poliadenilazione, o colpa del mRNA poliadenilazione dei mos trascrizioni da solo potrebbe portare ad un diminuzione traslazionale.
Per valutare questi ultimi 2 meccanismi, l'espressione di tali fattori da WB viene esaminato. Esprimerelivelli di ioni di fosforilata Aurora A / Eg2, responsabili CPEB fosforilazione mostrato nessun disturbo in presenza del eIF4G1 mutato. Allo stesso modo, mos mRNA poliadenilazione o altro mRNA poliadenilazione sono osservati in presenza del eIF4G1 mutato dopo PG stimolazione (Figura 2F). Per confermare ulteriormente il profilo poliadenilazione esperimenti Northern blot sarebbe raccomandato oltre a svolgere saccarosio isolamento gradiente di polisomi al fine di stabilire se l'assunzione di mRNA a ribosoma può verificarsi 16.
Così, studiando il primo e l'ultimo elemento della cascata, la fase perturbato sospettato di essere valle del verificarsi di poliadenilazione. E 'anche importante per verificare se il difetto espressione mos ha dato l'impatto atteso sulla fosforilazione di ERK2. In presenza della mutazione, la diminuzione di mos espressione ha portato ad una diminuzione del livello di ERK2 fosforilato e pertanto un difettola progressione GVBD (Figura 1 e 2E). Così, la mutazione eIF4G1 è associato ad una diminuzione prevista della traduzione mos. La delezione del dominio di legame eIF4E in sequenza eIF4G1 nel eiF4G1-DN è probabilmente responsabile della diminuzione delle interazioni eIF4G1 / eIF4E come precedentemente suggerito da uno studio co-immunoprecipitazione 8 che potrebbe perturbare il eIF4F formazione del complesso.
Questo protocollo ha diverse interessanti applicazioni in biologia cellulare. Questo set-up è ideale come le indagini preliminari per una serie di questioni fondamentali in biologia cellulare, quali: per comprendere meglio il ruolo di specifici domini di fattori di inizio e di definire quelli che sono essenziali alla traduzione in vivo o maturazione degli ovociti. In questo contesto, Wakiyama et al. (2000) hanno mostrato l'importanza di maturazione degli ovociti della regione amino-terminale eIF4G1 contenenti i domini di legame per eIF4E e PABP 17; per studiare splicing dell'iniziazione fattori 20; a decifrare i meccanismi utilizzati dai virus dirottamento macchine traduzione di accoglienza per i loro scopi attraverso eIF4G1 scissione, per esempio con l'inibizione di strutture di cap-dipendente traduzione e IRES del loro mRNA, tradotto in cap-indipendente modo 21; di studiare il ruolo della mutazione in fattori di traduzione sul ciclo cellulare da ovociti sono modelli di scelta per tale studio 22; per studiare i principali meccanismi che regolano l'inizio della traduzione cioè, cap-dipendente e cap-indipendente per definire se uno o più sistemi sono coinvolti in un disturbo sintesi proteica. Diverse varianti del protocollo corrente potrebbero essere facilmente applicate a raggiungere questi obiettivi, compresa la determinazione del rendimento di traduzione dal tramonto method23 o giornalista mRNA microiniezione. Ad esempio, l'uso di un reporter mRNA bicistronico contenente un primo cistron in cui Renilla luciferasi sarà cap-dipendente tradottomentre il secondo cistrone contenente Firefly luciferasi sarà tradotto tramite IRES strutture dovrebbero consentire di definire la modalità di apertura di presentare difetti e / o compensazioni multa per mantenere l'omeostasi di traduzione. Inoltre, tali esperimenti RNA giornalista luciferasi offrono il vantaggio di non invocare potenzialità di alterazione meccanismi di sviluppo specializzati a causa di meccanismi di conservazione incompleti con umana.
In parallelo a queste domande fondamentali, tale protocollo potrebbe essere applicato come un primo passo per affrontare condizioni pregiudizievoli che potrebbero contribuire a disturbi neurologici. In condizioni fisiologiche, fasi di inizio della traduzione sono gli obiettivi privilegiati della normativa in condizioni di stress, come l'ossidazione, ipossia, cambiamento di temperatura, irraggiamento e la privazione dei nutrienti. In tali condizioni, una traduzione selettiva di trascritti codificante proteine che sono essenziali dalle sollecitazioni e si verifica la sopravvivenza cellulare.Quando questo processo è sopraffatto, stress diventano patologici e partecipare attivamente allo sviluppo di numerose affezioni neurologiche. Fattori di stress cellulari sono coinvolti in numerose malattie neurodegenerative come l'Alzheimer e il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica o malattia da prioni (Creutzfeldt-Jakob) 24 e queste sollecitazioni inducono l'attivazione di unfolded proteina risposta (UPR). Uno di questi meccanismi UPR porta ad una diminuzione della traduzione attraverso l'attivazione PERK e la fosforilazione di eIF2α subunità con le conseguenze di arresto traduzione impedendo vincolante tra eIF4F e 43S complessi 25. Negli ovociti di Xenopus, l'aggiunta di agenti ossidanti e / o geni mutati noti per essere associati a tali patologie potrebbe mimare queste sollecitazioni e stabilire se i geni mutati possono influenzare i processi di traduzione. Nella malattia di Parkinson, per esempio, l'introduzione di eIF4G1 p.R1205H in Xenopnoi ovocita associati o meno di fattori di stress ossidativo o l'analisi dell'intero genoma di profili polisomale mRNA potrebbe affrontare la questione del coinvolgimento di traduzione nella fisiopatologia 26.
Tutte queste applicazioni applicati al ovocita rappresentano quindi un grande campo di possibilità per studiare disturbi traduzione che ora sono noti per essere associati a diverse affezioni incluse malattie neurodegenerative.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
