Abstract
A síntese de proteínas é um processo fundamental para a expressão do gene impactando processos biológicos diversos, nomeadamente de adaptação a condições ambientais. A etapa de iniciação, que envolve a montagem das subunidades ribossomais no mRNA codão de iniciação, fator de iniciação envolvidos, incluindo eIF4G1. Defeitos neste passo limitante da taxa de tradução estão ligados a diversos distúrbios. Para estudar as consequências potenciais de tais desregulamentações, oócitos de Xenopus laevis constituem um modelo atraente com um alto grau de conservação dos mecanismos celulares e moleculares essenciais com humano. Além disso, durante a maturação meiótica, os oócitos são transcriptionally reprimida e todas as proteínas necessárias são traduzidos do pré-existentes, mRNAs maternos. Este modelo de baixo custo permite mRNA exógena para tornar-se perfeitamente integrado com uma tradução eficaz. Aqui é descrito um protocolo para avaliação de tradução com um fator de interesse (aqui eIF4G1) usando stored ARNm materno que são as primeiras a ser traduzido poliadenilado e durante a maturação do oócito como uma leitura fisiológico. Em primeiro lugar, o ARNm sintetizado por transcrição in vitro de plasmídeos de interesse (aqui eIF4G1) são injectados em oócitos e cinética de maturação dos oócitos por detecção de ruptura da vesícula germinal está determinada. O alvo de ARNm materno estudado é a serina / treonina-proteína MOS-quinase. Sua poliadenilação e sua subsequente tradução são investigados juntamente com a expressão e fosforilação de proteínas das mos cascata de sinalização envolvidos na maturação do oócito. Variações do protocolo atual de apresentar defeitos translacionais também são propostos para enfatizar a sua aplicabilidade geral. À luz da evidência de que a síntese de proteína aberrante pode estar envolvido na patogénese de desordens neurológicas emergente, um tal modelo proporciona a oportunidade de avaliar facilmente essa deficiência e identificar novos alvos.
Introduction
As proteínas são elementos essenciais da vida celular e, portanto, em maior escala do organismo. Eles garantem a maioria das funções celulares, incluindo a estrutura, o transporte, a catálise da reacção, a regulação, a expressão do gene, etc. A expressão é o resultado de um complexo mecanismo de tradução permitindo a conversão de um ARNm em proteína. A tradução é submetido a vários controlos para adaptar e para regular a expressão de genes de acordo com as necessidades das células, durante o desenvolvimento e a diferenciação, envelhecimento, stress fisiológico ou manifestações patológicas.
A tradução é dividido em 3 fases (iniciação, alongamento e terminação) e apresenta 3 sistemas de tradução de iniciação, a fim de responder a essas necessidades: dependente da tampa, independente-cap via Segmento Ribossomo Entrada interno (IRES) Estruturas e realçadores de tradução cap-Independent ( CITE).
A maioria dos mRNA eucarióticas são traduzidos em um tampão-Dependent maneira através da tampa de 5'-trifosfato de 7-metilguanosina, que serve como uma função de reconhecimento, durante a síntese de proteínas. Este tampão liga-se a eIF4E, um componente do complexo eIF4F com eIF4G1 e eIF4A. Associado com outros parceiros como poli (A) Binding Protein (PABP), eIF2 GTP-Met-Met-ARNt, estes factores de iniciação da tradução do mRNA permitir a circularizar e melhorar a sua acessibilidade para as formas 43S complexo de iniciação até que o codão AUG reconhecimento 1. Este caso corresponde ao fim da iniciação da tradução ou seja, o primeiro passo de tradução.
Tradução independente de Cap é usado por codificação de mRNA para as proteínas essenciais em condições de tensão que induzem para a proliferação celular e apoptose instância. Este mecanismo envolve estruturas secundárias no ARNm 5'-região não traduzida (UTR) chamado IRES, a extremidade carboxi-terminal de eIF4G1 associado com o complexo eIF4A e 43S. A ligação deste 43S pré-iniciação complex para IRES inicia a tradução tampão independente, sem a necessidade de um factor de 2,3 eIF4E.
Por fim, outro mecanismo de tradução ainda não é bem compreendida suporta esta atividade tradução independente-tampão em condições de tensão via CITE estruturas localizadas dentro de mRNA UTR 4.
Através destes diferentes modos de tradução que diferem em suas etapas de iniciação, tradução desempenha um papel crítico na homeostase celular e alterações em qualquer um destes processos, assim, teria impacto do organismo com pequena para efeitos de grande escala. Na verdade, o início é um passo limitante da taxa que rege os processos de tradução corretas de mRNA em proteínas e é, portanto, alvo de inúmeros controles e pontos de regulação 5. Se é para o último ou para os componentes desses processos, se acaba por ser defeituoso, ele vai perturbar o equilíbrio estabelecido na célula e, portanto, poderia levar a condi patológicações. Neste contexto, as mutações em fatores de conversão ter sido envolvido em várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, tais como `Leucoencefalopatia com desaparecer matter' branco (eIF2B1-5 subunidade) 6, na síndrome de Walcott-Rallison (gene que codifica para EIF2AK3 PERK) 7, potencialmente doença (eIF4G1 p.R1205H) de Parkinson 8. Por conseguinte, é importante a realização de estudos celulares e moleculares destas proteínas mutantes para aumentar o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento da doença e em geral o processo de iniciação da tradução.
Para realizar esses estudos, é essencial para escolher os modelos mais adequados para observar as consequências dessas mutações oócitos de Xenopus laevis são particularmente bem adaptado devido às suas propriedades fisiológicas e bioquímicas:. Sincronicidade fisiológica (bloqueado na fase G2 do ciclo celular) , elevada capacidade de síntese de proteína (200-400 ng / dia / oócito), elevado número de OOC extraídaytes a partir de um mesmo animal (800-1.000 oócitos / feminino) e o tamanho das células (1,2-1,4 mm de diâmetro), o que facilita a sua manipulação. A microinjecção de oócitos de Xenopus com ARNm sintetizado pode ser facilmente realizada para dissecar passos de tradução. Neste ponto de vista, apresenta outras vantagens. Dada a velocidade de progressão da meiose e da tradução do mRNA após microinjecção (~ 24 h), oócito de Xenopus representa um sistema rápido em comparação com os sistemas celulares reconstituídos (extraído de E. coli, germes de trigo ou de reticulócitos de coelho ...) em que um ARNm é traduzida com uma taxa de tradução reduzida e a uma velocidade mais baixa. Assim, os efeitos de uma mutação introduzida em um ARNm irá ser rapidamente e facilmente observável estudada em vários ovócitos. Outra vantagem de oócitos de Xenopus é que mRNAs maternas são latentes e tradução da proteína é bloqueada antes da estimulação progesterona. A adição de progesterona é, portanto, um bom meio de controlar a indução de tradução. Citoplasmática pO olyadenylation não ocorrer durante a oogenese. Inicia-se durante a maturação de oócitos em oócitos de progesterona estimulada por em uma ordem temporal e continua durante todo o desenvolvimento precoce e pode ser usado para estudar as diferentes etapas de tradução.
A poliadenilação do mRNA é mos entre os primeiros a ocorrer e que pertence Aurora com A / EG2, Histone-Like B4 mRNA para a classe de genes "de maturação precoce", definidas na Charlesworth et al. (2004) 9. A indução da tradução do mRNA "final", como ciclina A1 e B1 Cyclin ocorre em torno do tempo de rompimento da vesícula germinativa (GVBD). Mos ARNm codifica uma cinase serina / treonina-proteína. Sua tradução é crucial, uma vez que induz a quinase MAP cascata que indiretamente ativa a maturação do oócito. Com efeito, em resposta à progesterona, poliadenilação do ARNm MOS é reforçada através de um processo que envolve Aurora A / EG2 proteínas reguladoras e outras proteínas de ligação de ARN com the 3? UTR do mRNA de MOS. Este aumento de poliadenilação do ARNm MOS leva a um aumento do nível de proteína MOS, que por sua vez activa MEK1. Este processo medeia a activação da sinalização extracelular regulada-quinase 2 (ERK2) (Figura 1). Esta cascata de sinalização pode então provocar o M-fase de maturação promover factores, um complexo formado pela ciclina B e cdc2-quinase, e, eventualmente, resulta no recomeço da meiose.
Portanto, em oócitos de Xenopus laevis, o estudo de ARNm maternais como MOS pode ser facilmente utilizado para testar a sua possibilidade de tradução com vários parâmetros da sua poliadenilação eficiente para a tradução de vários componentes MOS de sinalização, incluindo também a determinação da taxa de GVBD. Este sistema é, portanto, interessante para avaliar as primeiras conseqüências de mutações nos fatores de iniciação da tradução, sem interferência do mRNA recentemente transcrito ou de eficiência de transfecção, os problemas que ocorrem frequentemente com eukaryestudos com células óticas.
Aqui, um protocolo é estabelecido onde mRNAs eIF4G1 mutantes são microinjeção em oócitos de Xenopus laevis ea tradução do mRNA materno é testada. Na presença de um defeito na progressão GVBD, mos de poliadenilação do ARNm que é essencial para a progressão através do ciclo celular meiótica dos oócitos e para o subsequente tradução de mRNAs precoces e tardios classe é verificada. A fosforilação Aurora A / EG2 e ERK também é estudada para confirmar a consequência da mos deregulation.Thus, oócitos de Xenopus representam uma forma simples de analisar diferentes etapas de tradução do mRNA.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de Xenopus no biotério da Universidade de Lille 1 de acordo com as regras estabelecidas nas orientações do Conselho da Comunidade Europeia (86/609 / CEE) para a experimentação em animais de laboratório. O protocolo animal foi aprovado pelo comitê de ética local (Comité d'en Ethique Experimentação Animale Nord-Pas-De-Calais, CEEA 07/2010).
1. Manipulação de Oócitos
- Preparar a solução anestésica: dissolver 1 g de metano-sulfonato tricaina pó em um 1 L de água estéril.
- Xenopus laevis fêmea de imersão nesta solução, cobrir o copo para evitar a fuga e esperar cerca de 45 min para o animal a ser completamente sedado (sem qualquer reacção a uma pitada perna).
- Lave o sapo com sabão e enxaguar com água da torneira, em seguida, colocar o animal em sua parte traseira em papel alumínio limpo.
- Prenda a pele da parte lateral do abdômen e no nível ovários com uma pinça.Faça uma incisão de aproximadamente 1 cm com uma tesoura limpos antes do uso com etanol 70%. Certifique-se de que a secção é suficientemente profunda e para alcançar a parede abdominal subjacente para permitir a excisão de tecido de ovário, em que são encontrados vários oócitos em vários estágios de desenvolvimento.
- Dissecar as lóbulos ovário, lavá-los 4 vezes numa placa de Petri (50 mm) com meio ND96 (mM de NaCl 96, KCl 2 mM, 1 mM de MgCl2, 1,8 mM de CaCl 2, 5 mM de HEPES ajustado para pH 7,4 com NaOH, suplementado com 50 ug / ml de estreptomicina / penicilina, 225 ug / ml de piruvato de sódio, 30 ug / ml de inibidor de tripsina de soja, 1 ul / ml de tetraciclina) para remover todos os vestígios de sangue e detritos.
Nota: Tetraciclina permite uma conservação óptima e uma boa recuperação após o tratamento de microinjeção. - Armazená-los em uma placa de Petri cobertas submerso no meio a 14 ° C, permitindo a sua conservação durante uma semana.
- Costure a parede abdominal ea pele com o veterinário absorvível thread e uma agulha de sutura (3 ou 4 pontos será necessária).
- Colocar o animal em um copo sem água e úmido a pele com água da torneira até que a rã está se movendo novamente. Tapar o copo para impedir a fuga.
- Separa-se cuidadosamente os lóbulos de ovário no meio em grupos de 5 a 10 oócitos utilizando 2 pares de pinças sob um estereomicroscópio com uma ampliação de 10 vezes. Seleccione ovócitos na fase VI. Eles podem ser reconhecidos por i) a sua forma e cor com um polo animal com pigmento castanho e polo vegetativo amarelo separado por uma correia claro ii) o seu tamanho superior a 1,2 mm de diâmetro, 10.
- Incubar os oócitos seleccionados de uma solução de colagenase (1 mg / ml de colagenase A de Clostridium histolyticum, dissolvido em ND96 sem tetraciclina) numa placa de Petri com agitação suave durante 45 minutos para facilitar a defolliculation oócito (colagenase digere conexões de células foliculares de oócitos /). Lavar o oócitos 3 ou 4 vezes com meio mantido a 14 ND96° C.
Nota: Não incube os oócitos menos ou mais de 45 min, devido ao risco de destruição de proteínas de superfície do oócito e de causar viabilidade pobres. Tratamento de colagenase pode induzir GVBD espontânea. - Incubar oócitos no meio durante 3-4 horas. Remover as células foliculares com uma pinça fina sob lupa binocular e mantê-los a 19 ° C em meio ND96.
2. Preparação de ARNm Síntese
- 5 ug de linearizar os seguintes plasmídeos por digestão enzimática com PmeI enzima.
NOTA: pcDNA6.2 / V5-DEST contendo um aminoácidos eIF4G1 cDNA tipo selvagem 1599 (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST contendo um cDNA negativo dominante eIF4G1 (eIF4G1-DN) com mutações c.2105T > L c.2106A> C, c.2120-> L, c.2122T> A, 2125T> - e c.2126T> G na região de interacção entre eIF4G1 e eIF4E na posição 612 a 618 da proteína correspondente a perturbar interação between eIF4G1 e eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP contendo cloranfenicol acetil-transferase (GFP). Preparar 2 misturas de cada um dos plasmídeos 3: o primeiro incluindo PmeI enzima e a segunda enzima, sem como controlo. - Precipitar o DNA de plasmídeo utilizando um procedimento clássico de etanol e ressuspender-lo em 20 ul de H-nuclease livre 2 O.
- Determinar a sua concentração, utilizando um espectrofotómetro. A concentração deve ser superior a 150 ng / mL para transcrever ARNc.
- Corra 1 ul de amostras e os controlos, com 5 ul de tampão de carregamento num gel de agarose 0,8% para verificar a linearização do plasmídeo.
- Usar um kit de transcrição in vitro e purificação de ARNc de acordo com as instruções do fabricante. Os transcritos de ARNc foram ressuspensas em 20 ul de H-nuclease livre 2 O. As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C se necessário.
- Preparar o tampão de MOPS 10X migração contendo MOPS 0,2 M (pH 7,0), 20 mAcetato de sódio M e EDTA 10 mM (pH 8,0). Esterilizar solução com um filtro de 0,45 um. Estocar a solução protegido contra a luz à temperatura ambiente para evitar solução de oxidação.
- Limpe o tanque de eletroforese sucessivamente com NaOH, HCl e cuidadosamente lavados com água duplamente filtrada para um O / N para evitar RNase e evitar a degradação do RNA.
- Fundido num gel de agarose a 1,5% contendo MOPS e formaldeído. Aqueça até a dissolução completa agarose e deixe esfriar até 55 ° C. Sob hotte, adicionar 0,1 volumes de MOPS 10X, 6,6% de formaldeído e 4 ug de brometo de etídio (10 mg / mL). Despeje o gel sob a coifa e esperar cerca de 1 hora para o gel para endurecer.
Nota: O formaldeído e o brometo de etídio são tóxicos. - Preparar as amostras para a migração de um tubo de 0,2 mL com 1 mL de ARNc, 8,8% de formaldeído, 60% de formamida e 0,1 volumes de MOPS 10X. Incubar durante 3 min a 70 ° C e colocar os tubos em gelo durante 10 min. Centrifugar as amostras poucos segundos a5.000 x g. Adicionar 2 mL de tampão de carga de gel.
Nota: Formamida é tóxico. - Execute amostras durante 20 minutos a 90V. Mergulhe o gel em livre de nuclease H 2 OO / N para destain o gel antes de analisá-lo para verificar a qualidade cRNA.
- Determinar a concentração de cRNA utilizando um espectrofotómetro e armazená-las a -80 ° C.
3. microinjeção de RNA sintetizado e Oócitos Maturação Estimulação
- Prepare o equipamento necessário para oócitos microinjeção. Use um extrator micropipeta para puxar pequeno capilar de vidro. Sob microscópio estereoscópico, parta a extremidade do capilar com a pinça para criar uma extremidade romba. Encher a micropipeta capilar com óleo mineral utilizando uma seringa de 1 mL com um filtro Millipore de 0,45 um na extremidade oposta. Montar o micropipeta na pipeta microinjecção. Escolha uma micropipeta preciso calibrado pelo fabricante para dar boa precisão quando usado com capilar de vidro adequado.
- Realizar microinjecção 1-2 horas após defolliculation, o atraso necessário para a recuperação de oócitos em oócitos mantida a 14 ° C. Use pratos de Petri com o fundo raspado com uma pinça para criar uma superfície adesiva para oócitos e preenchê-las com meio ND96.
- Dispor oócitos ao longo de uma pista raspadas em uma placa de Petri que permite uma injecção de oócitos com sucessivo a micropipeta capilar a um ângulo de 45 ° C.
- Injectar na zona equatorial do oócito, abaixo da área de animais pigmentada para uma difusão óptima de amostras no citoplasma. Insira apenas a parte mais fina da ponta capilar em cerca de 150-200 mm de profundidade.
- Injectar 30 ng de ARNc obtido a partir de, respectivamente, os plasmídeos diferentes num volume de 60 nl de uma primeira oócito. Após a injecção, esperar durante 5-10 segundos antes de remover a ponta capilar para evitar a fuga da amostra (Figura 2A).
Nota: Não exceda 120 nl. Injectar tão lentamente quanto você puder. Um controlo com água destilada é recomendado. - Mova manualmente a placa de Petri para injetar o próximo oócito.
Nota: Certifique-se de que a ponta não está obstruído, gerando um pequeno impulso para fora da solução do banho após 2 a 3 microinjeções. - Transferência de oócitos injectados em placas de cultura de 24 poços (10 oócitos / poço) encheu-se com 3 ml de meio fresco ND96 e deixá-los a 19 ° C.
- Incubar os oócitos em ND96 com progesterona (PG) (2 ug / ml) para induzir a maturação meiótica (GVBD) a 19 ° C, 15 horas ou 4 horas após a micro-injecção de ARNc poliadenilados obtidos respectivamente a partir de pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 e pcADN6 .2 / C-EmGFP utilizado como um controlo (Figura 2A).
Nota: A co-injecção de marcador fluorescente com o ARNc é um bom instrumento para assegurar que o cRNA foi injectado e permaneceu no oócito. Realizar tais experimentos preliminares usando um cRNA de interesse com uma tag GFP. - Microinject como em diferentes proporções # 3.5 (1: 3, 2: 2, 3: 1) de poliadenilado eIF4G1-WT e eIF4G1-DN cRNAs, a fim de ter o efeito da conversão de ARNc eIF4G1-WT no fenótipo mutante (Figura 2D).
4. Germinal Vesicle Breakdown Determinação
- Contar o número de oócitos maduros após estimulação PG observando a presença de um ponto branco no pólo animal branco com um estereomicroscópio. Repita a cada hora a contar até vinte e quatro horas (Figura 2B, 2C).
5. Western Blot (WB) Análise
- Homogeneizar o grupo de 10 oócitos por trás e por diante movimentos com uma ponta de micropipeta, a 4 ° C em 200 ul no tampão seguinte: 50 mM de Hepes, pH 7,4, NaCl 500 mM, 0,05% de SDS, 5 mM de MgCl2, 1 mg / ml de albumina de soro bovino, 10 mg / ml de leupeptina, 10 mg / ml de aprotinina, 10 mg / ml de inibidor de tripsina de soja, 10 mg / mL de benzamidina, 1 mM de PMSF, 1 mM de vanadato de sódio.
- Centrifugar as amostras durante 15 min a 10000 xg para remover o lípido (fase superior) e a membrana (fase inferior) fractions. Recolher a fracção citoplasmática, armazenar uma aliquota para determinar a concentração de proteína e completar o restante com Laemmli ou um tampão de amostra bis-Tris (1: 1).
Nota: Gel Bis-Tris e o tampão de carga tem um pH mais neutro, que protege as proteínas a partir da hidrólise - Aquecer 20 ug de amostra a 95 ° C durante 10 min. Carregar cada amostra nos poços do gel de acrilamida. Colocar o gel num tanque com um tampão apropriado.
- Executar uma electroforese durante 1 h a 200 V.
- Realizar um WB em TBS a pH 8,0 (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween a 0,1%, contendo 10% de albumina de soro de bovino) com um anticorpo de cabra anti-Aurora A / EG2 (1: 3000, 2 horas) ou com um anti-coelho Um -Aurora / EG2-P (1: 1000, O / N a 4 ° C), de ratinho anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), de cabra anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 hr ), de coelho anti-MOS (1: 5.000, 4 h), de coelho anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use anticorpos de ratinho anti-V5 (a 1: 10000, 2 h) e de coelho anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (como controlo de carga).
- lavagema membrana 3 vezes durante 10 min em TBS-Tween e incubar 1 hora quer com um anti-murganho ou anti-coelho ou anti-cabra (IgM) anticorpo secundário rábano marcado com peroxidase a diluições de 1: 5000, 1: 7500 e 1 : 5.000, respectivamente.
- Faça 3 lavagens de 10 min em TBS-Tween e detectar os complexos antígeno-anticorpos com o sistema de Detecção Avançada ECL.
6. Poliadenilação Assay
- Amostra 5 ovócitos por condição em um 1,5 ml. Lavá-las com 1 ml de PBS isento de nuclease-1X (pH 7,4). Os passos seguintes serão feitos sob coifa.
- Extrato de RNA utilizando um procedimento orgânico clássica (veja as instruções do fabricante).
- Recuperar o ARN por centrifugação (10000 xg) durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ARN secar ao ar durante 10 min.
- Ressuspender sedimento de ARN em 30 ul de H-nuclease livre 2 O.
- Pegue 15 ul de amostras em um novo tubo e adicionar 85 ul de H Nuclease-free 2 O. Limpar oAmostras de se melhorar a sua qualidade em coluna de sílica de acordo com as instruções do fabricante. Elui-se o ARN utilizando 30 ul de H-nuclease livre H2O
- Corra 1 ul de amostras com 5 ul de tampão de carregamento num gel de agarose 0,8% para verificar a integridade do ARN.
- Determinar a concentração de ARN utilizando um espectrofotómetro.
- Preparar 2 misturas de ligação por condição (isto é, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN e o H2O de controlo) com os seguintes reagentes: 10 U de ARN-ligase, 0,1 volume de 10X tampão, ATP 1 mM, 10% de PEG8000 a 50% , 0,1 ug de iniciador P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 e levar o volume final para 10 uL com H-nuclease livre 2 O. Adicionar no primeiro RNA obtido a partir de oócitos mistura PG sem estimulação e na segunda ARN obtido a partir de mistura de PG estimulada oócitos.
- Incubar durante 1 hora a 37 ° C e depois durante 20 min a 65 ° C para inactivar a enzima.
- Nósea cDNA Transcrição Reversa kit (RT). Prepare-se a mistura à temperatura ambiente, por tubo: 0,1 volume de tampão 10X de RT, 0,1 ug de iniciador P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, uma mistura de dNTP 4 mM, 50 U de transcriptase reversa e completa com Nuclease-livre H2O para volume final de 10 ul. Adicionar 10 ul de reacção de ligação obtido anteriormente. Realizar a TA sob condições descritas pelo fabricante.
- Prepare a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) de uma mistura, por tubo: 0,1 volume de tampão 10X, 1,5 mM de MgCl 2, 133 mistura uM de dNTP, 0,2 uM de iniciadores específicos, 0,2 uM de iniciadores P2, 0,025 U de polimerase Taq, 1 ul de ADNc e completa com livre de nuclease H2O para volume final de 50 ul. Executar a PCR sob as seguintes condições: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, [95 ° C durante 1 min, 56 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg] * 40 ciclos, 72 ° C 9, durante 10 min. Os iniciadores específicos são os seguintes: G, MOSB4 TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA histona-like, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; A ciclina A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Ciclina B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- Preparar um gel de agarose a 3%. Adicionar em cada produto de PCR 10 ul de tampão de carga. Submeter o gel com 10 uL de amostras a 110 V para uma migração óptima. Analisar o gel depois de 10 e 20 minutos para observar a mudança de tamanho reflectindo o comprimento da cauda poli (A) e, portanto, a maturação de RNA que é um pré-requisito para a sua tradução.
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Representative Results
Kinetic maturação de ovócitos de Xenopus e determinação do GVBD percentual de oócitos após 24 horas de estimulação PG (Figuras 2B, 2C):
A fim de estudar as consequências de translação da mutação eIF4G1-DN, a resposta ao PG em oócitos de Xenopus laevis microinjectados com ARNc eIF4G1-DN é comparado com eIF4G1-WT e de outras condições de controlo (H2O, GFP). Os controlos permitem avaliar a incidência de microinjecção de oócitos, independentemente da natureza do ou injectados com cRNA de eIF4G1 superexpressão.
As cinéticas de maturações 10 oócitos caracterizadas por condições de controlo de micro-injectadas (H 2 O e GFP) são semelhantes aos WT e o número de sofrer GVBD são muito próximos uns dos outros, às 12 e 24 horas após a estimulação PG (Figura 2B). Após 24 h, maturação dos oócitos atinge 95,7% para o WT, 97,1% de H2O e 97,5% para GFP (Fi figura 2C). Assim, micro-injecções com H 2 O ou de controlo ARNc ou ARNc eIF4G1 têm pouco efeito sobre a libertação de oócitos meiose. Inversamente 8 horas após a estimulação PG, o número de oócitos microinjectados com ARNc eIF4G1-DN submetidos a GVBD está atrasado em comparação com WT-eIF4G1 ARNc (Figura 2B) .a meiose libertação de eIF4G1-DN contra oócitos eIF4G1-WT diminui significativamente por 85,8% e 77,4% em 12 horas e 24 horas após a estimulação PG, respectivamente (Figura 2C). É também digno de nota que 13 horas após a estimulação PG, o número de oócitos maduros atinge um máximo para todas as condições, com excepção para eIF4G1-DN para que a máxima é alcançada apenas 20 horas após a estimulação PG. Assim, a presença da mutação eIF4G1-DN leva a uma redução do oócito meiose libertação comparado com eIF4G1-WT.
Restauração da maturação de oócitos em presença de eIF4G1-DN graças à eIF4G1-WT (Figura 2D):
_content "> Para determinar se os prejudica eIF4G1-DN ARNc microinjeção ou bloqueia a maturação do oócito, diferentes proporções de cRNAs eIF4G1-WT e eIF4G1-DN são co-microinjeção. Nessas condições, um aumento de maturação do oócito é observado como os níveis de eIF4G1-WT ARNc levantar e aqueles de maturação eIF4G1-DN ARNc decrease.While é observada em 17,5% dos oócitos com uma dose de ARNc eIF4G1-DN, esta percentagem atinge 76,7% com co-microinjecção de 3 doses de eIF4G1-WT e ARNc a presença de uma dose de eIF4G1-WT ARNc leva a 95% de maturação dos oócitos. Esta experiência mostra que o defeito de maturação de oócitos de Xenopus microinjectados com eIF4G1-DN não é irreversível e pode ser parcialmente restaurada.Expressão de proteínas de sinalização MOS observados em WB como um indicador da capacidade de tradução, antes e após a estimulação PG (Figura 2E):
O nível de proteína de V5-tag em oócitos expressando eIF4G1-WT e eIF4GDN-1 são semelhantes reflectindo a eficiência semelhante microinjecção. O nível de proteína Rsk utilizado como controlo de carga de proteína também é semelhante em todas as condições antes e depois da estimulação PG. A expressão da proteína GFP também está presente em oócitos microinjectados com GFP ARNc estimulada ou não com PG. Estes dados indicam que a microinjecção e a sobre-expressão de eF4G1 não perturba a tradução de GFP. No entanto, nenhuma expressão da proteína GFP é detectável antes e depois da estimulação PG em ovócitos que expressam o eIF4G1-DN. Como esperado, a expressão endógena MOS não é detectável na ausência de estimulação PG. Além disso, mos expressão é observada no eIF4G1-WT e H 2 O condições de controle após PG estimulação de acordo com resultados prévios mostrando que a superexpressão de eIF4G1-WT tem poucas consequências na mos endógenos 16. Por outro lado, uma diminuição considerável de mos expressão é perceptível após PG estimulação.
O protein expressão de alguns componentes da cascata de sinalização MOS também é testado. Por exemplo, / proteína EG2 Aurora Um está agindo a montante mos indução e não foi detectada sua desregulamentação proteína ou da sua forma fosforilada induzida após PG estimulação é observado. Por outro lado, uma desregulação de ERK2 fosforilação induzida por MOS é observado na presença de eIF4G1-DN.
Estes resultados sugerem que a expressão endógena de ARN em proteína e MOS MOS dependente de activação de ERK2 são afectadas pela expressão de eIF4G1-DN.
A poliadenilação do ARNm (Figura 2F):
Poliadenilação de vários mRNAs (MOS, ciclina A1, B1 e B4 Cyclin histona-like) necessários para Xenopus Oócitos recuperação meiose foi testado. O ensaio realizado permite definir se um aumento no tamanho amplímero que corresponde ao comprimento da cauda poli (A) do ARNm está presente após estimulação PG. Com efeito, com PL estimulação da adição de um (A) da cauda poli é observada em todas as condições, incluindo a mutação eIF4G1-DN.
Figura 1. Visão esquemática de MAPK ativação em cascata. Após estimulação hormonal por PG rápidas mudanças nas atividades de várias enzimas de ocorrência, incluindo os da Aurora A / EG2 e via CPEB. Hiperfosforilação de Aurora A / EG2 leva a CPEB (Cytoplasmic Poliadenilação elemento de ligação de proteína) fosforilação. CPEB fosforilada reconhece o CPE (poliadenilação citoplasmática Elemento) no 3'UTR do mRNA mos, recruta CPSF (clivagem e poliadenilação Especificidade Factor) e ativa poliadenilação mRNA pela PAP (Poli (A) Polimerase). PG estimulação também promove sucessivamente Maskin fosforilação via tanto a ação de PKA e cdk1, Maskin / eIF4E dissociação e associação eIF4E / eIF4G1. eIF4G1 recruta transparceiros lação de iniciação incluindo PABP que interage com eIF4G1 e reconhece o (A) da cauda poli. Uma vez sintetizado, mos ativa MEK / MAPKK por fosforilação, que por sua vez, ativa ERK2 / MAPK por fosforilação. Esta chamada cascata MAPK está envolvido nos processos de controlo da cinética meióticas entrada de fase M, a morfogénese do fuso e a inibição da síntese de ADN. A cascata é incorporado em um loop de feedback positivo que sustenta a síntese de proteínas. Tem-se notar que mos não é a única proteína a ser solicitado para a activação GVBD sintetizado, ou seja, a ciclina B é obrigado a ser traduzido para realização da maturação.
Figura 2. O eIF4G1-DN mutante afeta a maturação do oócito e tradução em Xenopus laevis. ARN derivado a partir de plasmídeos que codificam para proteínas marcadas com eIF4G1 V5 (WT e DN) émicroinjectado em oócitos de Xenopus laevis. Após 15 h, a maturação dos oócitos é estimulada pela progesterona (PG) (As experiências foram realizadas pelo menos 3 vezes e os resultados representativos são mostrados). (A) Schematicoverview protocolo de experimentação. As injeções de eIF4G1 e / ou GFP cRNAs são representados por setas-cabeças antes PG estimulação. As amostras de RNA e proteínas análises foram obtidas em 2 pontos de tempo (PG estimulação e no final da cinética GVBD). (B) Cinética da maturação de oócitos 10, caracterizado por GVBD é testado durante 24 horas após a estimulação PG. Um atraso na maturação dos oócitos é observada em oócitos microinjectados com eIF4G1-DN ARNc comparados com os micro-injectados com ARNc eIF4G1-WT (C) Percentagem de oócitos maduros 24 h após a estimulação PG (n = 4; * p <0,05).. Uma diminuição na maturação do oócito é observado em pessoas com microinjeção eIF4G1-DN cRNAs comparação com eIF4G1-WT cRNAs. (D) Reversioavaliação fenótipo N de oócitos microinjectados com eIF4G1-DN ARNc mutantes e ARNc eIF4G1-WT mostrando que a maquinaria de tradução ainda é funcional quando eIF4G1-WT é adicionado à mutante. (E) As proteínas são extraídas a partir de oócitos e os seus níveis determinados por immunoblotting análise . Perturbações de fosforilação ERK2, mos e expressão GFP nas condições eIF4G1-DN são observados. (F) Poliadenilação de mos, ciclina A1, a ciclina mRNAs B4 B1 e histona-like de oócitos estimuladas ou não com PG observada após amplificação por PCR e migração em 3% de gel de agarose. Após estimulação PG, é detectado um aumento no tamanho> 100 poliadenilação para todas as condições. A primeira pista corresponde à escada.
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Discussion
A tradução é um mecanismo envolvido na fisiopatologia de numerosas doenças humanas, incluindo várias doenças neurodegenerativas. Por exemplo, na doença de Parkinson vários relatórios sugeriram o comprometimento em tradução associada a mutações hereditárias 8,12,13.
Vários modelos celulares estão disponíveis para estudar a tradução. Aqui, a fim de estudar as consequências de translação de uma mutação em eIF4G1 que actua como dominante negativo mutação reduzindo a interacção entre os parceiros eIF4E eIF4G1 e 8, o oócito de Xenopus laevis é usado. Esse modelo tem as vantagens da simplicidade, uma vez que é composto por apenas uma única célula gigante facilitar a microinjecção de ARNm sintético, levando a uma quantidade considerável de material por experiências bioquímicas e facilitando observações macroscópicas das diferentes fases de maturação dos oócitos. Este processo é também eficiente em comparação com o tempo de células estáveisgeração linha. Além disso, vários protocolos de preparação de ARN e micro-injecções oócito já foram descritos, em especial, para o estudo do ciclo celular ou o transporte nucleocitoplasmático 14,15. Quanto aos limites de tais protocolos de estudo de tradução, deve ser tomada uma atenção especial em relação à concentração de mRNA. Esta concentração não deve ser elevada (não superior a 30 ng em 120 nl máxima) de modo a não saturar o processo de tradução. Tendo em conta este elemento, Xenopus ovócito é um modelo atraente para estudar a tradução da proteína como atestam dados apresentados na Figura 2 com uma forma mutante do EIF4G1 transcrição.
Com efeito, na presença do eIF4G1 mutado, insuficiência na tradução da proteína MOS é observada e correlacionada com uma diminuição de 90% de GVBD em comparação com WT e para controlar as condições. Por outro lado, a sobreexpressão de eIF4G1-WT não resultou em alteração no nível óf mos tradução de acordo com dados da literatura 16,17.
Várias modificações biológicas podem explicar esses resultados. Sabendo que mos mRNA são de origem materna e já transcritas antes da ativação meiose por PG, os mecanismos perturbados deve ocorrer entre os passos de transcrição e tradução. Digno de nota, MOS tradução é o resultado de uma cascata de eventos moleculares que começam a partir de um ARNm latente sem poli (A) da cauda para a adição da cauda após estimulação PG a sua tradução 18,19. Assim, vários cenários são possíveis, incluindo: defeitos de iniciação da tradução pode ser suspeitado como a causa dessa falha, ou defeitos de fosforilação do fator que leva à mos poliadenilação mRNA, ou padrão de mRNA de poliadenilação dos transcritos mos por si só pode levar a uma diminuição de translação.
Para avaliar estes últimos mecanismos 2, a expressão destes factores por WB é examinada. Expressaros níveis de iões de fosforilada Aurora A / EG2, responsável pela fosforilação CPEB mostrou nenhuma perturbação na presença do eIF4G1 mutado. Na mesma linha, mos de poliadenilação do ARNm ou outra poliadenilação do mRNA é observado na presença do eIF4G1 mutado após estimulação PG (Figura 2F). Para confirmar ainda mais o perfil de poliadenilação experimentos de Northern blot seria recomendado, bem como realizar o isolamento gradiente de sacarose de polissomos, a fim de estabelecer se o recrutamento de mRNA para ribossomo pode ocorrer 16.
Assim, através do estudo dos primeiros e últimos elementos da cascata, a fase perturbado era suspeito de estar a jusante da ocorrência de poliadenilação. É também importante para testar se o defeito de expressão MOS deu o efeito pretendido sobre a fosforilação de ERK-2. Na presença da mutação, a diminuição da expressão MOS levou a uma diminuição do nível de ERK2 fosforilados e, consequentemente, a um defeito naa progressão GVBD (Figura 1 e 2E). Assim, a mutação eIF4G1 está associada a uma diminuição esperada de tradução MOS. A supressão do domínio de ligação eIF4E em sequência eIF4G1 no eiF4G1-DN é provavelmente responsável de uma diminuição nas interacções eIF4G1 / eIF4E como previamente sugerido por um estudo de co-imunoprecipitação 8 que pode perturbar a formação do complexo eIF4F.
Este protocolo tem várias aplicações interessantes em biologia celular. Esta configuração é ideal como investigações preliminares para uma série de questões fundamentais da biologia celular, tais como: Compreender melhor o papel dos domínios específicos de fatores de iniciação e definir aqueles que são essenciais para in vivo de tradução ou a maturação do oócito. Neste contexto, Wakiyama et ai. (2000) demonstrou a importância na maturação de oócitos de a região amino-terminal de eIF4G1 contendo os domínios de ligação e para eIF4E PABP 17; para estudar splicing de iniciação fatores de 20; para decifrar os mecanismos utilizados por vírus seqüestro anfitrião máquinas de tradução para os seus fins através eIF4G1 clivagem por exemplo, com inibição de estruturas cap-dependente de tradução e IRES de seu mRNA, traduzido em forma independente-cap 21; para estudar o papel da mutação nos factores de tradução no ciclo celular uma vez que os oócitos são modelos de escolha para este estudo 22; para estudar os mecanismos principais que regulam a iniciação da tradução ou seja, e independente de tampa dependente de tampão para definir se um ou vários sistemas estão envolvidos na síntese de proteínas de uma perturbação. Diversas variações do protocolo atual poderia ser facilmente aplicada para alcançar estes objectivos, incluindo a determinação da eficiência da tradução pelo method23 ou repórter microinjeção mRNA por do sol. Por exemplo, a utilização de um ARNm bicistrónico contendo uma repórter primeiro cistrão na qual a luciferase da Renilla será dependente da tampa traduzidoenquanto que a segunda cistron contendo Firefly luciferase será traduzido via IRES estruturas deverá permitir definir o modo de iniciação a apresentar defeitos finos e / ou compensações para manter a homeostase tradução. Além disso, essas experiências de ARN repórter luciferase oferecem a vantagem de não depender de potencial devastadores mecanismos de desenvolvimento especializadas devido a mecanismos incompletos de conservação com humano.
Paralelamente a estas questões fundamentais, como protocolo pode ser usado como um primeiro passo para lidar com condições prejudiciais que poderiam contribuir para distúrbios neurológicos. Em condições fisiológicas, as etapas de iniciação da tradução são os alvos privilegiados de regulamentações sob condições de stress, tais como oxidação, hipoxia, mudança de temperatura, irradiação e privação de nutrientes. Em tais condições, uma tradução selectiva de transcritos que codificam proteínas que são essenciais contra as tensões e sobrevivência celular ocorre.Quando este processo está sobrecarregado, as tensões se tornar patológica e participar ativamente no desenvolvimento de diversas afecções neurológicas. Estressores celulares estão envolvidos em numerosas doenças neurodegenerativas tais como as doenças de Alzheimer e de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica ou doenças de prião (de Creutzfeldt-Jakob) 24 e estas tensões induzir a activação da resposta a proteínas desdobrado (UPR). Um desses mecanismos UPR leva a uma diminuição da tradução através da activação PERK e a fosforilação da subunidade eIF2α com as conseqüências de parar tradução, impedindo a ligação entre eIF4F e 43S complexos 25. Em oócitos de Xenopus, a adição de agentes oxidantes e / ou genes mutantes conhecidos por estarem associados a estas patologias que mimetizam estas tensões e estabelecer se os genes mutantes podem afetar os processos de tradução. Na doença de Parkinson, por exemplo, a introdução de eIF4G1 p.R1205H em Xenopnos oócito associada ou não ao estresse oxidativo ou a análise de todo o genoma dos perfis polissomal mRNA poderia abordar a questão do envolvimento de tradução na fisiopatologia 26.
Todas estas aplicações aplicados ao oócito, portanto, representam um grande campo de possibilidades para estudar as perturbações de conversão que são agora conhecidos por estarem associados a várias afecções incluindo distúrbios neurodegenerativos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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