Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Abstract

La síntesis de proteínas es un proceso fundamental para la expresión de genes que afectan diversos procesos biológicos en particular de adaptación a las condiciones ambientales. La etapa de iniciación, que consiste en el montaje de las subunidades ribosomales en el ARNm codón de iniciación, inicio factor involucrado incluyendo EIF4G1. Los defectos en este paso limitante de la velocidad de la traducción están vinculadas a diversos trastornos. Para el estudio de las posibles consecuencias de estas desregulaciones, Xenopus laevis constituyen un modelo atractivo con un alto grado de conservación de los mecanismos celulares y moleculares esenciales con humanos. Además, durante la maduración meiótica, los ovocitos son transcripcionalmente reprimidos y todas las proteínas necesarias son traducidos de mRNAs preexistentes, derivados de la madre. Este modelo de bajo costo permite ARNm exógeno para convertirse perfectamente integrada con una traducción efectiva. Aquí se describe un protocolo para la evaluación de traducción con un factor de interés (en este caso EIF4G1) usando stored mRNA materna que son los primeros en ser polyadenylated y traducidos durante la maduración de ovocitos como una lectura fisiológico. Al principio, el ARNm sintetizado mediante transcripción in vitro de plásmidos de interés (aquí EIF4G1) se inyectan en oocitos y la cinética de la maduración de ovocitos por detección de averías Germinal de vesículas se determina. El objetivo mRNA materna estudiada es la serina / treonina mos-proteína-quinasa. Su poliadenilación y su posterior traducción son investigadas junto con la expresión y fosforilación de las proteínas de los MOS cascada de señalización implicada en la maduración de ovocitos. Las variaciones del protocolo actual que presente también se proponen defectos de traslación para enfatizar su aplicabilidad general. A la luz de la evidencia de que la síntesis de proteínas aberrantes pueden estar involucrados en la patogénesis de los trastornos neurológicos emergente, este modelo ofrece la oportunidad de evaluar fácilmente este deterioro e identificar nuevos objetivos.

Introduction

Las proteínas son elementos esenciales de la vida celular y por lo tanto a mayor escala del organismo. Aseguran la mayoría de las funciones celulares, incluyendo la estructura, el transporte, la catálisis de reacción, la regulación, la expresión génica etc. Su expresión es el resultado de un complejo mecanismo de traducción permitiendo la conversión de un ARNm en proteína. La traducción se somete a diversos controles para adaptarse y para regular la expresión génica de acuerdo con las necesidades de células, durante el desarrollo y la diferenciación, el envejecimiento, estrés fisiológico o manifestaciones patológicas.

La traducción se divide en 3 fases (iniciación, elongación y terminación) y presenta 3 sistemas de traducción de iniciación con el fin de responder a estas necesidades: cap-dependiente, la tapa independiente a través del segmento de entrada al ribosoma interno (IRES) estructuras y capitalización Independiente potenciadores de traducciones ( CITE).

La mayoría de los ARNm eucarióticos se traducen en una gorra-dependent manera a través de la 7-metilguanosina tapa 5'-trifosfato que sirve como una función de reconocimiento durante la síntesis de proteínas. Esta tapa se une a eIF4E, un componente del complejo eIF4F con EIF4G1 y eIF4A. Asociado con otros socios como poli (A) proteína de unión (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA ^Met, estos factores de iniciación de traducción permite circularize ARNm y mejorar su accesibilidad a las formas 43S complejo hasta que el codón de iniciación AUG reconocimiento ^1. Este evento se corresponde con el final de la iniciación de la traducción es decir, el primer paso de la traducción.

Traducción-Cap independiente es utilizado por ARNm que codifica para proteínas esenciales bajo condiciones de estrés que inducen a la proliferación celular y la apoptosis instancia. Este mecanismo implica estructuras secundarias en el ARNm 5 'región no traducida (UTR) llama IRES, el extremo carboxi-terminal de EIF4G1 asociado con eIF4A y el complejo 43S. La unión de este 43S previo a la iniciación complex a IRES inicia la tapa traducción independiente sin la necesidad de factor de eIF4E ^2,3.

Finalmente, otro mecanismo de traducción todavía no se entiende bien apoya esta actividad traductora-cap independiente bajo condiciones de estrés a través de CITE estructuras ubicadas dentro de ARNm UTR ^4.

A través de estas diversas modalidades de traducción que difieren en sus etapas de iniciación, la traducción juega un papel crítico en la homeostasis celular y cualquier cambio en uno de estos procesos sería por lo tanto un impacto en el organismo con pequeña a los efectos de gran escala. De hecho, el inicio es un paso limitante de la velocidad que rige los procesos de traducción correctas de ARNm en proteínas y por lo tanto el objetivo de numerosos controles y puntos de regulación ^5. Ya sea para éste o para los componentes de estos procesos, si uno resulta ser defectuosa, se perturba el equilibrio establecido en la célula y por lo tanto podría llevar a condi patológicaciones. En este contexto, las mutaciones en factores de traducción han participado en varios trastornos que incluyen trastornos neurodegenerativos tales como `leucoencefalopatía con desaparición matter' blanco (eIF2B1-5 subunidad) ^6, en el síndrome de Walcott-Rallison (gen que codifica para EIF2AK3 PERK) ^7, potencialmente, en enfermedad (EIF4G1 p.R1205H) de Parkinson ^8. Por tanto, es importante llevar a cabo estudios celulares y moleculares de estas proteínas mutantes para aumentar nuestro conocimiento sobre el desarrollo de la enfermedad y en el proceso general de la iniciación de la traducción.

Para llevar a cabo estos estudios, es esencial para elegir los modelos más adecuados para observar las consecuencias de estas mutaciones Xenopus laevis están particularmente bien adaptados debido a sus propiedades fisiológicas y bioquímicas:. Sincronía fisiológica (bloqueado en la fase G2 del ciclo celular) , alta capacidad de síntesis de proteínas (200-400 ng / día / ovocitos), alto número de OOC extraídaytes de un mismo animal (800-1.000 ovocitos / hembra) y tamaño de la celda (01/02 a 01/04 mm de diámetro) que facilita su manipulación. La microinyección de oocitos de Xenopus con mRNA sintetizado se puede realizar fácilmente para diseccionar pasos de traducción. En esta vista se presenta otras ventajas. Dada la velocidad de progresión de la meiosis y de la traducción después de la microinyección de ARNm (~ 24 h), Xenopus ovocito representa un sistema rápido en comparación con los sistemas celulares reconstituidas (extraído de E. coli, los gérmenes de trigo o reticulocitos de conejo ...) en el que un mRNA es traducido con una velocidad de traducción reducida y a una velocidad inferior. Por lo tanto, los efectos de una mutación introducida en un mRNA serán rápidamente observable y estudiado fácilmente en varios ovocitos. Otra de las ventajas de los ovocitos de Xenopus es que los ARNm maternas están latentes y traducción de la proteína se bloquea antes de la estimulación de progesterona. La adición de la progesterona es, pues, un buen medio para controlar la inducción de traducción. P citoplasmáticaolyadenylation no se produce durante la ovogénesis. Se inicia durante la maduración de ovocitos en los ovocitos de progesterona estimulada en un orden temporal y continúa durante el desarrollo temprano y podría ser utilizado para estudiar los diferentes pasos de la traducción.

La poliadenilación del ARNm meses es de los primeros en aparecer y pertenece a Aurora A / Eg2, histona-Como B4 ARNm a la clase de genes "de maduración temprana" como se define en Charlesworth et al. (2004) ^9. La inducción de la traducción de ARNm "tardías", como la ciclina A1 y ciclina B1 se produce alrededor de la época de la ruptura de la vesícula germinal (GVBD). Mos ARNm codifica una serina / treonina proteína quinasa-. Su traducción es crucial ya que induce la cascada de MAP quinasa que activa indirectamente la maduración de los ovocitos. En efecto, en respuesta a la progesterona, la poliadenilación del mRNA MOS se mejora a través de un proceso que implica Aurora A / Eg2 proteínas reguladoras y otras proteínas de unión de ARN con THe 3'UTR del mRNA mos. Este aumento de la poliadenilación del mRNA MOS conduce a un aumento del nivel de proteína MOS, que a su vez activa MEK1. Este proceso media la activación de la quinasa extracelular de señalización reguladas 2 (ERK2) (Figura 1). Esta cascada de señalización puede entonces activar el M-fase de maduración promoción de factores, un complejo formado por Ciclina B y Cdc2 quinasa, y, finalmente, resulta en la reanudación meiótica.

Por lo tanto en oocitos de Xenopus laevis, el estudio de mRNA maternos tales como MOS fácilmente podría ser utilizado para poner a prueba su traducibilidad con varios puntos finales de su poliadenilación eficiente a la traducción de varios meses de señalización componentes, incluyendo también la determinación de la tasa de GVBD. Este sistema es, por tanto, interesante evaluar las primeras consecuencias de las mutaciones en los factores de iniciación de la traducción, sin interferencia de recién transcrito ARNm o de la eficiencia de la transfección, los problemas a menudo ocurren con eukaryestudios de células óticas.

Aquí, se establece un protocolo donde mRNAs EIF4G1 mutantes se microinyectaron en oocitos de Xenopus laevis y la traducción del mRNA materna se prueba. En la presencia de un defecto en la progresión de la GVBD, mos mRNA de poliadenilación que es esencial para la progresión a través del ciclo celular meiótica del ovocito y para la posterior traducción de mRNAs de clase tempranos y tardíos está comprobada. La fosforilación Aurora A / Eg2 y ERK también se estudia para confirmar la consecuencia de MOS deregulation.Thus, oocitos de Xenopus representan una forma sencilla de analizar las diferentes etapas de la traducción del ARNm.

Protocol

Todos los experimentos de Xenopus se realizaron en el animalario de la Universidad de Lille 1 de acuerdo con las normas de las directrices del Consejo de la Comunidad Europea (86/609 / CEE) para la experimentación en animales de laboratorio. El protocolo animal fue aprobado por la junta de revisión institucional local (Comité d'Ethique en Experimentación Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).

Manipulación 1. ovocitos

1. Preparar la solución anestésica: disolver 1 g de metano tricaína polvo sulfonato en un 1 litro de agua estéril.
2. Plunge hembra de Xenopus laevis en esta solución, Cubrir el vaso para evitar el escape y esperar aproximadamente 45 min para que el animal completamente sedado (sin ninguna reacción a una pizca de la pierna).
3. Lave la rana con jabón y enjuague con agua del grifo y luego colocar el animal en la espalda al papel de aluminio limpio.
4. Abrazadera de la piel de la parte lateral del abdomen y en el nivel de los ovarios con fórceps.Hacer una incisión de aproximadamente 1 cm con tijeras limpiadas antes de usarlo con etanol al 70%. Asegúrese de que la sección es lo suficientemente profundo y llegar a la pared abdominal subyacente para permitir la extirpación de tejido ovárico en el que se encuentran varios ovocitos en diferentes etapas de desarrollo.
5. Diseccionar los lóbulos de ovario, lavar 4 veces en una placa de Petri (50 mm) con medio ND96 (NaCl mM 96, 2 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 1,8 mM CaCl _2, 5 mM HEPES ajustó a pH 7,4 con NaOH, complementado con 50 mg / ml de estreptomicina / penicilina, 225 mg / ml de piruvato sódico, 30 g de inhibidor de tripsina de soja ml /, 1 l / ml de tetraciclina) para eliminar todos los rastros de la sangre y los residuos.
   Nota: La tetraciclina permite una conservación óptima y una buena recuperación después del tratamiento microinyección.
6. Guárdelos en una placa de Petri cubierta sumergida en el medio a 14 ° C, lo que permite su conservación durante una semana.
7. Coser la pared abdominal y la piel con el veterinario absorbible tHRead y una aguja de sutura (3 o 4 puntos de sutura serán necesarios).
8. Colocar el animal en un vaso sin agua y húmedas de la piel con agua del grifo hasta que la rana se está moviendo de nuevo. Cubrir el vaso para evitar el escape.
9. Separar cuidadosamente los lóbulos de ovario en el medio en grupos de 5 a 10 ovocitos mediante el uso de 2 pares de pinzas bajo un estereomicroscopio con un aumento de 10 veces. Seleccione ovocitos en etapa VI. Ellos pueden ser reconocidos por i) su forma y color con un polo animal pigmentada marrón y amarilla polo vegetativo separados por un cinturón claro ii) su tamaño superior a 1,2 mm de diámetro ^10.
10. Incubar los ovocitos seleccionados en una solución de colagenasa (1 mg / ml de colagenasa A de Clostridium histolyticum, se disolvió en ND96 sin tetraciclina) en una placa de Petri con agitación suave durante 45 min para facilitar la defolliculation ovocito (colagenasa digiere conexiones de las células foliculares de ovocitos /). Enjuague el ovocitos 3 o 4 veces con medio ND96 mantuvieron a 14° C.
    Nota: No incubar los ovocitos menos o más de 45 min debido a el riesgo de destruir proteínas de la superficie de ovocitos y de causar escasa viabilidad. Tratamiento con colagenasa puede inducir GVBD espontánea.
11. Incubar ovocitos en el medio durante 3-4 hr. Retire las células foliculares con pinzas finas bajo lupa binocular y mantenerlos a 19 ° C en medio ND96.

2. Preparación de mRNA Síntesis

1. Linealizar 5 g de los siguientes plásmidos mediante digestión enzimática utilizando Pme I enzima.
   NOTA: pcDNA6.2 / V5-DEST contiene un amino-ácidos ADNc EIF4G1 tipo salvaje 1599 (EIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST que contiene un ADNc dominante negativo EIF4G1 (EIF4G1-DN) con mutaciones c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - y c.2126T> G en la región de interacción entre EIF4G1 y eIF4E en la posición 612 a 618 de la proteína correspondiente perturbar el interacción between EIF4G1 y eIF4E ^8, pcDNA6.2 / C-EmGFP contiene cloranfenicol acetil transferasa (GFP). Preparar 2 mezclas para cada uno de los 3 plásmidos: el primero incluyendo Pme I enzima y el segundo sin enzima como control.
2. Precipitar el ADN plásmido utilizando un procedimiento de etanol clásica y resuspender en 20 l de H libre de nucleasa ₂ O.
3. Determine su concentración utilizando un espectrofotómetro. La concentración debe ser superior a 150 ng / l para transcribir cRNA.
4. Ejecutar 1 l de muestras y sus controles con 5 l de tampón de carga en un gel de agarosa al 0,8% para verificar la linealización del plásmido.
5. Utilice un kit para la transcripción in vitro y la purificación cRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cRNA transcritas se resuspenden en 20 l de H libre de nucleasa ₂ O. Las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C si es necesario.
6. Preparar el tampón de migración MOPS 10X que contiene 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mAcetato de sodio M y EDTA 10 mM (pH 8,0). Esterilizar la solución con un filtro de 0,45 micras. Almacene la solución protegido de la luz a temperatura ambiente para evitar la oxidación solución.
7. Limpiar la cubeta de electroforesis sucesivamente con NaOH, HCl y completamente enjuagados con agua de doble filtrado para una O / N para evitar la RNasa y prevenir la degradación del ARN.
8. Reparto de un gel de agarosa al 1,5% que contenía MOPS y formaldehído. Caliente hasta la disolución de agarosa completo y deje que se enfríe a 55 ° C. Bajo campana de humos, añadir 0,1 volúmenes de MOPS 10X, 6,6% de formaldehído y 4 g de bromuro de etidio (10 mg / ml). Verter el gel bajo la campana de humos y esperar aproximadamente 1 hora para el gel se endurezca.
   Nota: El formaldehído y bromuro de etidio son tóxicos.
9. Preparar las muestras para la migración en un tubo de 0,2 ml con 1 l de cRNA, 8,8% de formaldehído, 60% de formamida y 0,1 volumen de MOPS 10X. Incubar durante 3 min a 70 ° C y poner los tubos en hielo durante 10 min. Centrifugar las muestras pocos segundos a5.000 x g. Añadir 2 l de tampón de carga de gel.
   Nota: La formamida es tóxico.
10. Ejecutar las muestras durante 20 minutos a 90V. Remoje el gel en H ₂ OO libre de nucleasa / N para destain el gel antes de analizarla para comprobar la calidad cRNA.
11. Determinar la concentración cRNA utilizando un espectrofotómetro y almacenar a -80 ° C.

3. La microinyección de RNA sintetizado y ovocitos Maduración Estimulación

1. Preparar el material necesario para la microinyección de ovocitos. Utilice un extractor de micropipeta para tirar pequeño capilar de vidrio. Bajo microscopio estereoscópico, rompa la extremidad del capilar con las pinzas para crear un extremo romo. Llene la micropipeta capilar con aceite mineral usando una jeringa de 1 ml con un filtro Millipore de 0,45 micras en el extremo opuesto. Monte la micropipeta en la pipeta de microinyección. Elija una micropipeta precisa calibrado por el fabricante para dar una buena precisión cuando se utiliza con capilar de vidrio apropiado.
2. Realice microinyección 1-2 horas después de defolliculation, el retraso necesario para la recuperación de los ovocitos en ovocitos mantiene a 14 ° C. Platos Uso de Petri con la parte inferior rasparon con una pinza para crear una superficie adhesiva de ovocitos y llenarlos con medio ND96.
3. Organizar ovocitos a lo largo de un carril de raspado en una placa de Petri que permite una inyección sucesiva de ovocitos con la micropipeta capilar en un ángulo de 45 ° C.
4. Inyectar en la zona ecuatorial del ovocito, por debajo de la zona de animales pigmentada para una difusión óptima de las muestras en el citoplasma. Inserte sólo la parte más delgada de punta capilar de aproximadamente 150 a 200 micras de profundidad.
5. Inyectar 30 ng de ARNc obtenido, respectivamente, a partir de los diferentes plásmidos en un volumen de 60 nl en una primera ovocito. Después de la inyección, espere 5-10 segundos antes de retirar la punta capilar para evitar el escape de la muestra (Figura 2A).
   Nota: No exceda 120 nl. Inyectar tan lentamente como pueda. Se recomienda un control con agua destilada.
6. Mueva manualmente la placa de Petri para inyectarse la siguiente ovocito.
   Nota: Asegúrese de que la punta no esté obstruido mediante la generación de un pequeño pulso de la solución del baño después de 2 a 3 microinyecciones.
7. Transferencia inyectado ovocitos en 24 pozos de placas de cultivo (10 ovocitos / pocillo) lleno con 3 ml de medio ND96 fresco y dejarlos a 19 ° C.
8. Incubar los ovocitos en ND96 con progesterona (PG) (2 mg / ml) para desencadenar la maduración meiótica (GVBD) a 19 ° C, 15 horas o 4 horas después de la microinyección de ARNc poliadenilados obtenidos respectivamente a partir de pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 y pcDNA6 0,2 / C-EmGFP utilizó como control (Figura 2A).
   Nota: Co-inyección de marcador fluorescente con el cRNA es una buena herramienta para asegurar que el cRNA se inyectó y se mantuvo en el ovocito. Realizar este tipo de experimentos preliminares utilizando un ARNc de interés con una etiqueta de las buenas prácticas agrarias.
9. Microinyectar como en # 3.5 diferentes proporciones (1: 3; 2: 2, 3: 1) de polyadenylated EIF4G1-WT y EIF4G1-DN ARNc con el fin de Test el efecto de conversión de ARNc EIF4G1-WT en el fenotipo mutante (Figura 2D).

4. Vesícula Germinal Desglose Determinación

1. Cuente el número de ovocitos maduros después de la estimulación PG mediante la observación de la presencia de una mancha blanca en el polo animal negro con un microscopio estereoscópico. Repita el contar cada hora hasta la vigésimo cuarta hora (Figura 2B, 2C).

5. Western Blot (WB) Análisis

1. Homogeneizar el grupo de 10 ovocitos por un lado a otro los movimientos con una punta de micropipeta, a 4 ° C en 200 l en el siguiente tampón: Hepes 50 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, 0,05% SDS, 5 mM MgCl _2, 1 mg / albúmina de suero bovino ml, 10 mg / ml de leupeptina, 10 mg / ml de aprotinina, 10 mg de inhibidor de tripsina de soja / ml, 10 mg / ml de benzamidina, 1 mM PMSF, vanadato de sodio 1 mM.
2. Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 10.000 xg para eliminar los lípidos (fase superior) y la membrana (fase inferior) fracciones. Recoger la fracción citoplásmica, almacenar una parte alícuota para determinar la concentración de proteína y completar el restante con Laemmli o un tampón de muestra de Bis-Tris (1: 1).
   Nota: Bis-Tris geles y tampón de carga tienen un pH más neutro que protege a las proteínas de la hidrólisis
3. Calentar 20 g de la muestra a 95 ° C durante 10 min. Cargar cada muestra en los pocillos del gel de acrilamida. Colocar el gel en un tanque con tampón apropiado.
4. Realizar una electroforesis durante 1 hora a 200 V.
5. Realizar un WB en TBS pH 8,0 (HCl Tris 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, que contiene 10% de albúmina de suero bovino) con un anticuerpo de cabra anti-Aurora A / Eg2 (1: 3000, 2 hr) o con un anti-conejo -Aurora A / Eg2-P (1: 1.000, O / N a 4 ° C), ratón anti-ERK2 (1: 3000, 2 hr), cabra anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 hr ), conejo anti-mos (1: 5000, 4 h), conejo anti-GFP (1: 3000, 2 horas) antibodies.Use anticuerpos de ratón anti-V5 (1: 10.000, 2 h) y de conejo anti-Rsk (1 : 1000, 2 hr) (como controles de carga).
6. lavarla membrana 3 veces durante 10 minutos en TBS-Tween y se incuban 1 h con o bien un anti-ratón o anti-conejo o anti-cabra (IgM) con peroxidasa de rábano anticuerpo secundario marcado a diluciones de 1: 5000, 1: 7500 y 1 : 5000, respectivamente.
7. Realizar 3 lavados de 10 min en TBS-Tween y detectar los complejos antígeno-anticuerpos con el sistema de Detección Avanzada de ECL.

6. Polyadenylation Ensayo

1. Muestra 5 ovocitos por condición en un 1,5 ml. Lavarlos con 1 ml de PBS libre de nucleasa 1X (pH 7,4). Los siguientes pasos se realizan bajo campana de humos.
2. Extracto de ARN utilizando un procedimiento orgánica clásica (ver instrucciones del fabricante).
3. Recuperar ARN por centrifugación (10.000 xg) durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y el ARN secar al aire durante 10 min.
4. ARN Resuspender pellet en 30 l de H libre de nucleasa ₂ O.
5. Tomar 15 l de muestras en un tubo nuevo y añadir 85 l de H libre de nucleasa ₂ O. Limpiar elmuestras en sí para mejorar su calidad en la columna de sílice de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir el ARN utilizando 30 l de H libre de nucleasa _{2 O}
6. Ejecutar 1 l de las muestras con 5 l de tampón de carga en un gel de agarosa al 0,8% para comprobar la integridad del ARN.
7. Determinar la concentración de ARN usando un espectrofotómetro.
8. Preparar 2 mezclas de ligación por condición (es decir, EIF4G1-WT, EIF4G1-DN y el H ₂ O control) con los siguientes reactivos: 10 U de ARN ligasa, 0,1 volumen de tampón 10X, ATP 1 mM, 10% de PEG8000 50% , 0,1 g de imprimación P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') ^{11 y} llevar el volumen final de 10 l con H libre de nucleasa ₂ O. Añadir en el primer ARN mezcla obtenida a partir de oocitos sin estimulación PG y en el segundo ARN mezcla obtenida a partir PG estimulado ovocitos.
9. Incubar durante 1 hora a 37 ° C y luego durante 20 min a 65 ° C para inactivar la enzima.
10. Nosea cDNA transcripción inversa (RT) kit. Preparar la mezcla de RT, por tubo: 0,1 volumen de tampón 10X RT, 0,1 g de cebador P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) ^10, mezcla de 4 mM dNTP, 50 U de transcriptasa inversa y completo con libre de nucleasa H ₂ O hasta el volumen final de 10 l. Añadir 10 l de reacción de ligación obtenida previamente. Realice la RT en las condiciones descritas por el fabricante.
11. Preparar Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) mezcla, por tubo: 0,1 volumen de tampón 10X, 1,5 mM de MgCl _2, 133 mM mezcla de dNTP, 0,2 mM cebador específico, 0.2 M de cebador P2, 0.025 U Taq polimerasa, 1 l de cDNA y completo con libre de nucleasa _H 2 O a volumen final de 50 l. Realizar la PCR bajo las siguientes condiciones: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, [95 ° C durante 1 min, 56 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg] * 40 ciclos, 72 ° C durante 10 minutos ^9. Los cebadores específicos son los siguientes: MOS, GB4 TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA histona-como, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Ciclina A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Ciclina B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT ^9.
12. Preparar un gel de agarosa al 3%. Añadir en cada uno de los productos de PCR de 10 l de tampón de carga. Ejecute el gel con 10 l de las muestras a 110 V para una migración óptima. Analizar el gel después de 10 y 20 min para observar un cambio de tamaño que refleja la longitud de la cola poli (A) y por lo tanto la maduración de ARN que es un requisito previo para su traducción.

Representative Results

Kinetic la maduración de ovocitos de Xenopus y determinación del porcentaje de ovocitos GVBD después de 24 h de estimulación PG (Figuras 2B, 2C):

Con el fin de estudiar las consecuencias de traslación de la mutación EIF4G1-DN, la respuesta a PG en oocitos de Xenopus laevis microinyectados con cRNA EIF4G1-DN se compara con EIF4G1-WT y a otras condiciones de control (H ₂ O, GFP). Los controles permiten evaluar la incidencia de la microinyección de ovocitos, independientemente de la naturaleza de cRNA inyectada o de EIF4G1 sobreexpresión.

Los maduraciones cinéticos de 10 ovocitos caracterizadas por condiciones de control microinyectados (H ₂ O y GFP) son similares a WT y el número de sufrir GVBD están muy cerca el uno al otro a las 12 y 24 horas después de la estimulación PG (Figura 2B). Después de 24 horas, la maduración de ovocitos alcanza el 95,7% en el caso WT, el 97,1% de H ₂ O y 97,5% para las buenas prácticas agrarias (Fi figura 2C). Por lo tanto, microinyecciones con H ₂ O o de control ARNc o ARNc EIF4G1 tienen poco efecto sobre la liberación de la meiosis del ovocito. A la inversa 8 hr después de la estimulación PG, el número de ovocitos microinyectados con ARNc EIF4G1-DN sometidos a GVBD se retrasa en comparación con EIF4G1-WT ARNc (Figura 2B) .La liberación meiosis de EIF4G1-DN frente ovocitos EIF4G1-WT disminuye significativamente por 85,8% y 77.4% a las 12 horas y 24 horas después de la estimulación PG, respectivamente (Figura 2C). También es de destacar que 13 hr después de la estimulación PG, el número de oocitos maduros alcanza un máximo para todas las condiciones excepto para EIF4G1-DN para los cuales se logra la máxima sólo 20 hr después de la estimulación PG. Así, la presencia de la mutación EIF4G1-DN conduce a la liberación más pobre meiosis de los ovocitos en comparación con EIF4G1-WT.

Restauración de la maduración de ovocitos en presencia de EIF4G1-DN gracias a la EIF4G1-WT (Figura 2D):

_content "> Para determinar si los menoscaba EIF4G1-DN cRNA microinyección o bloquea la maduración de ovocitos, diferentes proporciones de ARNc EIF4G1-WT y EIF4G1-DN se-microinyectaron co. En estas condiciones, un aumento de la maduración de ovocitos se observa como los niveles de EIF4G1-WT cRNA subir y los de EIF4G1-DN cRNA decrease.While maduración se observó en el 17,5% de los ovocitos con una dosis de ARNc EIF4G1-DN, este porcentaje alcanza el 76,7% con el co-microinyección de 3 dosis de EIF4G1-WT ARNc y la presencia de una dosis de EIF4G1-WT ARNc conduce a 95% de la maduración de ovocitos. Este experimento muestra que el defecto maduración de oocitos de Xenopus microinyectados con EIF4G1-DN no es irreversible y puede ser restaurada parcialmente.

Mos de expresión observados en las proteínas de señalización WB como un indicador de la capacidad de traducción antes y después de la estimulación PG (Figura 2E):

El nivel de proteína de V5-tag en ovocitos expresando EIF4G1-WT y eIF4G1-DN son similares que refleja la eficiencia microinyección similar. El nivel de proteína Rsk utilizado como control de carga de proteínas también es similar en todas las condiciones antes y después de la estimulación PG. La expresión de la proteína GFP también está presente en ovocitos microinyectados con GFP cRNA estimulado o no con PG. Estos datos indican que la microinyección y la sobreexpresión de eF4G1 no perturban la traducción de GFP. Sin embargo, ninguna expresión de la proteína GFP es detectable antes y después de la estimulación PG en ovocitos que expresan el EIF4G1-DN. Como era de esperar, la expresión endógena MOS no es detectable en ausencia de estimulación PG. Además, mos expresión se observó en el EIF4G1-WT y H ₂ O las condiciones de control después de la estimulación PG, de acuerdo con los resultados anteriores que muestran que la sobreexpresión de EIF4G1-WT tiene pocas consecuencias sobre mos endógenos ^16. A la inversa, una disminución considerable de meses expresión es notable después de la estimulación PG.

El PROtein expresión de algunos componentes de los MOS cascada de señalización también se prueba. Por ejemplo, Aurora Una proteína / Eg2 actúa aguas arriba de Mos inducción y sin detección de su desregulación proteína o de su forma fosforilada inducida después se observa estimulación PG. A la inversa, una desregulación de ERK2 fosforilación inducida por MOS se observa en la presencia de EIF4G1-DN.

Estos resultados sugieren que la expresión endógena de ARN mos en la proteína y la activación ERK2 dependiente de MOS se ven afectados por la expresión de EIF4G1-DN.

La poliadenilación de ARNm (Figura 2F):

Polyadenylation de varios ARNm (MOS, ciclina A1, B1 y ciclina-histona como B4) necesarias para la recuperación de oocitos de Xenopus meiosis se puso a prueba. El ensayo realizado permite definir si un aumento en el tamaño amplímero correspondiente a la longitud de la cola poli (A) del ARNm está presente después de la estimulación PG. De hecho, con PG estimulación de la adición de un poli (A) de la cola se observó en todas las condiciones, incluyendo la mutación EIF4G1-DN.

Figura 1. Esquema general de la activación de la cascada MAPK. Tras la estimulación hormonal por PG rápidos cambios en las actividades de varias enzimas se producen entre ellos los de la Aurora A / Eg2 y vía CPEB. Hiperfosforilación de Aurora A / Eg2 conduce a CPEB (unión proteína citoplasmática Polyadenylation Element) fosforilación. CPEB fosforilada reconoce el CPE (poliadenilación citoplasmática Element) en 3'UTR de ARNm meses, recluta CPSF (escisión y poliadenilación Factor Especificidad) y activa ARNm poliadenilación por PAP (poli (A) polimerasa). Estimulación PG también promueve sucesivamente Maskin fosforilación a través tanto de la acción de PKA y cdk1, Maskin / disociación eIF4E y asociación eIF4E / EIF4G1. EIF4G1 recluta transsocios de iniciación lación incluyendo PABP que interactúa con EIF4G1 y reconoce el poli (A) de la cola. Una vez sintetizados, mos activa MEK / MAPKK por fosforilación, que a su vez, activa ERK2 / MAPK por fosforilación. Esta llamada cascada de MAPK está implicada en los procesos meióticos controlando cinética entrada M-fase, la morfogénesis husillo y la inhibición de la síntesis de ADN. La cascada está incrustado en un bucle de realimentación positiva que sostiene la síntesis de proteínas. Hay que señalar que MOS no es la única proteína solicitado ser sintetizado para la activación GVBD; es decir, ciclina B se requiere para ser traducido para el logro de maduración.

Figura 2. El EIF4G1-DN mutante afecta a la maduración de ovocitos y la traducción en Xenopus laevis. RNA derivado de plásmidos que codifican proteínas EIF4G1 V5-etiquetados (WT y DN) sonmicroinyección en oocitos de Xenopus laevis. Después de 15 h, la maduración de los oocitos se estimula por la progesterona (PG) (Los experimentos se realizaron al menos 3 veces y los resultados representativos se muestran). (A) Schematicoverview de protocolo de experimentación. Las inyecciones de EIF4G1 y / o GFP ARNc están representados por puntas de flecha antes de la estimulación PG. Las muestras para análisis ARN y las proteínas se han obtenido a los 2 puntos de tiempo (estimulación PG y al final de la cinética GVBD). (B) Kinetic maduración de 10 ovocitos caracterizadas por GVBD se prueba durante 24 hr después de la estimulación PG. Un retraso en la maduración de ovocitos se observa en oocitos microinyectados con EIF4G1-DN ARNc en comparación con aquellos con microinyección EIF4G1-WT ARNc (C) Porcentaje de ovocitos maduros 24 h después de la estimulación PG (n = 4; * p <0,05).. Una disminución en la maduración de ovocitos se observa en los microinyectado con EIF4G1-DN ARNc comparación con EIF4G1-WT ARNc. (D) Reversioevaluación fenotipo n de ovocitos microinyectados con EIF4G1-DN ARNc mutantes y ARNc EIF4G1-WT que muestran que la maquinaria de traducción sigue siendo funcional cuando se añade EIF4G1-WT a la mutante. (E) Las proteínas se extraen de los ovocitos y sus niveles determinados por análisis de inmunotransferencia . Las perturbaciones de la fosforilación ERK2, mos y la expresión de GFP en las condiciones EIF4G1-DN se observan. (F) Polyadenylation de meses, ciclina A1, ciclina ARNm B4 B1 y-histonas como de ovocitos estimuladas o no con PG observado después de la amplificación por PCR y la migración en 3% en gel de agarosa. Después de la estimulación PG, se detecta un aumento en el tamaño> 100 poliadenilación para todas las condiciones. El primer carril corresponde a la escalera.

Discussion

La traducción es un mecanismo implicado en la fisiopatología de numerosos trastornos humanos, incluyendo varias enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo en la enfermedad de Parkinson varios informes sugirieron que el deterioro en la traducción asociada con mutaciones hereditarias ^8,12,13.

Varios modelos celulares están disponibles para estudiar la traducción. Aquí, con el fin de estudiar las consecuencias de traslación de una mutación en EIF4G1 que actúa como dominante negativo mutación reducir la interacción entre EIF4G1 y eIF4E socios ^{8, el} Xenopus laevis se utiliza ovocito. Este modelo tiene las ventajas de simplicidad, ya que se compone de sólo una única célula gigante facilitar la microinyección de mRNA sintético, que conduce a una cantidad considerable de material para experimentos bioquímicos y facilitar las observaciones macroscópicas de las diferentes fases de maduración de los ovocitos. Este proceso es también eficiente en el tiempo en comparación con las células establesgeneración de la línea. Por otra parte, varios protocolos de preparación de los ovocitos y ARN microinyecciones ya se han descrito, en particular, para el estudio del ciclo celular o el transporte nucleocytoplasmic ^14,15. En cuanto a los límites de tales protocolos para el estudio de la traducción, se debe tomar una especial atención en cuanto a la concentración de ARNm. Esta concentración no debe ser alta (no superior a 30 ng en 120 máximo nl) a fin de no saturar el proceso de traducción. Teniendo en cuenta este elemento, Xenopus ovocito es un modelo atractivo para estudiar la traducción de proteínas como atestiguan los datos presentados en la Figura 2 con una forma mutante de EIF4G1 transcripción.

De hecho, en la presencia de la EIF4G1 mutado, se observa deterioro en la traducción de la proteína mos y se correlacionó con una disminución de 90% de GVBD en comparación con WT y para controlar las condiciones. Por el contrario, la sobreexpresión de EIF4G1-WT no dio lugar a la modificación en el nivel oTraducción f mos de acuerdo con datos de la literatura ^16,17.

Varias modificaciones biológicas podrían explicar estos resultados. Sabiendo que Mos ARNm son de origen materno y ya transcrito antes de la activación de la meiosis por PG, los mecanismos perturbadas deben ocurrir entre los pasos de transcripción y traducción. , Traducción Cabe destacar MOS es el resultado de una cascada de eventos moleculares que se inician a partir de un mRNA latente sin poli (A) de la cola a la adición de la cola después de la estimulación PG para su traducción ^18,19. Por lo tanto, varios escenarios son posibles, incluyendo: defectos de iniciación de la traducción podría sospechar que la causa de este fracaso, o defectos de la fosforilación del factor que lleva a Mos ARNm poliadenilación, o incumplimiento de ARNm de poliadenilación de los transcritos mos por sí misma podría dar lugar a una disminución de traslación.

Para evaluar estos 2 últimos mecanismos, se examina la expresión de estos factores por WB. Expresarlos niveles de iones de fosforilada Aurora A / Eg2, responsable de la fosforilación CPEB no mostraron alteración en la presencia de la EIF4G1 mutado. En el mismo sentido, mos mRNA de poliadenilación u otro de poliadenilación del ARNm se observa en la presencia de la EIF4G1 mutado después de la estimulación PG (Figura 2F). Para confirmar aún más el perfil de poliadenilación experimentos de transferencia Northern se recomienda, así como la realización de aislamiento gradiente de sacarosa de polisomas con el fin de establecer si la contratación de ARNm para ribosoma puede ocurrir ^16.

Por lo tanto, mediante el estudio de los primeros y últimos elementos de la cascada, la etapa perturbado se sospecha que es aguas abajo de la ocurrencia de poliadenilación. También es importante comprobar si el defecto mos expresión dio el impacto esperado en la fosforilación de ERK2. En presencia de la mutación, la disminución de la expresión MOS condujo a una disminución del nivel de ERK2 fosforilados y por consiguiente a un defecto enla progresión GVBD (Figura 1 y 2E). Por lo tanto, la mutación EIF4G1 se asocia a una disminución prevista de la traducción mos. La deleción del dominio de unión eIF4E en secuencia EIF4G1 en el EIF4G1-DN es probablemente responsable de una disminución en las interacciones EIF4G1 / eIF4E como se sugirió anteriormente por un estudio de co-inmunoprecipitación ⁸ que podrían perturbar la formación de complejos eIF4F.

Este protocolo tiene varias aplicaciones interesantes en la biología celular. Esta configuración es ideal como investigaciones preliminares para una serie de cuestiones fundamentales en la biología celular, tales como: para comprender mejor el papel de los dominios específicos de factores de iniciación y definir aquellas que son esenciales para la traducción in vivo o la maduración de ovocitos. En este contexto, Wakiyama et al. (2000) demostraron la importancia en la maduración de ovocitos de la región amino-terminal de EIF4G1 que contienen los dominios de unión para eIF4E y PABP ^17; para estudiar splicción de la iniciación factores de ^20; descifrar los mecanismos utilizados por los virus secuestro de maquinaria de traducción de acogida para sus fines a través EIF4G1 escisión, por ejemplo, con la inhibición de las estructuras de la tapa que dependen de traducción e IRES de su ARNm, traducido en la tapa independiente de forma ^21; para estudiar el papel de la mutación en los factores de conversión en el ciclo celular ya que los ovocitos son modelos de elección para estos estudios ^22; para estudiar los principales mecanismos que regulan la iniciación de la traducción, es decir, cap-dependiente y la tapa independiente para definir si uno o varios sistemas están involucrados en una perturbación síntesis de proteínas. Varias variaciones del protocolo actual podrían ser fácilmente aplicados para alcanzar estos objetivos, incluyendo la determinación de la eficiencia de la traducción por la puesta de sol method23 o reportero ARNm microinyección. Por ejemplo, el uso de un mRNA bicistrónico reportero que contiene un primer cistrón en el que la luciferasa de Renilla será la tapa que dependen traducidamientras que el segundo cistrón contiene luciferasa de luciérnaga se traduce a través de IRES estructuras deben permitir definir la modalidad de iniciación a presentar defectos y / o compensaciones finas para mantener la homeostasis de traducción. Además, este tipo de experimentos ARN reportero luciferasa ofrecen la ventaja de no depender de potencial de alteración mecanismos de desarrollo especializados, debido a los mecanismos de conservación incompletos con humanos.

En paralelo a estas preguntas fundamentales, dicho protocolo se podría aplicar como un primer paso para hacer frente a condiciones perjudiciales que podrían contribuir a los trastornos neurológicos. En condiciones fisiológicas, los pasos de iniciación de traducción son los blancos privilegiados de regulaciones bajo condiciones de estrés, como la oxidación, la hipoxia, el cambio de temperatura, irradiación y la privación de nutrientes. En tales condiciones, una traducción selectiva de las transcripciones que codifican proteínas que son esenciales contra el estrés y la supervivencia celular se produce.Cuando se siente abrumado este proceso, las tensiones se convierten en patológicos y participa activamente en el desarrollo de varias afecciones neurológicas. Estresores celulares están implicados en numerosas enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y las enfermedades de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad priónica (Creutzfeldt-Jakob) ^{24 y} estas tensiones inducen la activación de la respuesta de la proteína desplegada (UPR). Uno de estos mecanismos del EPU conduce a una disminución de la traducción a través de la activación de PERK y la fosforilación de la subunidad eIF2α con las consecuencias de dejar de traducción al impedir la unión entre eIF4F y 43S complejos de ^25. En los ovocitos de Xenopus, la adición de agentes oxidantes y / o genes mutados se sabe están asociados a este tipo de patologías que imitan estas tensiones y establecer si los genes mutados pueden afectar los procesos de traducción. En la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, la introducción de EIF4G1 p.R1205H en Xenopnos ovocito asociados o no a factores de estrés oxidativo o el análisis de todo el genoma de los perfiles polysomal ARNm podría abordar la cuestión de la participación de la traducción en la fisiopatología ^26.

Todas estas aplicaciones aplicadas al ovocito por lo tanto representan un gran campo de posibilidades para estudiar trastornos de traducción que ahora se sabe que están asociados a varias afecciones incluyendo los trastornos neurodegenerativos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine methane sulphonate	Sandoz	MS-222	oocytes handling
Forceps	Moria	Dumont MC40
Streptomycin/penicillin	Sigma	781
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Tetracyclin	Sigma	T7660
Veterinarian absorbable Vicryl thread	Johnson&Johson Intl	JV1205
Collagenase A	Roche diagnostics	10103586001
PmeI	New England Biolabs	R0560S	Preparation of synthetic mRNA
DNAse/RNAse free H2O	Life Technologies	10977
Sodium Acetate	Merck	6268
Absolute ethanol	Sigma	02854
Nano Drop	Thermo Scientific
TBE 10X	Eppendorf	0032006.507
Ethidium bromide 10 mg/ml	Life Technologies	15585-011
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion by Life Technologies	AM1344
MOPS	Sigma	M1254
EDTA	Fluka	03609
Agarose	Life Technologies	16500-500
Formaldehyde 37%	Merck	1.04003.1000
Formamide	Fluka	47671
Gel Doc Imager	Biorad
Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-510-X	microinjection
Replacement Glass 8"	Drummond Scientific Company	3-000-210-G8
0.45 µm filter	Millipore	SLHA025NB
Progesterone	Sigma	P0130
Hepes	Sigma	H3375	Western Blot
NaCl	Sigma	S5886
SDS	Biorad	161-0301
MgCl2	Sigma	A3294
Bovine serum albumin	Sigma	A4612
leupeptin	Sigma	L8511
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6506
PMSF	Sigma	P7626
sodium vanadate	Sigma	S6508
Laemmli buffer	Biorad	161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well	Life Technologies	NP0323BOX
SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX	Biorad	456-1036 and -1096
horizontal semi-dry blotting system	W.E.P. Compagny
Glycine	Biorad	161-0718
Tris-HCl	Biorad	161-0719
Hybond ECL Membrane	Amersham Life Science	10401180
Methanol	VWR	20846-292
Ponceau Red (0.5%)	Sigma	P3504
Tween 20	Sigma	P2287
anti-GFP	Life Technologies	A11122
anti-V5	Santa Cruz Biotechnology	sc-58052
anti-Eg2	Santa Cruz Biotechnology	sc-27884
anti-Eg2-P	Cell Signaling	C39D8
anti-ERK2	Santa Cruz Biotechnology	sc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7976
anti-Rsk	Santa Cruz Biotechnology	sc-231
anti-mos	Santa Cruz Biotechnology	sc-86
anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2812
anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2378
Advanced ECL Detection System	Amershan Life Science	RPN2135
PBS 1x	Sigma	P4417	polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)	Qiagen	79306
Chloroform	Sigma	31998-8
Isopropanol	Sigma	278475-1L
RNeasy mini kit	Qiagen	74106
RTL buffer	Qiagen	79216
RNAse free DNAse set	Qiagen	79254
Primers	Eurogentec
T4 RNA ligase 1	New England Biolabs	M0204S
High capacity c-DNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems, Life Technologies	4368813
Taq polymerase	Life Technologies	10342020