Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية

Published: April 9, 2015 doi: 10.3791/52726

Introduction

زراعة الخلايا العضلية من هي أداة حاسمة في مجال البحوث القلب الحديث. وتستخدم العضلية الفئران حديثي الولادة (NRCMs) عادة منذ العزلة والثقافة هو أسهل من أن الخلايا العضلية الفئران البالغة 1. طريقة NRCM لا يزال لديه العديد من القيود بما في ذلك إجراء العزل الطويل وتكاثر الخلايا محدود في الطبق. هناك العديد من البروتوكولات لعزل NRCMs مع تتطلب أكثر عموما 4-48 ساعة عمل 2-6. وبالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما عزل الخلايا من 1 إلى الفئران الوليدة العمر 2-يوم 2،4-7. توقيت الولادة لا يمكن التنبؤ والصراع مع الأعمال الأخرى في المختبر. يمكن أن العزلة تكون غير فعالة والإسراف إذا كانت هناك حاجة فقط كمية صغيرة من الخلايا لإجراء التجارب. معظم الجهود على تحسين تركيز العمل على الحد من الوقت العزلة، ولكن هذا لا يحل مشاكل توقيت ولادة الجراء.

كبدائل، العديد من المعامل تستخدمالعضلية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) أو الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). ومع ذلك، يمكن لعملية إعادة برمجة و / أو التمايز يكون وقتا طويلا جدا ومكلفة أيضا. يمكن أن يكون هناك مشاكل أخرى عند استخدام هذه الخلايا كما هو الحال في المختبر نماذج العضلية. وقد تبين أن كلا ESC- وiPSC- العضلية المشتقة لعرض الاختلافات في الكهربية من العضلية الأولية 8-10.

NRCMs فصلها هي قادرة على يجري تخزينها لعدة أيام باستخدام التبريد 11، ولكن هذا لا يسمح للتخزين على المدى الطويل. وعادة ما تستخدم النيتروجين السائل للحفاظ على خلايا لفترة أكبر من الوقت، ولكن يتطلب مثل cryoprotectant كما سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). وقد أظهرت أبحاث سابقة أن تركيز المثالي بين 5-10٪ DMSO في وسائل الإعلام تجميد يسمح الحفظ بالتبريد من NRCMs، ولكن حتى ذلك الحين جدوى لا يزال منخفضا 12. وعلى الرغم من DMSO يساعد على حماية الخلايا أثناء مجانازينغ، فإنه يمكن أن تكون سامة لخلايا بتركيزات فوق 1.5٪ 13. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إزالة ببطء DMSO من الخلايا، قد يحسن خلية حيوية 14.

سعينا لتحسين كفاءة المقايسات خلية مقرها NRCM التي كتبها cryopreserving الخلايا التالية العزلة. وهذا يسمح للخلايا ليتم إذابة واستخدامها عند الضرورة، والحد من وتيرة العزلة واستهلاك الحيوانات. باستخدام هذه الطريقة، وتبين لنا أنه من الممكن أن cryopreserve NRCMs وذوبان الجليد من أجل استخدامها في وقت لاحق. بعد ذوبان الحفاظ على الخلايا على البقاء مقبولة وتنتج الثقافات NRCM التي هي ايجابية لل-α الساركومير actinin (α-SA) والعقد من تلقاء أنفسهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تصميم بروتوكول التالية لعزل العضلية من القمامة واحدة من الفئران الوليدة حديثي الولادة (10-14 الجراء). إذا كان حجم القمامة تختلف اختلافا كبيرا، قد يكون الإجراء لزيادتها لتعويض. وينبغي أن تكون الجراء حوالي 48 ± 6 ساعة القديم. هنا وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي كتبها ولاية كارولينا الشمالية جامعة ولاية المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. خلية عزل إعداد

ملاحظة: إجراء الخطوات التالية قبل العزلة اليوم.

  1. الأوتوكلاف ما يلي: مقص كبير، مقص صغير، ملقط حادة الصغيرة، وملقط كبيرة. استخدام دورة الجاذبية لمدة 60 دقيقة كحد أدنى من 121 درجة مئوية، ووقت التجفيف من 30 دقيقة.
  2. ضع 40 مل من 0.1٪ محلول التربسين في الثلاجة لذوبان الجليد O / N. بردت هانك أملاح المتوازنة الحل (HBSS) إن لم يكن البرد بالفعل. إعداد 20٪ الجنين مصل بقري (FBS) حل وسائل الإعلام الأسهم.
    1. في 400 مل من تكاليف الدعم غير المباشروسائل الإعلام اوفه في التعديل Dulbecco و(IMDM) إضافة 100 مل FBS، 5 مل L-الجلوتامين (200 ملي)، 2.5 مل جنتاميسين (10 ملغ مل -1)، و 0.9 مل 2-المركابتويثانول. تعقيم باستخدام فلتر فراغ. متجر وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع، وهذا هو تحجيم لحجم أصغر أو أكبر. تمييع 20٪ FBS وسائل الإعلام الأسهم 1: 1 مع IMDM لإنتاج 10٪ FBS NRCM سائل الإعلام. جعل فقط في دفعات صغيرة لمنع تكرار التدفئة والتبريد وسائل الإعلام.

عزل 2. خلية يوم 1

  1. أداء العمل التالية في الثقافة هود لمنع تلوث العينات. للحصول على أفضل توقيت بدء هذا العمل في فترة ما بعد الظهر منذ هناك O / N الحضانة.
  2. إعداد مساحة العمل داخل غطاء الثقافة العقيمة. وضع وسادة مقعد في الثقافة غطاء محرك السيارة. ملء اثنين 250 مل الأكواب مع 70٪ من الإيثانول ووضع الأدوات الجراحية في نفوسهم. وضع دلو صغير من الجليد في غطاء محرك السيارة. ضمان أن تكون كبيرة بما يكفي لعقد عدة أنابيب وطبق 150 ملم. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم غطاء محرك السيارة FOص 10 دقيقة. وضع 40 مل 0.1٪ التربسين على الجليد.
  3. استرداد الفئران الوليدة حديثي الولادة من الأم. للحفاظ على الحيوانات دافئة حتى استخدامها، ووضعها في وعاء معزول مثل دلو الثلج ملفوفة في وسادة مقعد للحفاظ على الدفء.
  4. ملء طبق ثقافة 150 ملم مع 25 مل HBSS ووضع على الجليد. بسط 2-3 قطع من الشاش وضعها في منطقة العمل. عقد الجرو عن طريق الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة، رش عليه مع 70٪ من الإيثانول ومكان في غطاء محرك السيارة. ملاحظة: للحفاظ على عقم أفضل، ويمكن أن يتم ذلك عن طريق شخص آخر ثم يضع الجرو تنظيفها في غطاء محرك السيارة.
  5. عقد الجرو عن طريق الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة. ثم باستخدام مقص كبير، في واحدة سريعة، وقطع القوي الموت ببطء عن طريق قطع الرأس. وصمة عار في الدم مع الشاش. ملاحظة: نظرا لاختلافات في متطلبات IACUC، فإنه قد يكون من الأنسب لتنظيف الجرو مع الايثانول مسح بدلا من رش عليه. يجب التأكد من مراجعة مع الجامعة IACUC لمبادئها التوجيهية لهذه الخطوة.
  6. مواصلة خفض الجانب الأمامي من الفصلبتوقيت شرق الولايات المتحدة من خلال القفص الصدري. ضغط على الجلد على الرقبة للمساعدة في فتح القفص الصدري حتى قلب مرئيا. باستخدام مقص صغير، وإزالة القلب ومكان في صحن الثقافة HBSS على الجليد. كرر لالجراء الأخرى.
  7. إزالة أي نوع من الأنسجة غير القلب من العينات ودوامة HBSS بلطف لغسل القلوب. نقل أنسجة القلب إلى صحن ثقافة أخرى تحتوي على HBSS الطازجة وزيادة غسل الأنسجة. قطع الأنسجة أخرى حتى القطع هي 1-3 ملم ومن ثم نقل إلى حل التربسين. وضع حل التربسين على الروك في 4 ° C الثلاجة O / N.

عزل خلية يوم 2

ملاحظة: أثناء الشفط في الخطوات التالية، استخدم ماصة بدلا من خط فراغ. الأنسجة تتحرك بسهولة، وسوف خط فراغ تسد أو إزالة الأنسجة لا تزال تحتوي على الخلايا. فمن الأفضل لاستخدام ماصة للطموح بدلا من ذلك. إذا تدخل الأنسجة ماصة، ماصة العودة إلى إزالته.

  1. جعل رمأخوذة hree من 10٪ NRCM وسائل الإعلام: واحدة مع 25 مل و 15 مل مع اثنين. وضع أنبوب واحد 25 مل من وسائل الإعلام في 37 ° C حمام الماء. إضافة 4 مل HBSS إلى 5 مختلفة 15 مل أنابيب مخروطية ووضع كل شيء على الجليد. تسمية كل 15 مل أنبوب # 1-5.
  2. إضافة 40 مل HBSS إلى أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 10 مل من HBSS إلى كولاجيناز، ماصة للتعليق، والجمع بين الحلول لخلق 50 مل من 1 ملغ مل -1 حل كولاجيناز. تعقيم باستخدام 0.22 ميكرون فلتر فراغ، وتخزينها في RT.
  3. استرداد القلب أنبوب الأنسجة / التربسين. ضمان التربسين هو واضح، وتظهر الأنسجة رقيق. السماح للأنسجة لتستقر في الزاوية من أنبوب ونضح كسائل قدر الإمكان.
  4. إضافة 25 مل دافئ 10٪ FBS NRCM وسائل الإعلام إلى أنبوب ودوامة باليد. كاب وتدوير في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة. نضح السائل مرة أخرى. الأنسجة يجب أن تطفو على هذه الخطوة. إذا كان الأمر كذلك، نضح من الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. إضافة 10 مل كولاجيناز. تدوير في حمام مائي لمدة 2 دقيقة أو حتى الحل هو غائم. تشوickly نضح السائل. إضافة 10 مل كولاجيناز جديدة لالأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة وتدوير في حمام مائي لمدة 2 دقيقة. ماصة لخلط، والحل نقل إلى أنبوب رقم 1، ووضع على الجليد. قد لا يكون من الممكن إزالة كافة السائل. كرر الخطوات من 3،2-3،6 لغيرها من ثلاثة أنابيب 15 مل المخروطية. نقل أي السائل المتبقي لأنبوب # 5.
  6. الطرد المركزي 15 مل أنابيب في إطار التعاون الإقليمي 410 لمدة 8 دقائق. في حين الطرد المركزي، ضع 15 مل 10٪ FBS NRCM أنبوب سائل الإعلام في حمام مائي. وضع 40 ميكرومتر مصفاة الخلية على رأس أنبوب مخروطي 50 مل والرطب مع 2 مل HBSS الباردة.
  7. نضح طاف من خلايا نسج أسفل. إضافة HBSS 6 مل الباردة إلى كل أنبوب و resuspend. تعليق خلية ماصة من خلال مصفاة الى 50 مل المخروطية لإزالة أي نوع من الأنسجة. شطف الجانبين من كل أنبوب 15 مل مع 3 مل الباردة HBSS وإضافة إلى مصفاة. خلايا الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 410 لمدة 10 دقيقة. نضح طاف. بيليه resuspend خلية في 10 مل 10٪ FBS وسائل الاعلام NRCM ونقل إلى T-75 قارورة. شطف المخروطية مع وسائل الإعلام 5ML وإضافة إلى فلوريدانسأل.
  8. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪. ضع الماضي 15 مل 10٪ FBS NRCM أنبوب سائل الاعلام الى حمام الماء. نقل محتويات T-75 و T-قارورة 175 الجديدة، وشطف T-75 مع 15 مل سائل الإعلام وإضافة إلى T-175. احتضان لمدة 1 ساعة.

4. الحفظ بالتبريد

  1. وضع تجميد وسائل الإعلام على الجليد. نقل وسائل الإعلام خلية من T-175 إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، وجمع 10 ميكرولتر من تعليق خلية لخلية العد باستخدام التريبان الأزرق. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 410 لمدة 5 دقائق. في حين الطرد المركزي، عد الخلايا باستخدام عداد الخلية.
  2. وسائل الإعلام ثقافة نضح، والخلايا resuspend في تجميد وسائل الإعلام بتركيز 2-4 مليون خلية لكل مليلتر. ضع 1 مل من تعليق خلية في قارورة المبردة، ثم مكان قارورة مراقبة معدل تبريد تجميد الحاويات، ومكان في الفريزر -80 درجة مئوية O / N. في غضون 1-2 أيام، ونقل قوارير في النيتروجين السائل.

5. الخلايا ذوبان

  1. طبق معطف في فبرونيكتين عن طريق إذابة 250 ميكرولتر60، من فبرونيكتين (تركيز المخزون 1 ملغ مل -1) إلى 9.75 مل من الماء (تركيز النهائي 0.025 ملغ مل -1). إضافة حل ما يكفي لتغطية لوحة الثقافة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    1. في أربعة أنابيب مخروطية 15 مل، وجعل خليط DMSO / وسائل الإعلام على النحو التالي بإضافة DMSO إلى 20٪ وسائل الإعلام. إضافة (5٪) 9.5 مل سائل الإعلام مع 500 ميكرولتر DMSO. إضافة (2.5٪) 9.75 مل وسائل الاعلام مع 250 ميكرولتر DMSO. إضافة 10 مل سائل الإعلام (جعل اثنين من هذه).
  2. تسخين خليط سائل الإعلام المذكورة آنفا في 37 ° C حمام الماء. إزالة الخلايا من النيتروجين السائل وضعها على الثلج الجاف. عندما خليط سائل الإعلام هي الحارة، ذوبان الجليد الخلايا في 37 ° C حمام مائي حتى إذابة فقط. لا تترك الخلايا في حمام الماء لفترة طويلة جدا لأن هذا قد يسبب تلف الخلايا.
  3. نقل محتويات القارورة المبردة إلى 5٪ أنبوب DMSO / وسائل الإعلام. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 410 لمدة 8 دقائق. نضح طاف ترك بيليه الخلية. إضافة محتويات أنبوب 2.5٪ DMSO / وسائل الإعلام إلى الخلية بيليه و resuspend. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 410 لمدة 8 دقائق. نضح طاف ترك بيليه الخلية.
  4. إضافة محتويات واحد 0٪ أنبوب DMSO / وسائل الإعلام إلى الخلية بيليه و resuspend. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 410 لمدة 8 دقائق. نضح طاف ترك بيليه الخلية.
  5. إضافة محتويات الثاني 0٪ DMSO / وسائل الإعلام إلى الخلية بيليه و resuspend. أخذ عينة صغيرة لفرز الخلية. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 410 لمدة 8 دقائق. في حين الطرد المركزي خلايا العد في haemocytometer باستخدام التريبان الأزرق لتسمية الخلايا الميتة. كمية الخلايا قياسي، فضلا عن قدرتها على البقاء.
  6. نضح طاف ترك بيليه الخلية. resuspend في 10٪ NRCM وسائل الإعلام (اختياري: إضافة 100 ميكرومتر bromodeoxyuridine (BrdU)) والخلايا لوحة على أطباق المغلفة فبرونيكتين.

الثقافة 6. خلية

  1. لوحة الخلايا في حوالي 100K الخلايا لكل سم 2. ضبط كثافة الطلاء على أساس الاستخدام المقصود للثقافة. إعداد 2٪ NRCM وسائل الإعلام عن طريق تمييع 20٪ وسائل الإعلام في IMDM في نسبة 01:10. وفيما يلي عرض موجز للثقافة نموذجية. </ لى>
  2. في يوم 1، وشطف الخلايا الميتة بعيدا مع IMDM الدافئة، إضافة 10٪ NRCM (اختياري 100 BrdU ميكرومتر). في يوم 2، وشطف الخلايا الميتة بعيدا مع IMDM الدافئة، إضافة 10٪ NRCM. اليوم 3-إضافة 2٪ NRCM. في يوم 4 إضافة 2٪ NRCM. في يوم 5 تأكد من أن الخلايا هي متكدسة والضرب. الحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة حوالي أسبوع. في تلك المرحلة قد تبدأ الخلايا الليفية إلى تتفوق بشكل كبير من NRCMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد عزل العضلية الفئران حديثي الولادة، يتم تجميد الخلايا وصولا الى النيتروجين السائل، ويمكن تخزينها لعدة أشهر على الأقل. عادة عند ذوبان الجليد، الجدوى التي يحددها التحليل التريبان الأزرق سيكون بين 40-60٪. رغم أن هذا هو أقل من أنواع الخلايا الأخرى، مع البذر والثقافة السليم الخلايا وتتكاثر (الشكل 1). من أجل التحقق من انقباض، والخلايا يمكن تصوير باستخدام المجهر مرحلة التباين. الخلايا يجب أن تبدأ في العقد تلقائيا في غضون ثلاثة أيام (الشكل 2). لمناعية (ICC) المقايسات، كانت مطلية الخلايا في الشرائح ثقافة 4 بشكل جيد مع 200،000 الخلايا لكل بئر. من أجل إظهار أن الخلايا في الثقافة هي NRCMs وصفت الخلايا مع α-SA والتقط باستخدام المجهر مضان. هناك العديد من الخلايا إيجابية α-SA تشير NRCMs في الثقافة (الشكل 4). وقد أجريت تجارب أخرى بما في ذلك طريق مسدودNRCMs تورينج مع الجذعية القلبية exosomes المشتقة من الخلايا البشرية لاختبار خصائص التجدد exosomes (الشكل 5).

الشكل (1)
الشكل 1. NRCM انتشار في المختبر. صورة الإسفار المجهري NRCM مع تلطيخ لα-SA (الأخضر)، Ki67 (الحمراء)، ودابي (الأزرق) على حد سواء (A) NRCMs المعزولة حديثا و (ب) cryopreserved NRCMs ثم إذابة. السهام يشير إلى تكاثر خلايا (ki67 إيجابي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تقلص Cryopreserved ومذاب NRCM في المختبر. spontane NRCMsالتعاقد سابقاً في المختبر. وخلافا NRCMs المعزولة حديثا، قد يستغرق بضعة أيام قبل أن يتم استردادها انقباض. تم تسجيل الفيديو بعد خمسة أيام الذوبان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

الشكل (3)
الشكل 3. تقلص المعزولة حديثا NRCM في المختبر. معزولة طازجة NRCMs التعاقد تلقائيا في المختبر. وسوف تبدأ هذه الخلايا لعرض انقباض في وقت أقرب بكثير. تم تسجيل الفيديو بعد 3 أيام من العزلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

الشكل (4)
الشكل 4. الطهارة من NRCM الثقافة. </ strong> صور المجهر مضان من كل من (A) المعزولة حديثا NRCMs في الثقافة و(B) cryopreserved وNRCMs إذابة بعد 5 أيام في الثقافة. عرض NRCMs تلطيخ إيجابي لα-SA (الأخضر) في حين يمكن رؤية الخلايا الليفية حيث لا تحيط نواة (الأزرق) من خلال α-SA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. استخدام مذاب NRCM لخلية القائم على الفحص. صورة متحد البؤر المجهري من NRCMs، التي أبرزها α-SA (الأخضر)، وحضنت مع exosomes الجاذبة المسمى (الحمراء) من الخلايا الجذعية القلبية. نوى الخلايا المسمى مع دابي (الأزرق). من أجل خلق نموذج الاكسدة، وعولج NRCMs مع 100 ميكرومتر بيروكسيد الهيدروجين لمدة 18 ساعة، قبل أن يتم تحضين مع exosoMES لمدة 4 ساعة لعكس الاكسدة. تبين الأسهم مناطق تركيزات عالية exosome في بعض الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يسمح لNRCMs أن تكون معزولة، cryopreserved، وإذابة. ذوبان الخلايا هو جزء حاسم من الإجراء. ويتم استخدام سلسلة من التخفيفات DMSO لإزالة DMSO ببطء من الخلايا 14. من المهم أن استخراج DMSO أن يؤديها بسرعة مثل خلايا حساسة بشكل خاص إلى الموت مباشرة بعد ذوبان الجليد. إذا هناك حاجة خلايا أكثر أو أقل للذوبان، ومجلدات من الحلول DMSO يمكن زيادتها حسب الحاجة.

التحدي واحدة لNRCM العزلة والثقافة هو الانتشار السريع لالليفية. يستخدم هذا البروتوكول preplating وهو ما ثبت للحد من عدد من الخلايا الليفية 15. Preplating الأعمال باستخدام قوارير غير المصقول التي الخلايا الليفية نعلق أسرع بكثير من العضلية. ويمكن تغيير تسلسل التغييرات الوسائط للحد من نمو الخلايا الليفية. والخلايا الليفية تتفوق NRCMs في 10٪ NRCM وسائل الإعلام، ولكن نمو الخلايا الليفية بشكل ملحوظ أبطأ في 2٪ NRCM ميدالجيش العراقي. وهناك طرق أخرى مثل التدرجات Percoll لإزالة الخلايا الليفية قبل الطلاء 16،17 أو إضافة BrdU لإبطاء نمو الخلايا الليفية 3. نمو الخلايا الليفية المفرط يمكن أن يكون من الصعب كشف باستخدام المجهر المرحلة، ولكن يظهر بسهولة باستخدام NRCM تلطيخ محددة مثل α-SA (الشكل 3). إذا كان هناك لا يزال نمو الخلايا الليفية المفرط، يمكن انخفضت كمية FBS في وسائل الإعلام إلى 2٪ FBS في يوم 2. إذا لزم الأمر، يمكن أن يتم تصفيح في 5٪ FBS وسائل الإعلام، رغم أن هذا قد يؤدي إلى زيادة موت الخلايا.

هذا الإجراء محدود ولم يعد مفيدا في حالة استخدام الثقافات الخلية التي تتطلب كميات كبيرة من الخلايا 18،19. في الحالات التي تكون فيها كمية من الخلايا اللازمة تقترب من نصف كمية من الخلايا المحتملة لموسم الحصاد من القمامة، وهذا الإجراء يتطلب المزيد من الحيوانات منذ فقدت ما يقرب من نصف الخلايا بسبب الحفظ بالتبريد. فوائد الحفظ بالتبريد هي أكبر عند استخدام عدد أقل من سلليرة سورية لفحوصات مثل المناعية.

يوضح هذا البروتوكول الطرق لعزل، الحفظ بالتبريد، واللاحقة من NRCMs. هناك عدد قليل من البدائل، مثل شراء الخلايا المجمدة من البائعين، وإلى استخدام هذا الأسلوب ولكن الخلايا شراء قد تكون تكلفة باهظة لبعض المعامل. طرقنا لا تتطلب سوى المواد والكواشف التي يشيع استخدامها في زراعة الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام هذه الأساليب يمكن أن يزيد بدرجة كبيرة من الكفاءة والمرونة في العمل في المعمل مع الحد من استخدام حيوانات المختبر. الأساليب المذكورة تنتج ثقافات قابلة للحياة والتي يمكن استخدامها لاحقا في الدراسات المختبرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) Gibco 12440-046 With added 25 mM HEPES and L-glutamine
L-glutamine Gibco 25030-081
FBS Hyclone SH30070.03
Gentamicin Gibco 15710-064
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023
HBSS (+Ca +Mg) Corning 21-020-CV With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4
Trypsin 0.25% Gibco 25300-056
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054
Cryostor CS5 BioLife Solutions 205102 Freezing media
Cryogenic Vial Corning 430659
Collagenase Sigma C1889-50MG
40 μm Cell Strainer Greiner Bio-One 542040
Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) Corning 431118
50 ml Conical Corning 430828
15 ml Conical Corning 430790
trypan blue Cellgro 25-900-CI
Mr Frosty Freezing Container ThermoScientific 5100-0001
Millicell EZ SLIDES Millipore PEZGS0416
α-sarcomeric actinin antibody Sigma A7811
Fibronectin Corning 356008
Bromodeoxyuridine BD Biosciences 51-7581KZ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  2. Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
  3. Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
  4. Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
  5. Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
  6. Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
  7. Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
  8. Fu, J. -D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
  9. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
  12. Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
  13. Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
  14. Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
  15. Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
  16. Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
  17. Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
  18. Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
  19. Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 98، الفحص الحفظ بالتبريد، العضلية، استنادا الخلوي والثقافة خلية، أبحاث القلب، الفحص في المختبر
العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vandergriff, A. C., Hensley, M. T.,More

Vandergriff, A. C., Hensley, M. T., Cheng, K. Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (98), e52726, doi:10.3791/52726 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter