Introduction
Cellekultur af cardiomyocytter er et kritisk værktøj i moderne hjerte- forskning. Nyfødte rottecardiomyocytter (NRCMs) er almindeligt brugt siden isolation og kultur er lettere end voksne rottecardiomyocytter 1. Den NRCM metode stadig har flere begrænsninger, herunder en lang isolation procedure og begrænset celleproliferation i skålen. Der er mange protokoller til isolering af NRCMs med mest almindeligt kræver 4-48 timer af arbejde 2-6. Derudover er cellerne ofte isoleret fra 1 til 2 dage gamle rotteunger 2,4-7; timingen af fødslen kan være uforudsigelig og konflikt med andet arbejde i laboratoriet. Isoleringen kan være ineffektiv og uøkonomisk, hvis kun en lille mængde af celler er nødvendige for eksperimenter. Bestræbelserne på at forbedre arbejdsgangen fokus på at reducere isolation tid, men dette løser ikke problemerne med timing fødslen af hvalpene.
Som alternativer mange laboratorier anvendercardiomyocytter afledt af embryonale stamceller (EKSF) eller inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Imidlertid kan omprogrammering og / eller differentiering proces være meget tidskrævende og dyre samt. Der kan være andre problemer, når du bruger disse celler som in vitro myocyt modeller. Både ESC og iPSC- afledte cardiomyocytter har vist sig at udvise forskelle i elektrofysiologi fra primære cardiomyocytter 8-10.
Dissocierede NRCMs er i stand til at blive lagret i flere dage ved hjælp af køling 11, men dette giver mulighed for langtidsopbevaring. Flydende nitrogen anvendes typisk til at bevare celler for en større tidsperiode, men kræver et kryobeskyttelsesmiddel såsom dimethylsulfoxid (DMSO). Tidligere forskning har vist, at den ideelle koncentration mellem 5-10% DMSO i indefrysning medier giver mulighed for nedfrysning af NRCMs, men selv da levedygtigheden fortsat lav 12. Selvom DMSO hjælper med at beskytte cellerne ved frizing, kan det være toksisk for celler ved koncentrationer over 1,5% 13. Tidligere undersøgelser har vist, at langsomt at fjerne DMSO fra cellerne, kan forbedre cellelevedygtighed 14.
Vi forsøgte at forbedre effektiviteten af NRCM cellebaserede assays ved kryopræservering cellerne efter isolation. Dette gør det muligt for cellerne, der skal optøs og anvendes efter behov, hvilket reducerer hyppigheden af isolationer og forbrug af dyr. Ved hjælp af denne metode, viser vi, at det er muligt at kryopræservere NRCMs og tø dem til brug på et senere tidspunkt. Efter optøning af cellerne opretholde en acceptabel rentabilitet og producere NRCM kulturer, der er positive for α-sarcomerisk actinin (α-SA) og kontrakt spontant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er beregnet til isolering af cardiomyocytter fra et kuld af neonatale rotteunger (10-14 PUP). Hvis kuldstørrelse er væsentligt anderledes, kan proceduren skal skaleres for at kompensere. Hvalpene skal være omkring 48 ± 6 timer gammel. Alle procedurer heri er blevet godkendt af North Carolina State University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. celleisolering Forberedelse
BEMÆRK: Udfør følgende trin dagen før isolation.
- Autoklaver følgende: store sakse, lille saks, små skarpe tang, store pincet. Brug en tyngdekraft cyklus i 60 minutter ved et minimum på 121 ° C og en tørretid på 30 minutter.
- Anbring 40 ml 0,1% trypsin opløsning i køleskab til optøning O / N. Afkøl Hanks Balanced Salts Solution (HBSS), hvis ikke allerede koldt. Der fremstilles en 20% føtalt bovint serum (FBS) lager medier løsning.
- I 400 ml Iseove modificerede Dulbeccos medium (IMDM) tilsættes 100 ml FBS, 5 ml L-glutamin (200 mM), 2,5 ml gentamicin (10 mg ml-1), og 0,9 ml 2-mercaptoethanol. Steriliser ved hjælp vakuumfilter. Opbevar medier ved 4 ° C i op til 3 uger, og det er skalerbar for mindre eller større mængder. Fortynd 20% FBS lager medier 1: 1 med IMDM at producere 10% FBS NRCM medier. Kun gøre i små partier for at forhindre gentagen opvarmning og afkøling af medier.
2. celleisolering Dag 1
- Udfør følgende arbejde i en kultur hætte for at forhindre forurening af prøverne. For bedste timing starte dette arbejde om eftermiddagen, da der er en O / N inkubation.
- Forbered arbejdsområde inde i en steril kultur hætte. Placer bænk pad i kultur hætte. Fyld to 250 ml bægerglas med 70% ethanol og placere kirurgiske redskaber i dem. Placer lille spand is i hætte. Sørg for, at den er stor nok til at holde flere rør og en 150 mm skål. UV sterilisere hætten FOr 10 min. Placer 40 ml 0,1% trypsin på is.
- Hent neonatale rotteunger fra moderen. For at holde dyrene varme indtil brug, placere dem i en isoleret beholder, såsom en ice bucket pakket ind i en bænk pad til at holde dem varme.
- Fyld en 150 mm dyrkningsskål med 25 ml HBSS og placere på is. Unwrap 2-3 gaze puder og plads i arbejdsområdet. Holding Ungen af huden på bagsiden af halsen, spray det med 70% ethanol og sted i hætte. BEMÆRK: For bedst opretholde sterilitet, dette kan gøres ved en anden person, som derefter placerer den rensede hvalp i hætten.
- Hold pup af huden på bagsiden af halsen. Så ved hjælp af de store saks, i en hurtig, stærk snit aflive ved halshugning. Dup blod med gaze. BEMÆRK: På grund af forskelle i IACUC krav, kan det være mere hensigtsmæssigt at rengøre hvalpen med en ethanol tørre i stedet for at sprøjte den. Sørg for at tjekke med universitetet IACUC om deres retningslinjer for dette trin.
- Fortsæt skære ned forreste side af lmest gennem brystkassen. Klem huden på halsen for at hjælpe med at åbne brystkassen, indtil hjertet er synlig. Ved hjælp af en lille saks, fjern hjerte og plads i HBSS dyrkningsskål på is. Gentag for de andre hvalpe.
- Fjern eventuelle ikke-hjertevæv fra prøverne og vend den HBSS forsigtigt at vaske hjerter. Overfør hjertevævet til en anden dyrkningsskål indeholdende frisk HBSS og yderligere vask vævet. Skær vævet yderligere, indtil stykkerne er 1-3 mm 3 og derefter overføre til trypsinopløsning. Placer trypsinopløsning på rocker i 4 ° C køleskab O / N.
Celleisolering Dag 2
BEMÆRK: Mens opsugning i de følgende trin, skal du bruge en pipette i stedet et vakuum linje. Vævet bevæger sig let, og en vakuumledning vil tilstoppe eller fjerne væv, der stadig indeholder celler. Det er bedst at bruge en pipette for aspiration i stedet. Hvis væv ind i pipetten, pipette bakke ud for at fjerne det.
- Gør tEfter tre portioner af 10% NRCM Media: en med 25 ml og to med 15 ml. Anbring en 25 ml tube medier i 37 ° C vandbad. Tilføj 4 ml HBSS til 5 forskellige 15 ml koniske rør og placere alle på is. Mærk hver 15 ml rør # 1-5.
- Tilsæt 40 ml HBSS til en 50 ml konisk rør. Der tilsættes 10 ml HBSS at collagenase pipette til at suspendere, og kombinere løsninger for at skabe 50 ml 1 mg ml -1 collagenaseopløsning. Steriliser ved hjælp af 0,22 um vakuumfilter, og opbevares ved stuetemperatur.
- Hent hjertevæv / trypsin rør. Sørg for, at trypsin er klar, og vævet vises fluffy. Lad det væv afregne til hjørnet af røret opsuges så meget væske som muligt.
- Tilsæt 25 ml varm 10% FBS NRCM medier til røret og hvirvel i hånden. Cap og rotere i 37 ° C vandbad i 2 min. Aspirer væsken igen. Vævet skal flyde på dette trin; Hvis ja, suges fra bunden af røret.
- Tilsæt 10 ml collagenase. Rotere i vandbad i 2 minutter, eller indtil opløsningen er uklar. Quickly aspirere væske. Tilsæt 10 ml frisk collagenase til rør indeholdende vævet og rotere i vandbad i 2 min. Pipette at blande, overføre løsning på rør # 1, og placer på is. Det kan ikke være muligt at fjerne al væsken. Gentag trin 3,2-3,6 for de andre tre 15 ml koniske rør. Overfør resterende væske til rør # 5.
- Centrifuge 15 ml rør ved 410 RCF i 8 min. Mens centrifugering placere 15 ml 10% FBS NRCM medier rør i vandbad. Placer 40 um cellefilter på toppen af en 50 ml konisk rør og våd med 2 ml kold HBSS.
- Aspirer supernatanten fra centrifugeret celler. Tilsæt 6 ml kold HBSS til hvert rør og resuspender. Pipette cellesuspensioner igennem sien i 50 ml konisk for at fjerne hvilket som helst væv. Skyl sider af hver 15 ml rør med 3 ml kold HBSS og tilføje til si. Centrifuger cellerne ved 410 rcf for 10 minutter. Aspirer supernatanten. Resuspender cellepellet i 10 ml 10% FBS NRCM medier og overførsel til T-75-kolbe. Skyl konisk med 5 ml medier og tilføje til flspørge.
- Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2. Sted sidste 15 ml 10% FBS NRCM medier rør i vandbad. Overfør indholdet af T-75 til en ny T-175 kolbe skylles T-75 med 15 ml medier og tilføje til T-175. Der inkuberes i 1 time.
4. Kryopræservering
- Placer frysning medier på is. Overførsel cellemedier fra T-175 til 50 ml konisk rør, og indsamle 10 pi cellesuspension for celletælling under anvendelse af Trypan blå. Centrifuger ved 410 rcf for 5 min. Mens centrifugering tælle celler under anvendelse af en celletæller.
- Aspirer dyrkningsmedier og resuspender cellerne i frysning medier ved en koncentration på 2-4 millioner celler pr ml. Placer 1 ml cellesuspension i kryogene hætteglas, så sted hætteglas en kontrolleret afkøling sats frysning container, og sted i -80 ° C fryser O / N. Inden for 1-2 dage, overfører hætteglas i flydende nitrogen.
5. Optøning Cells
- Coat skål i fibronectin ved at opløse 250 pi60, af fibronectin (stamkoncentration 1 mg ml -1) i 9,75 ml vand (slutkoncentration 0,025 mg ml -1). Tilføj nok opløsning til at dække dyrkningsplade og inkuberes ved 37 ° C i mindst 30 minutter.
- I fire 15 ml koniske rør, gør DMSO / media blandinger som følger ved at tilsætte DMSO til 20% Media. Tilføj (5%) 9,5 ml medier med 500 pi DMSO. Tilføj (2,5%) 9,75 ml medier med 250 pi DMSO. Tilsæt 10 ml medier (lave to af disse).
- Opvarm de førnævnte medier blandinger i 37 ° C vandbad. Fjern celler fra flydende nitrogen og sted på tøris. Når medierne blandinger er varme, tø celler i 37 ° C vandbad indtil lige optøet. Efterlad ikke celler i vandbad alt for længe, da det kan forårsage skade på cellerne.
- Overfør indholdet af kryogene hætteglas til 5% DMSO / media rør. Centrifuger ved 410 RCF i 8 min. Aspirer supernatanten forlader cellepellet. Tilføj indhold på 2,5% DMSO / media rør til cellepellet og resuspend. Centrifuger ved 410 RCF i 8 min. Aspirer supernatanten forlader cellepellet.
- Tilføj indholdet af en 0% DMSO / media rør til celle pellet og resuspender. Centrifuger ved 410 RCF i 8 min. Aspirer supernatanten forlader cellepellet.
- Tilføj indholdet af andet 0% DMSO / medier til cellepellet og resuspender. Tag lille prøve til celletælling. Centrifuger ved 410 RCF i 8 min. Mens centrifugering tæller celler i et hæmocytometer under anvendelse af trypanblåt til at mærke døde celler. Optag celle beløb samt levedygtighed.
- Aspirer supernatanten forlader cellepellet. Resuspender i 10% NRCM medier (ekstraudstyr: tilføje 100 uM bromdeoxyuridin (BrdU)) og plade celler på fibronectincoatede retter.
6. Cellekultur
- Plate celler ved ca. 100k celler pr cm2. Juster udpladningsdensitet baseret på den tilsigtede anvendelse af kulturen. Forbered 2% NRCM medier ved at fortynde 20% Medier i IMDM i en 1:10 ratio. Følgende er en oversigt over en typisk kultur. </ Li>
- På dag 1, skyl døde celler væk med varmt IMDM, tilsættes 10% NRCM (valgfri 100 uM BrdU). På dag 2, skyl døde celler væk med varmt IMDM, tilsættes 10% NRCM. Dag 3-tilsættes 2% NRCM. På dag 4 tilsættes 2% NRCM. På dag 5 sikre, at cellerne er sammenflydende og slå. Bevar celler i kultur for omkring en uge. På det tidspunkt fibroblaster kan begynde at betydeligt vokse de NRCMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter isolering af de neonatale rottecardiomyocytter cellerne fryses ned til flydende nitrogen og kan opbevares i mindst flere måneder. Typisk efter optøning vil levedygtighed bestemmes ved trypanblåt-analyse være mellem 40-60%. Selvom dette er lavere end andre celletyper, med korrekt podning og dyrkning af cellerne vil proliferere (figur 1). For at verificere kontraktilitet, kan cellerne afbildes under anvendelse af en fasekontrastmikroskopi. Cellerne bør begynde spontant optage inden omkring tre dage (figur 2). For immunocytokemi (ICC) assays blev celler udpladet i 4 brønde kultur slides med 200.000 celler pr. For at vise, at cellerne i kultur er NRCMs cellerne blev mærket med α-SA og filmede med fluorescens mikroskopi. Der er talrige α-SA-positive celler indikerer NRCMs i kultur (figur 4). Andre forsøg er blevet udført, herunder culturering NRCMs med humane hjerte- stamcelle afledt exosomer at teste regenerative egenskaber exosomer (figur 5).
Figur 1. NRCM Proliferation in vitro. Fluorescensmikroskopi billede af NRCM med farvning for α-SA (grøn), Ki67 (rød), og DAPI (blå) for både (A) frisk isolerede NRCMs og (B) kryopræserverede derefter optøet NRCMs. Pile angiver prolifererende celler (Ki67-positive). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Sammentrækning af kryopræserveret og optøs NRCM in vitro. NRCMs Spontanegere ordregivende in vitro. I modsætning til frisk isolerede NRCMs, kan det tage et par dage før kontraktilitet genvindes. Video blev registreret fem dage efter optøning. Klik her for at se denne video.
Figur 3. Sammentrækning af frisk isolerede NRCM in vitro. Frisk isolerede NRCMs spontant kontraherende in vitro. Disse celler vil begynde at udvise kontraktilitet meget hurtigere. Video blev registreret 3 dage efter isolering. Klik her for at se denne video.
Figur 4. renhed NRCM Culture. </ Strong> fluorescensmikroskop billeder af både (A) frisk isolerede NRCMs i kultur og (B) kryopræserveret og optøet NRCMs efter 5 dage i kultur. NRCMs viser positiv farvning for α-SA (grøn), mens det kan ses, hvor kerner (blå) er ikke omgivet af α-SA fibroblaster. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Anvendelse af Optøet NRCM for cellebaserede analyse. Konfokal mikroskopi billede af NRCMs, fremhævet af α-SA (grøn), inkuberet med Dii-mærkede exosomer (rød) fra hjerte-stamceller. Cellekerner mærket med DAPI (blå). For at skabe et oxidativt stress model blev NRCMs behandlet med 100 uM hydrogenperoxid i 18 timer, forud for at blive inkuberet med exosomes i 4 timer for at vende den oxidative stress. Pile angiver områder af høje koncentrationer exosom i nogle celler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver mulighed for NRCMs skal isoleres, kryopræserveret og optøet. Optøning af celler er en afgørende del af proceduren. En række DMSO fortyndinger anvendes til langsomt at fjerne DMSO fra cellerne 14. Det er vigtigt, at udvindingen af DMSO udføres hurtigt som cellerne er særligt følsomme over for at dø umiddelbart efter optøning. Hvis der kræves mere eller mindre celler til optøning, kan mængden af DMSO løsninger skaleres efter behov.
En udfordring for NRCM isolation og kultur er den hurtige spredning af fibroblaster. Denne protokol anvender preplating som har vist sig at reducere antallet af fibroblaster 15. Preplating fungerer ved hjælp af ikke-coatede kolber, som fibroblaster tillægger meget hurtigere end kardiomyocytter. Sekvensen af ændringer medier kan ændres for at reducere fibroblastvækstfaktor. Fibroblaster vil vokse NRCMs i 10% NRCM medier, men fibroblast vækst er betydeligt langsommere i 2% NRCM withIA. Der er andre metoder såsom Percoll-gradienter for at fjerne fibroblast før udpladning 16,17 eller tilsætningen af BrdU at bremse 3 vækst fibroblast. Overdreven vækst fibroblast kan være svært at detektere ved hjælp af fase mikroskopi, men er let vises ved hjælp NRCM specifik farvning, såsom α-SA (figur 3). Hvis der stadig er overdreven vækst fibroblast, kan reduceres mængden af FBS i medierne til 2% FBS på dag 2. Hvis det er nødvendigt, kan plating ske i 5% FBS medier, selv om dette kan resultere i forøget celledød.
Denne procedure er begrænset og ikke længere en fordel, hvis anvendelse cellekulturer, der kræver store mængder af celler 18,19. I tilfælde, hvor mængden af celler, der er nødvendige nærmer den halve mængde celler muligt at høste fra et kuld, vil denne procedure kræver flere dyr siden ca. halvdelen af cellerne tabt på grund af kryopræservering. Fordelene ved kryopræservering er større ved brug af færre cells for assays, såsom immunfarvning.
Denne protokol illustrerer metoder til isolering, kryopræservering, og efterfølgende af NRCMs. Der er få alternativer, såsom at købe frosne celler fra leverandører, til at bruge denne metode, men køber celler kan koste uoverkommelige for nogle laboratorier. Vores metoder kræver kun materialer og reagenser, der almindeligvis anvendes i cellekultur. Desuden kan udnytte disse metoder i høj grad øge effektiviteten og fleksibiliteten i lab arbejde, samtidig med at brugen af lab dyr. De beskrevne metoder producere levedygtige kulturer, der kan anvendes til efterfølgende in vitro-undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
