Introduction
Cardiomyocytes की सेल संस्कृति आधुनिक हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। नवजात चूहे cardiomyocytes (NRCMs) आमतौर पर अलगाव के बाद से इस्तेमाल किया जाता है और संस्कृति वयस्क चूहे cardiomyocytes एक की तुलना में आसान है। NRCM पद्धति अभी भी डिश में एक लंबे समय के अलगाव की प्रक्रिया और सीमित सेल प्रसार सहित कई सीमाएं हैं। सबसे आम तौर पर काम 2-6 से 4-48 घंटे की आवश्यकता के साथ NRCMs के अलगाव के लिए कई प्रोटोकॉल रहे हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं अक्सर 2 दिन पुराने चूहे पिल्ले 2,4-7 1 से अलग कर रहे हैं; जन्म के समय प्रयोगशाला में अन्य काम के साथ अप्रत्याशित और संघर्ष हो सकता है। कोशिकाओं का केवल एक छोटी राशि के प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं अगर isolations अक्षम और बेकार हो सकता है। अलगाव के समय को कम करने पर कार्यप्रवाह ध्यान केंद्रित में सुधार लाने पर अधिकांश प्रयासों, अभी तक इस पिल्ले के जन्म के समय की समस्याओं का समाधान नहीं करता है।
विकल्प के रूप में, कई प्रयोगशालाओं का उपयोगभ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) या प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) से व्युत्पन्न cardiomyocytes। हालांकि, reprogramming और / या भेदभाव की प्रक्रिया बहुत समय लगता है और महंगा के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है। इन विट्रो myocyte मॉडल के रूप में इन कोशिकाओं का उपयोग करते समय अन्य समस्या हो सकती है। दोनों ESC- और iPSC- व्युत्पन्न cardiomyocytes प्राथमिक cardiomyocytes 8-10 से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में मतभेद प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है।
अलग NRCMs प्रशीतन 11 का उपयोग कर कई दिनों के लिए भंडारित किया जा रहा करने में सक्षम हैं, अभी तक इस लंबी अवधि के भंडारण के लिए अनुमति नहीं है। तरल नाइट्रोजन आम तौर पर समय का एक बड़ा अवधि के लिए कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के रूप में एक cryoprotectant ऐसे आवश्यकता है। पिछले अनुसंधान ठंड मीडिया में 5-10% DMSO के बीच आदर्श एकाग्रता NRCMs की cryopreservation के लिए अनुमति देता है कि दिखाया गया है, अभी तक फिर भी व्यवहार्यता कम 12 बनी हुई है। DMSO के मुक्त दौरान कोशिकाओं की रक्षा में मदद करता हैZing, यह 1.5% 13 से ऊपर सांद्रता में कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है। पिछले अध्ययनों से धीरे धीरे कोशिकाओं से DMSO के हटाने, सेल व्यवहार्यता 14 में सुधार हो सकता है कि पता चला है।
हम अलगाव निम्नलिखित cryopreserving कोशिकाओं द्वारा NRCM सेल आधारित assays की दक्षता में सुधार करने की मांग की। यह कोशिकाओं thawed और आवश्यक, isolations और जानवरों की खपत की आवृत्ति को कम करने के लिए जब इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है। इस विधि का उपयोग करना, हम यह NRCMs cryopreserve और बाद में उपयोग के लिए उन्हें पिघलना करने के लिए संभव है कि पता चलता है। विगलन के बाद कोशिकाओं को एक स्वीकार्य व्यवहार्यता बनाए रखने और अनायास α-sarcomeric actinin (α-एसए) और अनुबंध के लिए सकारात्मक रहे हैं कि NRCM संस्कृतियों का उत्पादन।
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल नवजात चूहे पिल्ले (10-14 पिल्ले) के एक कूड़े से cardiomyocytes के अलगाव के लिए बनाया गया है। कूड़े का आकार काफी अलग है, तो प्रक्रिया क्षतिपूर्ति करने के लिए बढ़ाया जाना पड़ सकता है। पिल्ले चारों ओर 48 ± 6 घंटा पुराना होना चाहिए। सभी प्रक्रियाओं के साथ साथ उत्तर कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. सेल अलगाव तैयारी
नोट: अलगाव से पहले निम्न चरणों के दिन प्रदर्शन।
- बड़ी कैंची, छोटे कैंची, छोटे तेज संदंश, बड़े संदंश: निम्न आटोक्लेव। 121 डिग्री सेल्सियस के न्यूनतम और 30 मिनट की एक सुखाने समय में 60 मिनट के लिए एक गुरुत्वाकर्षण चक्र का प्रयोग करें।
- / एन ओ पिघलना करने के लिए फ्रिज में 0.1% trypsin समाधान के 40 मिलीलीटर रखें। सर्द हांक संतुलित साल्ट समाधान (HbSS) पहले से ही ठंडा नहीं है। एक 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) शेयर मीडिया समाधान तैयार है।
- Isc के 400 एमएल मेंove के संशोधित है Dulbecco मीडिया (IMDM) 100 मिलीलीटर FBS के, 5 मिलीलीटर एल glutamine (200 मिमी), 2.5 मिलीलीटर जेंटामाइसिन (10 मिलीग्राम मिलीलीटर -1), और 0.9 मिलीलीटर 2-मर्केप्टोइथेनाल जोड़ें। वैक्यूम फिल्टर का उपयोग जीवाणुरहित। स्टोर करने के लिए तीन सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया और इस छोटे या बड़े संस्करणों के लिए स्केलेबल है। 10% FBS के NRCM मीडिया उपज IMDM के साथ 1: 20% FBS के शेयर मीडिया एक पतला। केवल दोहराया ताप और मीडिया का ठंडा रोकने के लिए छोटे समूहों में बनाते हैं।
2. सेल अलगाव दिवस 1
- नमूने के प्रदूषण को रोकने के लिए एक संस्कृति हुड में निम्नलिखित काम करते हैं। एक हे / एन ऊष्मायन के बाद से वहाँ सबसे अच्छा समय के लिए दोपहर में यह काम शुरू करते हैं।
- एक बाँझ संस्कृति हुड के अंदर कार्यक्षेत्र तैयार करें। संस्कृति हुड में बेंच पैड रखें। 70% इथेनॉल के साथ दो 250 मिलीलीटर बीकर भरें और उन्हें में सर्जिकल उपकरण जगह है। हुड में बर्फ के छोटे बाल्टी रखें। यह कई ट्यूब और एक 150 मिमी पकवान धारण करने के लिए काफी बड़ी है कि सुनिश्चित करें। के लिए हुड बाँझ यूवीआर 10 मिनट। बर्फ पर 40 एमएल 0.1% trypsin रखें।
- मां से नवजात चूहे पिल्ले निकालते हैं। उपयोग करें जब तक गर्म पशुओं को रखने के लिए, इस तरह उन्हें गर्म रखने के लिए एक बेंच पैड में लिपटे एक बर्फ बाल्टी के रूप में एक अछूता कंटेनर में उन्हें जगह है।
- 25 एमएल HBSS के साथ एक 150 मिमी संस्कृति डिश भरें और बर्फ पर जगह है। खोलना 2-3 धुंध पैड और कार्य क्षेत्र में जगह। गर्दन की पीठ पर त्वचा द्वारा पिल्ला होल्डिंग, हुड में 70% इथेनॉल और जगह के साथ स्प्रे। नोट: सबसे अच्छा बाँझपन बनाए रखने के लिए, यह तो हुड में साफ पिल्ला देता है जो किसी अन्य व्यक्ति द्वारा किया जा सकता है।
- गर्दन की पीठ पर त्वचा द्वारा पिल्ला पकड़ो। तो फिर कत्ल के द्वारा euthanize एक त्वरित, मजबूत कटौती में, बड़ी कैंची का उपयोग। धुंध के साथ रक्त दाग। नोट: IACUC आवश्यकताओं में प्रसरण के लिए, यह एक इथेनॉल के साथ पिल्ला साफ करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है कारण यह छिड़काव के बजाय पोंछे। इस कदम के लिए अपने दिशा निर्देशों के रूप में विश्वविद्यालय IACUC के साथ की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें।
- चर्चा के पूर्वकाल पक्ष नीचे काटने जारी रखेंribcage के माध्यम से स्था। दिल से दिखाई देता है जब तक ribcage खोलने में मदद करने के लिए गर्दन पर त्वचा निचोड़। छोटे कैंची का प्रयोग, बर्फ पर HBSS के संस्कृति डिश में दिल और जगह को हटा दें। अन्य पिल्ले के लिए दोहराएँ।
- नमूनों से किसी भी गैर-हृदय के ऊतकों निकालें और दिलों को धोने के लिए धीरे HBSS के ज़ुल्फ़। ताजा HBSS युक्त एक और संस्कृति डिश के लिए हृदय के ऊतकों स्थानांतरण और आगे ऊतक धो लें। टुकड़े 1-3 मिमी 3 रहे हैं जब तक आगे ऊतक में कटौती, और फिर trypsin समाधान करने के लिए स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर हे / एन में घुमाव पर trypsin समाधान रखें।
सेल अलगाव दिवस 2
नोट: निम्न चरणों में aspirating जबकि, एक शून्य रेखा के बजाय एक विंदुक का उपयोग करें। ऊतक आसानी से चलता है, और एक निर्वात लाइन रोकना या कोशिकाओं से युक्त अभी भी ऊतक को हटा देगा। यह बजाय आकांक्षा के लिए एक विंदुक का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है। ऊतक पिपेट में प्रवेश करती है, तो पिपेट इसे हटाने के लिए वापस बाहर।
- टी बनाओ10% NRCM मीडिया की hree aliquots: 15 मिलीलीटर के साथ 25 मिलीलीटर के साथ एक और दो। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मीडिया के एक 25 मिलीलीटर ट्यूब रखें। 5 अलग अलग 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए 4 मिलीलीटर HBSS जोड़ें और बर्फ पर सभी जगह है। प्रत्येक 15 मिलीलीटर ट्यूब # 1-5 लेबल।
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए 40 मिलीलीटर HBSS जोड़ें। HBSS के 10 एमएल निलंबित करने के लिए, पिपेट collagenase में जोड़ें, और 50 मिलीलीटर एक की मिलीग्राम मिलीलीटर -1 collagenase समाधान बनाने के लिए समाधान गठबंधन। 0.22 वैक्यूम फिल्टर का उपयोग जीवाणुरहित, और आरटी पर दुकान।
- हृदय के ऊतकों / ट्रिप्सिन ट्यूब निकालते हैं। सुनिश्चित करें कि ट्रिप्सिन स्पष्ट है, और ऊतक शराबी प्रकट होता है। ऊतक ट्यूब और महाप्राण के कोने के रूप में ज्यादा तरल संभव के रूप में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
- हाथ से ट्यूब और चक्कर आने के लिए 25 एमएल गर्म 10% FBS के NRCM मीडिया जोड़ें। कैप और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बारी बारी से। फिर महाप्राण तरल। ऊतक के इस कदम पर फ्लोट चाहिए; यदि हां, तो ट्यूब के नीचे से महाप्राण।
- 10 एमएल collagenase जोड़ें। 2 मिनट के लिए या समाधान बादल है जब तक पानी के स्नान में घुमाएँ। Quickly तरल aspirate। ऊतक युक्त ट्यूब के लिए 10 मिलीलीटर ताजा कोलैजिनेज जोड़ें और 2 मिनट के लिए पानी के स्नान में बारी बारी से। पिपेट, ट्यूब # 1 के लिए स्थानांतरण समाधान मिश्रण है, और बर्फ पर जगह। यह तरल के सभी दूर करने के लिए संभव नहीं हो सकता। दोहराएँ अन्य तीन 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए 3.2-3.6 कदम। ट्यूब # 5 के लिए किसी भी शेष तरल स्थानांतरण।
- अपकेंद्रित्र 8 मिनट के लिए 410 आरसीएफ में 15 मिलीलीटर ट्यूब। Centrifuging जबकि, नहाने के पानी में 15 मिलीलीटर 10% FBS के NRCM मीडिया ट्यूब जगह है। 40 माइक्रोन सेल एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर झरनी और 2 मिलीलीटर ठंड HBSS के साथ गीला रखें।
- नीचे काता कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला Aspirate। प्रत्येक ट्यूब और resuspend करने के लिए 6 मिलीलीटर ठंड HBSS जोड़ें। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में झरनी के माध्यम से पिपेट सेल निलंबन किसी भी ऊतक निकालने के लिए। 3 मिलीलीटर ठंड HBSS के साथ प्रत्येक 15 मिलीलीटर ट्यूब के पक्ष कुल्ला और झरनी में जोड़ें। 10 मिनट के लिए 410 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। टी-75 फ्लास्क को 10 मिलीलीटर 10% FBS के NRCM मीडिया और हस्तांतरण में Resuspend सेल गोली। 5ml मीडिया के साथ शंक्वाकार कुल्ला और फ्लोरिडा के लिए जोड़पूछना।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। नहाने के पानी में पिछले 15 मिलीलीटर 10% FBS के NRCM मीडिया ट्यूब रखें। टी-75 एक नई टी-175 कुप्पी की सामग्री को स्थानांतरित, 15 मिलीलीटर मीडिया के साथ टी-75 कुल्ला और टी 175 में जोड़ें। 1 घंटे के लिए सेते हैं।
4. cryopreservation
- बर्फ पर मीडिया ठंड रखें। टी-175-50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से सेल मीडिया हस्तांतरण, और सेल Trypan नीले का उपयोग कर की गणना के लिए सेल निलंबन के 10 μl इकट्ठा। 5 मिनट के लिए 410 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र। Centrifuging जबकि, एक सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
- मिलीलीटर प्रति 2-4 मिलियन कोशिकाओं के एक एकाग्रता में मीडिया ठंड में महाप्राण संस्कृति मीडिया, और resuspend कोशिकाओं। क्रायोजेनिक शीशी में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर रखें, उसके बाद जगह -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर हे / एन में एक नियंत्रित ठंडा कंटेनर ठंड दर, और जगह शीशियों। 1-2 दिनों के भीतर, तरल नाइट्रोजन में शीशियों हस्तांतरण।
5. विगलन प्रकोष्ठों
- 250 μl भंग करके फ़ाइब्रोनेक्टिन में कोट पकवान60; 9.75 मिलीलीटर पानी (अंतिम एकाग्रता 0.025 मिलीग्राम मिलीलीटर -1) में फ़ाइब्रोनेक्टिन (शेयर एकाग्रता 1 मिलीग्राम मिलीलीटर -1) के। संस्कृति प्लेट कवर और कम से कम 30 मिनट के लिए 37 ओ सी पर सेते करने के लिए पर्याप्त समाधान जोड़ें।
- 20% मीडिया को DMSO के जोड़कर रूप में इस प्रकार चार 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, DMSO के / मीडिया मिश्रण बनाने के। 500 μl DMSO के साथ (5%) 9.5 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें। 250 μl DMSO के साथ (2.5%) 9.75 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें। 10 एमएल मीडिया (इनमें से दो बनाने के लिए) जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ऊपर उल्लिखित मीडिया मिश्रण गर्मी। तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं को हटाने और सूखी बर्फ पर जगह है। मीडिया के मिश्रण को गर्म कर रहे हैं जब बस thawed, जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं पिघलना। यह कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है के रूप में भी लंबे समय के लिए पानी के स्नान में कोशिकाओं को मत छोड़ो।
- 5% DMSO के / मीडिया ट्यूब के लिए क्रायोजेनिक शीशी की सामग्री को स्थानांतरित। आठ मिनट के लिए 410 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र। सेल गोली छोड़ने महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। 2.5% DMSO के / मीडिया ट्यूब की सामग्री को गोली और अनुसंधान सेल में जोड़ेंesuspend। आठ मिनट के लिए 410 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र। सेल गोली छोड़ने महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
- गोली और resuspend सेल करने के लिए एक 0% DMSO के / मीडिया ट्यूब की सामग्री जोड़ें। आठ मिनट के लिए 410 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र। सेल गोली छोड़ने महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
- सेल गोली और resuspend के लिए दूसरी 0% DMSO के / मीडिया की सामग्री जोड़ें। सेल की गिनती के लिए छोटा सा नमूना ले लो। आठ मिनट के लिए 410 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र। एक रुधिरकोशिकामापी में centrifuging गिनती कोशिकाओं Trypan ब्लू का उपयोग करते समय मृत कोशिकाओं को लेबल करने के लिए। रिकॉर्ड सेल राशि है, साथ ही व्यवहार्यता।
- सेल गोली छोड़ने महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। 10% NRCM मीडिया में Resuspend (वैकल्पिक: 100 माइक्रोन bromodeoxyuridine (BrdU) जोड़ने) fibronectin लेपित व्यंजन पर और प्लेट कोशिकाओं।
6. सेल संस्कृति
- 2 सेमी प्रति के बारे में 100k कोशिकाओं में प्लेट कोशिकाओं। संस्कृति के उपयोग के आधार पर चढ़ाना घनत्व को समायोजित करें। एक 01:10 के अनुपात में IMDM में 20% मीडिया गिराए द्वारा 2% NRCM मीडिया तैयार करें। निम्नलिखित एक विशिष्ट संस्कृति की एक रूपरेखा है। </ ली>
- 1 दिन, दूर गर्म IMDM के साथ मृत कोशिकाओं कुल्ला 10% NRCM (वैकल्पिक 100 माइक्रोन BrdU) जोड़ें। 2 दिन, दूर गर्म IMDM के साथ मृत कोशिकाओं कुल्ला 10% NRCM जोड़ें। 3 दिन-जोड़ 2% NRCM। 4 दिन पर 2% NRCM जोड़ें। दिन 5 पर कोशिकाओं मिला हुआ है और पिटाई कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं। चारों ओर एक सप्ताह के लिए संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने। उस बिंदु पर fibroblasts के काफी NRCMs विकसित हो जाना शुरू हो सकता है।
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Representative Results
नवजात चूहे cardiomyocytes के अलगाव के बाद, कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन के लिए नीचे जमे हुए हैं, और कम से कम कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है। आमतौर पर विगलन पर, Trypan ब्लू विश्लेषण द्वारा निर्धारित व्यवहार्यता 40-60% के बीच हो जाएगा। यह उचित बोने और संस्कृति के साथ, अन्य प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में कम है हालांकि कोशिकाओं (चित्रा 1) पैदा करना होगा। सिकुड़ना को सत्यापित करने के लिए, कोशिकाओं को एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged किया जा सकता है। कोशिकाओं अनायास बारे में तीन दिन (चित्रा 2) के भीतर अनुबंध करने के लिए शुरू करना चाहिए। Immunocytochemistry (आईसीसी) assays के लिए, कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति 200,000 कोशिकाओं के साथ 4 अच्छी तरह से संस्कृति स्लाइड्स में चढ़ाया गया। आदेश में संस्कृति में कोशिकाओं कोशिकाओं α-एसए के साथ लेबल रहे थे NRCMs हैं और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged कि दिखाने के लिए। संस्कृति में NRCMs (चित्रा 4) का संकेत कई α-एसए सकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं। अन्य प्रयोगों संस्कृति सहित प्रदर्शन किया गया हैमानव हृदय की स्टेम सेल व्युत्पन्न exosomes साथ ट्यूरिंग NRCMs exosomes (चित्रा 5) के पुनर्योजी गुणों का परीक्षण करने के लिए।
चित्रा 1. NRCM इन विट्रो। Α-एसए (हरा), Ki67 (लाल) के लिए धुंधला के साथ NRCM की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि में प्रसार, और DAPI दोनों (ए) के लिए (नीला) हौसले से अलग NRCMs और (बी) cryopreserved तो thawed NRCMs। तीर कोशिकाओं proliferating संकेत करता है (ki67 पॉजिटिव)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इन विट्रो। NRCMs spontane में Cryopreserved और thawed NRCM चित्रा 2. संकुचनously इन विट्रो में करार। सिकुड़ना बरामद किया है इससे पहले कि हौसले से अलग NRCMs के विपरीत, यह एक कुछ दिन लग सकते हैं। वीडियो पांच दिनों विगलन के बाद दर्ज किया गया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा इन विट्रो में हौसले से अलग NRCM 3. संकुचन। हौसले से अलग NRCMs अनायास इन विट्रो में करार। इन कोशिकाओं को बहुत जल्दी सिकुड़ना प्रदर्शन करने के लिए शुरू हो जाएगा। वीडियो 3 दिन के अलगाव के बाद दर्ज किया गया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
NRCM संस्कृति चित्रा 4. पवित्रता। </ Strong> के हौसले संस्कृति में 5 दिनों के बाद संस्कृति और (बी) cryopreserved में NRCMs और thawed NRCMs पृथक दोनों (ए) के प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी छवियों। NRCMs नाभिक (नीला) α-एसए से घिरा नहीं कर रहे हैं, जहां fibroblasts के देखा जा सकता है जबकि α-एसए (हरा) के लिए सकारात्मक धुंधला दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा सेल आधारित परख के लिए Thawed NRCM 5. प्रयोग करें। NRCMs के confocal माइक्रोस्कोपी छवि, α-एसए (हरा) से प्रकाश डाला, कार्डियक स्टेम सेल से DiI लेबल exosomes (लाल) के साथ incubated। DAPI (नीला) के साथ लेबल सेल नाभिक। एक oxidative तनाव मॉडल बनाने के क्रम में, NRCMs पूर्व exoso साथ incubated किया जा रहा है, 18 घंटे के लिए 100 माइक्रोन हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज किया गयाचार घंटे के लिए एमईएस oxidative तनाव रिवर्स करने के लिए। तीर कुछ कोशिकाओं में उच्च exosome सांद्रता के क्षेत्रों से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
NRCMs, पृथक cryopreserved, और thawed किया जा करने के लिए इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है। कोशिकाओं विगलन प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। DMSO के dilutions की एक श्रृंखला धीरे-धीरे 14 कोशिकाओं से DMSO के दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह DMSO के निष्कर्षण कोशिकाओं विगलन के तुरंत बाद मरने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हैं के रूप में जल्दी से प्रदर्शन किया जा है कि महत्वपूर्ण है। कम या ज्यादा कोशिकाओं विगलन के लिए आवश्यक हैं, तो जरूरत के रूप में, DMSO के समाधान की मात्रा पर पहुंचा जा सकता है।
NRCM अलगाव और संस्कृति के लिए एक चुनौती fibroblasts की तेजी से प्रसार है। इस प्रोटोकॉल fibroblasts के 15 की संख्या को कम करने के लिए दिखाया गया है जो preplating उपयोग करता है। Fibroblasts के cardiomyocytes की तुलना में बहुत तेजी से देते हैं जो करने के लिए uncoated बोतल का उपयोग करके काम करता है Preplating। मीडिया परिवर्तन के अनुक्रम fibroblast वृद्धि को कम करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। Fibroblasts 10% NRCM मीडिया में NRCMs विकसित हो जाना होगा, लेकिन fibroblast वृद्धि 2% NRCM मेड में काफी धीमी हैमैं एक। पूर्व fibroblast वृद्धि 3 धीमा करने के लिए 16,17 या BrdU के अलावा चढ़ाना के लिए तंतुप्रसू दूर करने के लिए इस तरह के Percoll ढ़ाल के रूप में अन्य तरीके हैं। अत्यधिक fibroblast वृद्धि चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है, लेकिन आसानी से NRCM ऐसे α-सा के रूप में विशिष्ट धुंधला (चित्रा 3) का उपयोग करते हुए दिखाया गया है। अत्यधिक fibroblast वृद्धि वहां रहता है, तो मीडिया में FBS की राशि दिन 2. यदि आवश्यक हो पर 2% FBS के लिए कम किया जा सकता है, चढ़ाना इस वृद्धि की कोशिका मृत्यु में हो सकता है, हालांकि, 5% FBS के मीडिया में किया जा सकता है।
यह प्रक्रिया सीमित है और कोशिकाओं 18,19 की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है कि सेल संस्कृतियों का उपयोग कर अगर अब कोई फायदेमंद है। जरूरत कोशिकाओं की राशि को एक कूड़े से फसल के लिए संभव कोशिकाओं की आधी राशि दृष्टिकोण मामलों में जहां, इस प्रक्रिया कोशिकाओं के लगभग आधा cryopreservation की वजह से खो रहे हैं के बाद से अधिक जानवरों की आवश्यकता होगी। कम सेल का उपयोग करते समय cryopreservation का लाभ अधिक से अधिक कर रहे हैंऐसे immunostaining के रूप में assays के लिए LS।
इस प्रोटोकॉल अलगाव, cryopreservation, और NRCMs के बाद के लिए तरीकों को दिखाता है। इस तरह इस पद्धति का उपयोग करने के लिए, विक्रेताओं से जमे हुए कोशिकाओं खरीदने लेकिन खरीदने कोशिकाओं कुछ प्रयोगशालाओं के लिए अत्यधिक लागत हो सकता है के रूप में कुछ विकल्प हैं। हमारे तरीके ही आमतौर पर सेल संस्कृति में प्रयुक्त सामग्री और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग को कम करते हुए इसके अलावा, इन तरीकों का उपयोग बहुत प्रयोगशाला काम की दक्षता और लचीलेपन में वृद्धि कर सकते हैं। वर्णित विधियों इन विट्रो अध्ययन में बाद के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि व्यवहार्य संस्कृतियों का उत्पादन।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
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