Introduction
心筋細胞の細胞培養は、現代の心臓の研究における重要なツールである。単離および培養成体ラット心筋細胞1よりも容易であるので、新生児ラット心筋細胞（NRCMs）が一般的に使用される。 NRCM方法はまだ長い分離手順とディッシュ内の限られた細胞増殖を含む、いくつかの制限を有する。最も一般的な作業2-6の4-48時間を必要とNRCMsの単離のための多数のプロトコルがあります。さらに、細胞はしばしば2,4-7 1~2日齢のラットの仔から単離される。出産のタイミングは予測できないと研究室で他の作業と競合することができます。細胞のわずかな量は、実験に必要とされる場合に単離が非効率的で無駄にすることができる。分離時間を短縮することにワークフローのフォーカスを改善する上でほとんどの努力は、まだこれは子犬の出産のタイミングの問題を解決しない。
代替案として、多くのラボでは、利用胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPS細胞）に由来する心筋細胞。しかし、再プログラミングおよび/または分化のプロセスも非常に時間がかかり、コストがかかる可能性がある。 インビトロ筋細胞モデルとして、これらの細胞を使用した場合、他の問題が存在し得る。両方ESC-とiPSC-由来の心筋細胞を初代心筋8-10からの電気の違いを示すことが示されている。
解離NRCMs冷蔵11を用いて、数日間保存することが可能であり、まだこれは、長期保存を可能にしない。液体窒素は、典型的には、時間の大きな期間、細胞を保存するために使用されるが、ジメチルスルホキシド（DMSO）などの凍結防止剤を必要としている。これまでの研究では、凍結メディア5-10％DMSOの間の理想的な濃度はNRCMsの凍結保存を可能にすることが示されている、まだその時でさえ生存率は低い12のまま。 DMSOは、無料の間に細胞を保護するのに役立ちますが、熱意は、それは1.5％13以上の濃度で細胞に対して毒性であり得る。以前の研究は、ゆっくり細胞からDMSOを除去し、細胞生存率14を改善することができることを示している。
我々は、単離後に凍結保存細胞によるNRCM細胞ベースのアッセイの効率を改善しようとした。これは、細胞を解凍し、必要に応じて、単離および動物の消費の頻度を低減する際に使用することを可能にする。この方法を使用して、我々はそれがNRCMsを凍結保存し、後で使用するために解凍することが可能であることを示す。解凍後、細胞は、許容可能な生存能力を維持し、自然発生的にα-筋節アクチニン（α-SA）との契約について陽性であるNRCM文化を作り出す。
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Protocol
以下のプロトコルは、新生児仔ラット（10〜14匹）の1リットルから心筋細胞を分離するために設計されています。産子数が大幅に異なる場合は、手順は、補償するためにスケーリングされなければならないことがある。子犬は約48±6時間古いすべきである。すべての手順は、ここにノースカロライナ州立大学施設内動物管理および使用委員会（IACUC）によって承認されている。
1.細胞の単離の準備
注：分離前の日には、次の手順を実行。
- 大はさみ、小さなはさみ、小さな鋭い鉗子、大鉗子：以下のオートクレーブ。 121℃、30分の乾燥時間を最小で60分間重力サイクルを使用する。
- O / Nを解凍する冷蔵庫で0.1％トリプシン溶液の40ミリリットルを置きます。冷蔵ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）すでに寒さではない場合。 20％ウシ胎児血清（FBS）のストックメディア溶液を調製する。
- Iscは400mlにオベ改変ダルベッコ培地（IMDM）は100ミリリットルFBS 5mlのL-グルタミン（200 mM）を2.5 mlのゲンタマイシン（10mgの溶液-1）、及び0.9ミリリットルの2-メルカプトエタノールを加える。真空フィルターを用いて滅菌する。最大3週間、4℃で保存メディア、これは小さくても大きくボリューム用のスケーラブルです。 10％のFBS NRCMメディアを生成するためにIMDMで1：20％のFBSの株式メディア1を希釈する。メディアだけの繰り返し加熱と冷却を防止するために、小さなバッチで作る。
2.細胞の単離1日目
- 試料の汚染を防止するために、培養フード内で次の作業を行う。 O / Nインキュベーションがあるので、最高のタイミングについては、午後にこの作業を開始。
- 無菌培養フードの内側にワークスペースを準備します。培養フードでベンチパッドを配置します。 70％エタノールで2 250ミリリットルのビーカーを記入し、その中に手術器具を置く。フード内氷の小さなバケツを置きます。それはいくつかのチューブと150ミリメートルディッシュを保持するのに十分な大きさであることを確認してください。 FOフードを殺菌するUVrは10分。氷上で40ミリリットルの0.1％トリプシンを置きます。
- 母親から新生児ラットの子を取得します。使用するまで暖かい動物を維持するには、そのような暖かいそれらを保つためにベンチパッドに包まれたアイスバケットなどの断熱容器に配置します。
- 25ミリリットルHBSSで150ミリメートル培養皿を記入し、氷上に置きます。ワークエリア2-3ガーゼパッドと場所をアンラップ。首の後ろの皮膚によって子犬を持ち、フード内の70％エタノールと場所でそれをスプレー。注：最高の無菌性を維持するために、これはその後フードで洗浄子犬を置く別の人によって行うことができている。
- 首の後ろの皮膚によって子犬を持ってください。その後、断頭により安楽死させる1迅速、強力なカットで、大規模なハサミを使用して。ガーゼで血を吸い取る。注：によりIACUC要件の差異に、むしろそれを噴霧よりワイプエタノールで子犬をきれいにするより適切である。このステップの彼らのガイドラインとして、大学動物実験委員会に確認してください。
- CHの前方側を伐採続行胸郭を通じてEST。心が表示されるまで胸郭を開く助けるために首に皮膚をつまんで。小さなハサミを使用して、氷上でHBSS培養皿に心と場所を削除します。他の子犬のために繰り返します。
- サンプルから任意の非心臓組織を削除し、心を洗って優しくHBSSを旋回。新鮮なHBSSを含む別の培養皿に心臓組織を移し、さらなる組織を洗う。ピース1-3 mm 3になるまで、さらに組織を切断した後、トリプシン溶液に移す。 4℃の冷蔵庫のO / Nでロッカー上のトリプシン溶液を置きます。
細胞分離2日目
注：以下のステップで吸引しながら、真空ラインではなく、ピペットを使用しています。組織は簡単に移動し、真空ラインは、依然として細胞を含む組織を詰まらせたり削除します。それは、代わりに吸引用のピペットを使用するのが最適です。組織は、ピペットを入力すると、ピペットはそれを削除するにはバックアウト。
- トンを作る10％のNRCMメディアのHREE分量：15ミリリットルと25ミリリットルと1と2。 37℃の水浴中で媒体の一つの25mlチューブを置き。 5別の15ミリリットルコニカルチューブに4ミリリットルHBSSを追加し、氷上にすべてを置く。各15ミリリットルチューブ＃1-5にラベルを付けます。
- 50ミリリットルコニカルチューブに40ミリリットルHBSSを追加します。 、コラゲナーゼにHBSSの10ミリリットルを追加します。中断するピペット、および1mg mlのコラゲナーゼ-1溶液50mlを作成するためのソリューションを組み合わせる。 0.22μmの真空フィルターを用いて滅菌し、室温で保存。
- 心臓組織/トリプシンチューブを取得します。トリプシンがクリアされている、と組織がふわふわ表示されていることを確認してください。組織がチューブと吸引の隅に限り液体できるだけを決済できるようにする。
- 手でチューブと渦に25ミリリットル暖かい、10％FBS NRCMメディアを追加します。キャップおよび2分間37℃の水浴中で回転させる。再び吸引する液体。組織は、この段階でフロートべきである。もしそうであれば、管の底から吸引する。
- 10ミリリットルのコラゲナーゼを追加します。 2分間または溶液が濁るまで、水浴中で回転させる。屈原ickly液体を吸引。組織を含むチューブに10ミリリットル新鮮なコラゲナーゼを追加し、2分間水浴中で回転させる。ピペット、チューブ＃1に転送ソリューションを混合し、氷上に配置する。これは、全ての液体を除去することができない場合があります。繰り返して、他の3 15ミリリットルコニカルチューブ用3.2から3.6を繰り返します。チューブ＃5に残りの液体を転送します。
- 遠心機8分間410 RCFで15 mlチューブ。遠心分離しながら、水浴中で15ミリリットルの10％FBS NRCMメディア管を配置。 50ミリリットルコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーを配置し、2ミリリットル冷HBSSで濡れた。
- スピンダウンした細胞からの上清を吸引。各チューブを再懸濁に6ミリリットル冷HBSSを追加します。を50mlコニカルにストレーナを介してピペット細胞懸濁液は、任意の組織を除去した。 3ミリリットル冷たいHBSSで各15ミリリットルチューブの側面をすすぎ、ストレーナに追加する。 10分間410は、rcfで遠心細胞。上清を吸引。 T-75フラスコに10ミリリットルの10％FBS NRCMメディア転送で再懸濁細胞ペレット。 5ミリリットルメディアと円錐をすすぎ、FLに追加お願いします。
- 37℃で1時間および5％CO 2でインキュベート。水浴中に置き、最後の15ミリリットルの10％FBS NRCMメディア管。 T-75の新しいT-175フラスコの内容を転送、15ミリリットルのメディアでT-75をすすぎ、T-175に追加する。 1時間インキュベートする。
4.凍結保存
- 氷上で凍結メディアを配置します。 T-175〜50ミリリットルの円錐管から細胞培地を移し、そしてトリパンブルーを用いて細胞計数のために、細胞懸濁液10μlを集める。 5分間410 RCFで遠心分離する。遠心分離しながら、細胞カウンターを用いて細胞数を計測する。
- 1mlあたり2から4000000細胞の濃度で凍結培地中で吸引し、培養培地、および細胞を再懸濁する。極低温バイアルに1mlの細胞懸濁液を置き、次に場所は制御された冷却容器を凍結速度、及びCの冷凍庫O / N°-80の代わりバイアル。 1~2日以内に、液体窒素中にバイアルを転送する。
5.解凍細胞
- 250μlの溶解することによりフィブロネクチンでコートディッシュ60; 9.75ミリリットルの水（最終濃度0.025 mgのミリリットル-1）へのフィブロネクチン（ストック濃度1mgのミリリットル-1）の。培養プレートをカバーし、少なくとも30分間、37°C のでインキュベートするのに十分な溶液を加える。
- 20％のメディアにDMSOを追加することによって、次のように4 15ミリリットルコニカルチューブでは、DMSO /メディアの混合物を作る。 500μlのDMSOで9.5ミリリットルメディア（5％）を追加します。 250μlのDMSOで（2.5％）9.75ミリリットルのメディアを追加します。 10ミリリットルメディア（これらのうちの2つを作る）を追加します。
- 37℃の水浴中で、前述のメディア混合物を加熱する。液体窒素から細胞を取り出し、ドライアイス上に置きます。メディア混合物が温かいときにだけ解凍するまで、37℃の水浴中で細胞を解凍する。これは、細胞に損傷を与える可能性があるが長すぎるために水浴中で細胞を放置しないでください。
- 5％DMSO /メディア管に極低温バイアルの内容を転送します。 8分間410 RCFで遠心分離する。上清を吸引し、細胞ペレットを残す。細胞ペレットとrに2.5％DMSO /メディア管の内容を追加します。esuspend。 8分間410 RCFで遠心分離する。上清を吸引し、細胞ペレットを残す。
- 細胞ペレットを再懸濁に1 0％DMSO /メディア管の内容を追加します。 8分間410 RCFで遠心分離する。上清を吸引し、細胞ペレットを残す。
- 細胞ペレットを再懸濁する第0％DMSO /メディアの内容を追加します。細胞計数のために少量のサンプルを取る。 8分間410 RCFで遠心分離する。血球計数器で遠心分離カウント細胞がトリパンブルーを使用している間死んだ細胞を標識する。レコード細胞量、ならびに生存率。
- 上清を吸引し、細胞ペレットを残す。 10％のNRCMのメディアに再懸濁（オプション：100μMのブロモデオキシウリジン（BrdU）の追加）フィブロネクチンコートディッシュ上とプレートの細胞を。
6.細胞培養
- 1cm 2当たり約100Kの細胞でプレート細胞。文化の使用目的に基づいて、プレーティング密度を調整します。 1：10の割合でIMDM中の20％メディアを希釈することによって2％NRCMメディアを準備します。以下は、一般的な文化の概要である。</ LI>
- 1日目に、10％のNRCM（オプション100μMのBrdU）を追加し、暖かいIMDMで離れて死細胞をすすいでください。 2日目に、10％のNRCMを追加、暖かいIMDMで死細胞を洗い流す。 3日目 - 追加2％NRCMを。 4日目に2％NRCMを追加。 5日目に細胞がコンフルエントと鼓動であることを確認してください。約1週間、培養中の細胞を維持する。その時点で、線維芽細胞はかなりNRCMsを脱却し始める可能性があります。
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Representative Results
新生児ラット心筋細胞の単離後、細胞を液体窒素中に凍結しており、少なくとも数ヶ月間保存することができる。典型的に解凍すると、トリパンブルー分析により決定生存率は40〜60％の間であろう。にもかかわらず、これは適切な播種し、培養して、細胞が（ 図1）を増殖する、他の細胞型より低い。収縮性を確認するために、細胞を、位相差顕微鏡を使用して画像化することができる。細胞が自然発生的に約3日間（ 図2）内に収縮を開始する必要があります。免疫細胞化学（ICC）アッセイのために、細胞を、ウェル当たり200,000細胞を4ウェル培養スライドにプレーティングした。培養中の細胞は、細胞がα-SAで標識し、蛍光顕微鏡を用いて画像化したNRCMsであることを示すために。培養液中のNRCMs（ 図4）を示す多数のα-SA陽性細胞があります。他の実験は、CULを含む行われてきたエキソソーム（ 図5）の再生特性を試験するために、人間の心臓幹細胞由来のエキソソームでNRCMsをチューリング。
インビトロでの図1. NRCM拡散。（A）新たに単離しNRCMsと（B）凍結保存した後に解凍しNRCMs両方のためのα-SA（緑）、Ki67に（赤）、およびDAPI（青色）の染色とNRCMの蛍光顕微鏡画像。矢印増殖細胞（Ki67の陽性）を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. インビトロで凍結保存し、解凍したNRCMの収縮。NRCMs spontaneously in vitroでの契約。収縮性が回復される前に、新たに単離されたNRCMsとは異なり、それは数日かかる場合があります。ビデオは5日、解凍後に記録した。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
インビトロで新たに単離したNRCM図3.収縮。自然に、in vitroで収縮する新たに単離しNRCMs。これらの細胞は、はるかに早く収縮性を発揮することが開始されます。ビデオは3日、分離後に記録した。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
NRCM文化の図4.純度。<両方の/ strong>の蛍光顕微鏡像（A）したばかりの培養5日後に培養液中のNRCMsおよび（B）に凍結保存し、解凍したNRCMsを単離した。 NRCMsは核（青）はα-SAに囲まれていない場所の線維芽細胞を見ることができるのに対し、α-SA（緑）の陽性染色を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図細胞ベースのアッセイのために解凍NRCMの使用。NRCMsの共焦点顕微鏡画像、α-SA（緑）で強調、心臓幹細胞からのDiI標識エキソソーム（赤）とインキュベートした。 DAPI（青色）で標識した細胞核。酸化ストレスモデルを作成するために、NRCMs前exosoとともにインキュベートされることに、18時間、100μM過酸化水素で処理した。酸化ストレスを逆に4時間mesの。矢印は、いくつかの細胞において高エキソソーム濃度の領域を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、凍結保存され、単離されるべきNRCMsを可能にし、解凍した。細胞を解凍すると、手順の重要な部分である。 DMSOの希釈系列をゆっくりとセル14からDMSOを除去するために使用される。これは、細胞が、解凍後すぐに死ぬに特に敏感であるようにDMSOの抽出を迅速に行うことが重要である。多かれ少なかれ細胞は解凍のために必要とされる場合は、必要に応じて、DMSO溶液の体積は、スケーリングすることができる。
NRCM分離と文化への1つの課題は、線維芽細胞の急速な増殖である。このプロトコルは、線維芽細胞15の数を減らすことが示されているプレめっきを使用する。プレめっきは、線維芽細胞が心筋細胞よりもはるかに高速を添付先のコーティングされていないフラスコを使用して動作します。培地交換のシーケンスは、線維芽細胞増殖を減少させるために変更することができる。線維芽細胞は、10％のNRCMメディアにNRCMsを脱却しますが、線維芽細胞成長は2％NRCM MEDで有意に遅いIA。このような従来の3線維芽細胞増殖を遅らせることが16,17またはBrdUを添加することをめっきする線維芽細胞を除去するパーコール勾配のような他の方法がある。過度の線維芽細胞成長は、位相差顕微鏡を使用して検出することが難しいことができますが、簡単にそのようなα-SA（ 図3）などのNRCM特異的染色を使用して示されている。過度の線維芽細胞成長が残っている場合は必要に応じて、培地中のFBSの量は2日目に2％FBSを小さくすることができ、これは増加した細胞死をもたらすかもしれないが、めっきは、5％FBS培地で行うことができる。
セル18,19を大量に必要とする細胞培養物を使用している場合、この手順では、限られており、もはや有益である。必要な細胞の量は、リターから収穫可能な細胞の半分量に近づく場合、この手順は、細胞の約半分は凍結保存のために失われているので、より多くの動物を必要とする。少ないセルを使用する際に凍結保存のメリットは大きく、そのような免疫染色などのアッセイのためのLS。
このプロトコルは、分離、凍結保存、およびNRCMsのその後のための方法を示しています。そのようなこの方法を使用して、ベンダーからの凍結細胞を買うが、購入する細胞は、いくつかの研究室に法外なコストできるように、いくつかの選択肢があります。我々の方法は、一般に、細胞培養に使用される材料および試薬を必要とする。実験動物の使用を低減しつつ、さらに、これらの方法を利用して大幅に実験室作業の効率性と柔軟性を高めることができる。記載された方法は、in vitro試験において 、後続のために使用することができる生存培養を産生する。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
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