Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolasjon og kryokonservering Neonatal Rat kardiomyocytter

Published: April 9, 2015 doi: 10.3791/52726

Introduction

Cellekultur av kardiomyocytter er et viktig redskap i moderne hjerteforskning. Neonatal rotte cardiomyocytes (NRCMs) blir ofte brukt siden isolasjon og kultur er enklere enn for voksne rotte kardiomyocytter en. Den NRCM metoden har likevel flere begrensninger, inkludert en lang isolasjon prosedyre og begrenset celleproliferasjon i fatet. Det er mange protokoller for isolering av NRCMs med de generelt krever 4-48 timer arbeids 2-6. I tillegg, blir cellene ofte isoleres fra 1 til 2 dager gamle rotteunger 2,4-7; tidspunktet for fødselen kan være uforutsigbar og konflikt med annet arbeid i laboratoriet. De isolasjoner kan være ineffektiv og uøkonomisk hvis bare en liten mengde av celler som er nødvendig for eksperimenter. De fleste innsats på å forbedre arbeidsflyten fokus på å redusere isolasjon tid, men dette løser ikke problemene med timing fødselen av valpene.

Som alternativer, mange laboratorier utnyttekardiomyocytter avledet fra embryonale stamceller (ESCs) eller induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Imidlertid kan omprogrammering og / eller differensiering prosessen være svært tidkrevende og kostbart i tillegg. Det kan være andre problemer ved anvendelse av disse cellene som in vitro myocyte modeller. Begge ESC- og iPSC- avledet kardiomyocytter har vist seg å stille ut forskjeller i elektrofysiologi fra primær kardiomyocytter 8-10.

Dissosierte NRCMs er i stand til å bli lagret i flere dager ved hjelp av nedkjøling 11, men dette ikke tillater for langsiktig lagring. Flytende nitrogen blir typisk brukt for å bevare celler for et større tidsrom, men krever et kryobeskyttende middel slik som dimetylsulfoksyd (DMSO). Tidligere forskning har vist at den ideelle konsentrasjon mellom 5-10% DMSO i iskaldt media åpner for nedfrysing av NRCMs, men selv da levedyktighet fortsatt lav 12. Selv DMSO bidrar til å beskytte cellene under friZing, kan det være giftig for cellene i konsentrasjoner over 1,5% 13. Tidligere studier har vist at langsomt fjerne DMSO fra cellene, kan forbedre cellenes levedyktighet 14.

Vi har søkt å forbedre effektiviteten av NRCM cellebaserte assays ved cryopreservering av cellene etter isolering. Dette gjør det mulig for cellene å bli tint og brukt når det er nødvendig, å redusere hyppigheten av isoleringer og forbruket av dyr. Ved hjelp av denne metoden, viser vi at det er mulig å fryse ned NRCMs og tine dem for bruk på et senere tidspunkt. Etter tining av cellene opprettholde et akseptabelt levedyktighet og produsere NRCM kulturer som er positive for α-sarcomeric actinin (α-SA) og kontrakt spontant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokoll er utformet for isolering av kardiomyocytter fra en kull med neonatale rotteunger (10-14 PUP). Hvis kullstørrelse er vesentlig forskjellig, kan prosedyren må reduseres for å kompensere. Valpene bør være rundt 48 ± 6 timer gammel. Alle prosedyrer her har blitt godkjent av North Carolina State University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Cell Isolation Forberedelse

MERK: Utfør følgende trinn dagen før isolasjon.

  1. Autoklav følgende: store saks, liten saks, små skarpe tang, store tang. Benytte en gravitasjonssyklus i 60 minutter ved et minimum på 121 ° C og en tørketid på 30 minutter.
  2. Plassere 40 ml av 0,1% trypsin-oppløsning i kjøleskap for å tine O / N. Kjøle Hanks balanserte salter Solution (HBSS) hvis det ikke allerede kaldt. Forberede en 20% føtalt bovint serum (FBS) lager medieløsning.
    1. I 400 ml Iscove modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) tilsett 100 ml FBS, 5 ml L-glutamin (200 mM), 2,5 ml gentamicin (10 mg ml-1), og 0,9 ml 2-merkaptoetanol. Steriliser ved hjelp av vakuum filter. Butikken media ved 4 ° C i opptil tre uker, og dette er skalerbar for mindre eller større volumer. Fortynne 20% FBS lager media 1: 1 med IMDM å produsere 10% FBS NRCM media. Bare gjøre i små grupper for å hindre gjentatt oppvarming og kjøling av media.

2. Cell Isolation Dag 1

  1. Utføre følgende arbeid i en kultur hette for å hindre forurensning av prøvene. For beste tidspunktet å starte dette arbeidet i ettermiddag, siden det er en O / N inkubasjon.
  2. Forbered arbeidsområdet inne i en steril kultur hette. Plasser benk pad i kultur hette. Fylle to 250 ml begerglass med 70% etanol og plassere kirurgiske verktøy i dem. Plassere liten bøtte med is i hette. Sørg for at det er stor nok til å romme flere rør og en 150 mm tallerken. UV sterilisere panseret for 10 min. Plasser 40 ml 0,1% trypsin på is.
  3. Hente nyfødte rotteunger fra moren. For å holde dyrene varm inntil bruk, plassere dem i en isolert beholder for eksempel en isbøtte innpakket i en benk pad for å holde dem varme.
  4. Fyll en 150 mm kultur tallerken med 25 ml HBSS og legg på is. Pakk 2-3 gasbind pads og sted i arbeidsområdet. Holder valp av huden på baksiden av halsen, spray det med 70% etanol og sted i hette. MERK: For å best opprettholde sterilitet, dette er kan bli gjort av en annen person som deretter plasserer renset valp i panseret.
  5. Hold pup av huden på baksiden av halsen. Deretter bruke de store saks, i en rask, sterk klippe avlive ved halshogging. Blot blodet med gasbind. MERK: På grunn av variasjoner i IACUC kravene, kan det være mer hensiktsmessig å rengjøre valp med en etanol tørk i stedet for å spraye den. Pass på å sjekke med universitetet IACUC som til sine retningslinjer for dette trinnet.
  6. Fortsette å kutte ned fremre siden av lmest gjennom brystkasse. Klem huden på halsen for å bidra til å åpne brystkasse inntil hjertet er synlig. Bruke liten saks, fjern hjerte og plass i HBSS kultur fatet på is. Gjenta for de andre valpene.
  7. Fjern eventuelle ikke-hjerte vev fra prøvene og virvle HBSS forsiktig å vaske hjertene. Overfør hjertevevet til et annet kulturskål inneholdende frisk HBSS og videre å vaske vevet. Kutt vevet ytterligere inntil bitene er 1-3 mm 3, og deretter overføre til trypsinoppløsning. Plasser trypsinoppløsning på rocker i 4 ° C kjøleskap O / N.

Celle Isolation Dag 2

MERK: Mens aspirere i de neste trinnene, bruk en pipette snarere enn et vakuum linje. Vevet beveger seg lett, og en vakuumledning vil tette eller fjerne vev fremdeles inneholdende celler. Det er best å bruke en pipette for aspirasjon i stedet. Hvis vevet inn i pipetten, pipette ut igjen for å fjerne det.

  1. Gjør three porsjoner av 10% NRCM Media: ett med 25 ml og to med 15 ml. Plasser en 25 ml tube av media i 37 ° C vannbad. Legg 4 ml HBSS til fem forskjellige 15 ml koniske rør og plassere alt på is. Merk hver 15 ml tube # 1-5.
  2. Legg 40 ml HBSS til et 50 ml konisk rør. Tilsett 10 ml HBSS for å kollagenase, pipette for å suspendere, og kombinere løsningene for å lage 50 ml av 1 mg ml -1 kollagenase løsning. Steriliser bruker 0,22 mikrometer vakuum filter, og oppbevar ved RT.
  3. Hente hjertevevet / trypsin tube. Sikre at trypsin er klar, og vevet vises fluffy. Tillate vevet å bosette til hjørnet av rør og aspirer så mye væske som mulig.
  4. Legg 25 ml varm 10% FBS NRCM media til røret og virvel for hånd. Hetten og roterer i 37 ° C vannbad i 2 minutter. Sug væske igjen. Vevet bør flyte på dette trinnet; hvis så, aspireres fra bunnen av røret.
  5. Tilsett 10 ml collagenase. Rotere i vannbad i 2 min eller til oppløsningen er uklar. Quickly aspirer væsken. Tilsett 10 ml friskt kollagenase til rør inneholdende vev, og roterer i vannbad i 2 min. Pipette for å blande, overføring løsning på tube # 1, og legg på is. Det kan ikke være mulig å fjerne all væsken. Gjenta trinn 3,2-3,6 for de andre tre 15 ml koniske rør. Overføre eventuell gjenværende væske til tube # 5.
  6. Sentrifuger 15 ml rør ved 410 RCF i 8 min. Mens sentrifugering, plasserer 15 ml 10% FBS NRCM media tube i vannbad. Plasser 40 um cellefilter på toppen av en 50 ml konisk rør og vått med 2 ml kald HBSS.
  7. Aspirer supernatanten fra spunnet ned celler. Tilsett 6 ml kald HBSS til hvert rør og resuspender. Pipetter cellesuspensjoner gjennom silen inn i 50 ml konisk for å fjerne alle vev. Skyll sider av hver 15 ml tube med 3 ml kald HBSS og legge til sil. Sentrifuger cellene ved 410 RCF i 10 min. Aspirer supernatant. Resuspender cellepelleten i 10 ml 10% FBS NRCM medier og overføring til T-75-kolbe. Skyll konisk med 5 ml media og legge til flspør.
  8. Inkuber i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2. Plassere siste 15 ml 10% FBS NRCM media rør inn vannbad. Overføre innholdet i T-75 til en ny T-175 kolbe, skyll T-75 med 15 ml media og legge til T-175. Inkuber i 1 time.

4. Kryopreservering

  1. Plasser frysing media på is. Overfør cellemedier fra T-175 til 50 ml konisk rør og samle 10 ul av cellesuspensjon for celletelling under anvendelse Trypan blå. Sentrifuger ved 410 RCF i 5 min. Mens sentrifugering, telle celler ved hjelp av en celleteller.
  2. Aspirer dyrkningsmedier, og resuspender cellene i frysemediet ved en konsentrasjon på 2-4 millioner celler per ml. Plassere en ml cellesuspensjon i kryogenisk hetteglass, deretter sted hetteglass en kontrollert kjøling rente frysing container, og plasser i -80 ° C fryser O / N. Løpet av 1-2 dager, overføre ampuller i flytende nitrogen.

5. Tining Cells

  1. Frakk fatet i fibronektin ved oppløsning av 250 fil60; av fibronektin (stock konsentrasjon 1 mg ml -1) i 9,75 ml vann (endelig konsentrasjon 0,025 mg ml-1). Tilsett nok oppløsning til å dekke kulturplate og inkuberes ved 37 ° C i minst 30 min.
    1. I fire 15 ml koniske rør, gjør DMSO / medie blandinger som følger ved å legge DMSO til 20% Media. Legg til (5%) 9,5 ml media med 500 mikroliter DMSO. Legg til (2,5%) 9,75 ml media med 250 pl DMSO. Tilsett 10 ml media (lage to av disse).
  2. Oppvarme de nevnte mediablandinger i 37 ° C vannbad. Fjerne celler fra flytende nitrogen og plasser på tørris. Når mediablandinger er varm, tine-celler i 37 ° C vannbad inntil bare tint. Ikke la celler i vannbad for lenge, da dette kan forårsake skade på cellene.
  3. Overføre innholdet i hetteglasset kryogen til 5% DMSO / mediarøret. Sentrifuger ved 410 RCF i 8 min. Aspirer supernatanten forlate cellen pellet. Legg innholdet i 2,5% DMSO / media rør til celle pellet og resuspend. Sentrifuger ved 410 RCF i 8 min. Aspirer supernatanten forlate cellen pellet.
  4. Legg innholdet i en 0% DMSO / media rør til celle pellet og resuspender. Sentrifuger ved 410 RCF i 8 min. Aspirer supernatanten forlate cellen pellet.
  5. Legg innholdet i andre 0% DMSO / media til celle pellet og resuspender. Ta liten prøve for celletelling. Sentrifuger ved 410 RCF i 8 min. Mens sentrifuge count celler i et hemocytometer ved hjelp av trypanblått å merke døde celler. Post celle beløp, samt levedyktighet.
  6. Aspirer supernatanten forlate cellen pellet. Resuspender i 10% NRCM media (valgfritt: tilsett 100 mikrometer bromdeoksyuridin (BrdU)) og plateceller på fibronektin-belagt retter.

6. Cell Culture

  1. Plate celler på ca 100k celler per cm 2. Juster plette densitet basert på den tiltenkte bruk av kulturen. Forberede 2% NRCM media ved å fortynne 20% Media i IMDM i en 1:10 ratio. Følgende er en oversikt over en typisk kultur. </ Li>
  2. På dag 1, skyll døde celler unna med varm IMDM, tilsett 10% NRCM (valgfri 100 mikrometer BrdU). På dag to, skyll døde celler unna med varm IMDM, legge til 10% NRCM. Dag 3-tilsett 2% NRCM. På dag fire tilsett 2% NRCM. På dag 5 sikre at cellene er sammenflytende og slo. Vedlikeholde celler i kultur for rundt en uke. På det tidspunktet fibroblaster kan begynne å betydelig vokse de NRCMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter isolering av den neonatale rotte kardiomyocytter blir cellene fryses ned til flytende nitrogen, og kan lagres i minst flere måneder. Typisk etter tining, vil levedyktigheten bestemmes ved trypanblått-analyse være mellom 40-60%. Selv om dette er lavere enn de andre celletyper, med riktig såing og kulturen cellene vil spre seg (figur 1). For å verifisere kontraktilitet, kan cellene bli avbildet ved bruk av et fasekontrastmikroskopi. Cellene skal begynne å spontant kontrakt innen ca tre dager (figur 2). For immunocytokjemi (ICC) analyser, ble cellene sådd i 4-brønners kultur lysbilder med 200.000 celler per brønn. For å vise at cellene i kultur er NRCMs ble cellene merket med α-SA og avbildes ved bruk av fluorescens mikroskopi. Det er mange α-SA-positive celler som indikerer NRCMs i kultur (figur 4). Andre forsøk har blitt utført blant CulTuring NRCMs med humane hjertestamcelle-avledet exosomes å teste regenererende egenskaper av exosomes (figur 5).

Figur 1
Figur 1. NRCM sprednings In Vitro. Fluorescensmikroskopi bilde av NRCM med farging for α-SA (grønt), Ki67 (rødt), og DAPI (blå) for både (A) nylig isolerte NRCMs og (B) cryopreserved deretter tint NRCMs. Piler indikerer voksende celler (Ki67-positive). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. sammentrekning av kryopreservert og Tinte NRCM In Vitro. NRCMs spontaneously kontrahering in vitro. I motsetning nyisolerte NRCMs, kan det ta noen dager før kontraktilitet gjenvinnes. Video ble registrert fem dager etter tining. Klikk her for å se denne videoen.

Figur 3
Figur 3. Sammentrekning av Freshly Isolert NRCM In Vitro. Fersk isolert NRCMs spontant kontrahering in vitro. Disse cellene vil begynne å vise kontraktilitet mye raskere. Video ble registrert 3 dager etter isolasjon. Klikk her for å se denne videoen.

Figur 4
Figur 4. Purity av NRCM Culture. </ Strong> fluorescens mikroskop bilder av både (A) nylig isolerte NRCMs i kultur og (B) kryopreservert og tinte NRCMs etter fem dager i kultur. NRCMs viser positiv farging for α-SA (grønn), mens fibroblaster kan sees der kjerner (blå) ikke er omgitt av α-SA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Bruk av Tinte NRCM for cellebaserte analysen. Konfokalmikroskopi bilde av NRCMs, fremhevet av α-SA (grønn), inkuberes med DII-merket exosomes (red) fra hjerte stamceller. Cellekjerner merket med DAPI (blå). For å skape en oksidativt stress modellen, ble NRCMs behandlet med 100 pM hydrogenperoksyd i 18 timer, før den ble inkubert med exosomes i 4 timer for å reversere den oksidative stress. Piler indikerer regioner av høye exosome konsentrasjoner i enkelte celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen tillater for NRCMs som skal isoleres, kryopreservert og tint. Tining av cellene er en viktig del av fremgangsmåten. En serie av fortynninger DMSO brukes til langsomt å fjerne DMSO fra cellene 14. Det er viktig at ekstraksjonen av DMSO utføres raskt som de celler er spesielt følsomme for dør umiddelbart etter tining. Hvis mer eller mindre celler er nødvendig for tining kan volumene av DMSO-løsninger skaleres etter behov.

En utfordring til NRCM isolasjon og kultur er rask spredning av fibroblaster. Denne protokollen bruker forhåndspåleggingen, som har vist seg å redusere antall fibroblaster 15. Forhånds-verk ved hjelp ubestrøket kolber som fibroblaster fester mye raskere enn kardiomyocytter. Sekvensen av medie endringer kan endres for å redusere fibroblastvekstfaktor. Fibroblaster vil vokse NRCMs i 10% NRCM media, men fibroblast vekst er betydelig tregere i 2% NRCM Media. Det finnes andre metoder som Percoll gradienter for å fjerne fibroblast før utplating 16,17 eller tilsetning av BrdU å bremse fibroblast vekst 3. Overdreven fibroblast vekst kan være vanskelig å detektere ved hjelp av fasemikroskopi, men er lett vises ved hjelp av NRCM spesifikk farging som α-SA (figur 3). Hvis det gjenstår dreven fibroblastvekstfaktor, kan mengden av FBS i media bli redusert til 2% FBS på dag 2. Hvis det er nødvendig, kan platekledning bli gjort i 5% FBS medium, selv om dette kan resultere i økt celledød.

Denne fremgangsmåten er begrenset og ikke lenger er fordelaktig ved bruk av cellekulturer som krever store mengder av cellene 18,19. I tilfeller hvor mengden av celler som trengs nærmer seg den halve mengde av celler er mulig å høste fra et kull, vil denne fremgangsmåten krever flere dyr siden omtrent halvparten av cellene er tapt på grunn av nedfrysing. Fordelene med nedfrysing er større ved bruk av færre cells for assays slik som farging.

Denne protokollen illustrerer fremgangsmåter for isolering, nedfrysing, og etterfølgende fra NRCMs. Det finnes noen alternativer, som for eksempel å kjøpe frosne celler fra leverandører, til å bruke denne metoden, men kjøper celler kan koste prohibitive til enkelte laboratorier. Våre metoder krever bare materialer og reagenser som vanligvis brukes i cellekultur. I tillegg kan benytte disse metodene i stor grad øke effektiviteten og fleksibiliteten i laboratoriearbeid og samtidig redusere bruken av forsøksdyr. Metodene som beskrives produsere levedyktige kulturer som kan brukes for etterfølgende in vitro-studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) Gibco 12440-046 With added 25 mM HEPES and L-glutamine
L-glutamine Gibco 25030-081
FBS Hyclone SH30070.03
Gentamicin Gibco 15710-064
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023
HBSS (+Ca +Mg) Corning 21-020-CV With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4
Trypsin 0.25% Gibco 25300-056
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054
Cryostor CS5 BioLife Solutions 205102 Freezing media
Cryogenic Vial Corning 430659
Collagenase Sigma C1889-50MG
40 μm Cell Strainer Greiner Bio-One 542040
Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) Corning 431118
50 ml Conical Corning 430828
15 ml Conical Corning 430790
trypan blue Cellgro 25-900-CI
Mr Frosty Freezing Container ThermoScientific 5100-0001
Millicell EZ SLIDES Millipore PEZGS0416
α-sarcomeric actinin antibody Sigma A7811
Fibronectin Corning 356008
Bromodeoxyuridine BD Biosciences 51-7581KZ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  2. Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
  3. Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
  4. Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
  5. Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
  6. Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
  7. Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
  8. Fu, J. -D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
  9. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
  12. Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
  13. Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
  14. Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
  15. Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
  16. Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
  17. Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
  18. Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
  19. Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).

Tags

Developmental Biology Nedfrysing kardiomyocytter Cell-baserte analysen Cell Culture Cardiac Forskning In Vitro analysen
Isolasjon og kryokonservering Neonatal Rat kardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vandergriff, A. C., Hensley, M. T.,More

Vandergriff, A. C., Hensley, M. T., Cheng, K. Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (98), e52726, doi:10.3791/52726 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter