Introduction
Cultura de células de cardiomiócitos é uma ferramenta crítica na pesquisa cardíaca moderna. Cardiomiócitos de ratos neonatais (NRCMs) são comumente utilizados uma vez que o isolamento e a cultura é mais fácil do que a de cardiomiócitos de rato adulto 1. O método NRCM ainda tem várias limitações, incluindo um procedimento de isolamento e a proliferação celular a longo limitada no prato. Existem numerosos protocolos para o isolamento de NRCMs com mais geralmente requerem 4-48 horas de trabalho 2-6. Além disso, as células são frequentemente isoladas a partir de 1 a filhotes de 2 dias de idade de ratos 2,4-7; o momento do nascimento pode ser imprevisível e conflito com outro trabalho no laboratório. Os isolamentos pode ser ineficiente e dispendiosa se apenas uma pequena quantidade de células são necessários para as experiências. A maioria dos esforços na melhoria do fluxo de trabalho o foco na redução do tempo de isolamento, mas isso não resolve os problemas de cronometrar o nascimento dos filhotes.
Como alternativas, muitos laboratórios utilizamcardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias (CES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). No entanto, o processo de reprogramação e / ou a diferenciação pode ser muito demorado e dispendioso, bem. Podem existir outros problemas quando se utiliza estas células como modelos in vitro de miócitos. Ambos ESC- e iPSC- cardiomiócitos derivados têm sido mostrados para apresentar diferenças de eletrofisiologia de cardiomiócitos primários 8-10.
NRCMs dissociadas são capazes de serem armazenados durante vários dias, usando refrigeração 11, no entanto, esta não permite a armazenagem a longo prazo. O nitrogénio líquido é tipicamente usado para preservar as células para um período de tempo maior, mas requer um crioprotector tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO). Pesquisas anteriores mostraram que a concentração ideal entre 5-10% DMSO na mídia congelamento permite a criopreservação de NRCMs, mas mesmo assim a viabilidade permanece baixa 12. Embora DMSO ajuda a proteger as células durante a livreXing, que pode ser tóxico para células em concentrações acima de 1,5% 13. Estudos anteriores têm demonstrado que a remoção de DMSO lentamente a partir das células, pode melhorar a viabilidade celular 14.
Procurou-se melhorar a eficiência de ensaios baseados em células NRCM por criopreservação das células após o isolamento. Isto permite que as células a ser descongelado e utilizado quando necessário, reduzindo a frequência de isolamento e o consumo dos animais. Usando este método, que mostram que é possível criopreservar NRCMs e descongelar-los para uso numa altura posterior. Depois de descongelar as células manter uma viabilidade aceitável e produzir culturas NRCM que são positivas para sarcomérica α-actinina (α-SA) e contraem espontaneamente.
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Protocol
O protocolo a seguir é projetado para o isolamento dos cardiomiócitos de uma ninhada de filhotes de ratos neonatos (10-14 filhotes). Se o tamanho da leitegada é significativamente diferente, o procedimento pode ter de ser escalado para compensar. Os filhotes devem ser em torno de 48 ± 6 horas de idade. Todos os procedimentos aqui foram aprovados pela North Carolina State University Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).
1. Preparação cela de isolamento
NOTA: Execute as seguintes etapas no dia anterior isolamento.
- Autoclave os seguintes: grandes tesouras, tesouras pequenas, pequenas pinças afiadas, grandes fórceps. Use um ciclo de gravidade durante 60 minutos a um mínimo de 121 ° C e um tempo de secagem de 30 minutos.
- Colocar 40 ml de solução de tripsina a 0,1% em frigorífico para descongelar S / N. Sais Equilibrados Solução de Refrigerar Hank (HBSS) se já não estiver frio. Prepare um soro de bovino (FBS) solução de mídia estoque fetal 20%.
- Em 400 ml de Iscmeios Dulbecco modificado por ove (IMDM) adicionar 100 ml de FBS, 5 mL de L-glutamina (200 mM), 2,5 ml de gentamicina (10 mg mL -1), e 0,9 ml de 2-mercaptoetanol. Esterilizar usando filtro de vácuo. Meios Armazenar a 4 ° C durante até 3 semanas e esta é escalável para volumes maiores ou menores. Dilui-se 20% de FBS meios estoque 1: 1 com IMDM para produzir 10% de meio de FBS NRCM. Apenas fazer em pequenos lotes para evitar um aquecimento e resfriamento de mídia repetido.
2. cela de isolamento Dia 1
- Execute o seguinte trabalho em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras. Para melhor momento iniciar este trabalho no período da tarde uma vez que existe um O / N incubação.
- Prepare espaço de trabalho dentro de uma capa de cultura estéril. Coloque pad banco na capa de cultura. Encha dois copos de 250 ml com 70% de etanol e coloque os instrumentos cirúrgicos por eles. Coloque pequeno balde de gelo no capô. Certifique-se de que é grande o suficiente para armazenar vários tubos e um prato de 150 milímetros. UV esterilizar o capô for 10 min. Colocar 40 ml de tripsina a 0,1% em gelo.
- Recuperar filhotes de ratos recém-nascidos da mãe. Para manter os animais quente até uso, coloque-os em um recipiente isolado, como um balde de gelo envolto em um bloco de banco para mantê-los aquecidos.
- Encha uma 150 milímetros prato de cultura com 25 ml de HBSS e colocar no gelo. Unwrap 2-3 compressas de gaze e coloque na área de trabalho. Segurando pup pela pele na parte de trás do pescoço, pulverizá-lo com etanol e 70%, em lugar do exaustor. NOTA: Para melhor manter a esterilidade, isto é pode ser feito por uma outra pessoa que, em seguida, coloca o filhote limpo no capô.
- Segurar o cachorro pela pele na parte de trás do pescoço. Em seguida, usando as grandes tesouras, em um rápido corte forte, eutanásia por decapitação. Blot o sangue com gaze. NOTA: Devido a variações nas exigências IACUC, pode ser mais apropriado para limpar o filhote com um etanol em vez de limpar aspersão. Certifique-se de verificar com a universidade IACUC como às suas diretrizes para essa etapa.
- Continuar a cortar face anterior da chest através da caixa torácica. Apertar a pele no pescoço para ajudar a abrir a caixa torácica até que o coração é visível. Usando as pequenas tesouras, remover o coração e o lugar em HBSS prato de cultura em gelo. Repita o procedimento para os outros filhotes.
- Remova qualquer tecido não-cardíaca a partir das amostras e agite a HBSS suavemente para lavar os corações. Transferir o tecido do coração para outro prato de cultura contendo HBSS e lavar o tecido. Corte o tecido mais até que as peças são 1-3 mm 3, e depois transferir para a solução de tripsina. Coloque solução de tripsina no balancim em 4 ° C geladeira O / N.
Isolamento celular Dia 2
NOTA: Enquanto a aspiração nas etapas seguintes, utilizar uma pipeta, em vez de uma linha de vácuo. O tecido se move com facilidade, e uma linha de vácuo vai entupir ou remover o tecido ainda contendo células. É melhor usar uma pipeta de aspiração em seu lugar. Se o tecido entra na pipeta, pipeta de volta para removê-lo.
- Faça três alíquotas de 10% NRCM Mídia: um com 25 ml e dois com 15 ml. Coloque um tubo de 25 ml de meios de comunicação em 37 ° C banho de água. Adicionar 4 ml HBSS para 5 diferentes 15 ml tubos cônicos e coloque tudo no gelo. Escreva em cada 15 ml tubo # 1-5.
- Adicionar 40 ml de HBSS para um tubo cónico de 50 ml. Adicionar 10 ml de HBSS a colagenase, pipeta para suspender, e combinar as soluções para criar 50 ml de 1 mg ml -1 solução de colagenase. Esterilizar usando 0,22 um filtro de vácuo, e armazenar à temperatura ambiente.
- Recuperar coração tubo de tecido / tripsina. Certifique-se de que a tripsina é clara, e o tecido aparece fofo. Permitir que o tecido para liquidar a esquina do tubo e aspirar o máximo de líquido possível.
- Adicionar 25 ml quente 10% mídia FBS NRCM ao tubo e agite com a mão. Cap e rodar em 37 ° C num banho de água durante 2 min. Aspirar líquido novamente. O tecido deve flutuar nesta etapa; em caso afirmativo, aspirado a partir do fundo do tubo.
- Adicionar 10 ml de colagenase. Gire em banho-maria por 2 min ou até que a solução está turva. Quickly aspirar o líquido. Adicionar 10 ml de colagenase fresco ao tubo contendo o tecido e rodar em banho de água durante 2 min. Pipeta para misturar, solução de transferência de tubo # 1, e colocar no gelo. Pode não ser possível retirar todo o líquido. Repita os passos de 3,2-3,6 para os outros três tubos de 15 ml cônicas. Transferir o líquido remanescente para tubo # 5.
- Centrifugar tubos de 15 ml a 410 rcf durante 8 min. Enquanto centrifugação, coloque 15 ml de 10% tubo de mídia FBS NRCM em banho-maria. Colocar 40 um filtro de células no topo de um tubo cónico de 50 ml e molhado com 2 ml de HBSS frio.
- Aspirar o sobrenadante a partir de células centrifugadas. Adicione 6 ml frio HBSS a cada tubo e ressuspender. As suspensões de células pipeta através do filtro em 50 ml cónico para remover qualquer tecido. Lavar os lados de cada tubo de 15 ml com 3 ml de HBSS frio e adicionar ao filtro. Centrifugar células a 410 rcf durante 10 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender pellet celular em 10 ml 10% de media FBS NRCM e transferência para T-75 frasco. Enxágüe cônico com media de 5 ml e adicionar à flperguntar.
- Incubar durante 1 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Coloque últimos 15 ml 10% tubo de mídia FBS NRCM em banho-maria. Conteúdo de T-75 para um novo frasco T-175 Transferir, enxaguar T-75 com 15 ml de meio e adicionar a T-175. Incubar durante 1 h.
4. Criopreservação
- Coloque mídia congelamento no gelo. Transferência de mídia a partir de células T-175 a 50 ml tubo cônico, e coletar 10 ml de suspensão celular para celular contagem utilizando Trypan azul. Centrifugar a 410 rcf durante 5 min. Enquanto a centrifugação, contagem de células usando um contador de células.
- Aspirar meios de cultura de células, e ressuspender em meio de congelação a uma concentração de 2-4.000.000 células por ml. Coloque 1 ml de suspensão de células em criotubo, então lugar frascos uma taxa controlada de refrigeração recipiente de congelamento, e coloque no freezer -80 ° C O / N. Dentro de 1-2 dias, transferem frascos em azoto líquido.
5. descongelamento de células
- Prato Brasão em fibronectina dissolvendo 250 ul60; de fibronectina (concentração de 1 mg ml-1) em 9,75 ml de água (concentração final de 0,025 mg mL -1). Adicionar solução suficiente para cobrir as placas de cultura e incuba-se a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
- Em quatro de 15 ml tubos cônicos, fazer as misturas DMSO / mídia da seguinte forma adicionando DMSO a 20% de Mídia. Adicionar (5%) 9,5 ml de meio com 500 ul de DMSO. Adicionar (2,5%) 9,75 ml de meio com 250 ul de DMSO. Adicionar 10 ml de mídia (fazer duas delas).
- Aqueça as misturas de mídia acima mencionadas em 37 ° C banho de água. Remover as células a partir de azoto líquido e colocar em gelo seco. Quando misturas de mídia são quentes, descongelar as células em 37 ° C banho de água até pouco descongelado. Não deixe as células em banho-maria por muito tempo, pois isso pode causar danos às células.
- Transferir conteúdo do frasco criogênico a 5% tubo de DMSO / media. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular. Adicione o conteúdo do tubo de 2,5% DMSO / media para a célula pellet e resuspend. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular.
- Adicionar conteúdo de um tubo de 0% DMSO / media para a célula pellet e ressuspender. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular.
- Adicionar conteúdo da segunda 0% DMSO / media para pellet celular e ressuspender. Tome pequena amostra para contagem de células. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Enquanto centrifugação células de contagem em um hemocitómetro utilizando Trypan Blue para rotular as células mortas. Quantidade de células Record, bem como a viabilidade.
- Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular. Ressuspender em 10% mídia NRCM (opcional: adicionar 100 bromodeoxiuridina? M (BrdU)) e células da placa em pratos revestidos com fibronectina.
Cultura 6. celular
- As células em placas a cerca de 100k células por cm2. Ajustar a densidade de revestimento com base na utilização prevista da cultura. Prepare a 2% de meio NRCM diluindo 20% em IMDM Meios numa proporção de 1:10. O que se segue é um esboço de uma cultura típica. </ Li>
- No dia 1, lavar as células mortas afastado com IMDM morna, adicione 10% NRCM (opcional 100 M BrdU). No dia 2, lavar as células mortas afastado com IMDM morna, adicione 10% NRCM. Dia 3-adicionar 2% NRCM. No dia 4, adicionar 2% NRCM. No dia 5, assegurar que as células estão confluentes e batimento. Manter as células em cultura durante cerca de uma semana. Nesse ponto fibroblastos podem começar a superar significativamente as NRCMs.
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Representative Results
Seguindo o isolamento dos cardiomiócitos de ratos neonatais, as células são congeladas até azoto líquido, e pode ser armazenado durante pelo menos vários meses. Tipicamente, durante o descongelamento, a viabilidade determinada por análise de Azul de Tripano será entre 40-60%. Embora este seja mais baixa do que outros tipos de células, com a sementeira e a cultura adequado as células irão proliferar (Figura 1). A fim de verificar a contractilidade, as células podem ser visualizados utilizando um microscópio de contraste de fase. As células devem começar a contrair-se espontaneamente dentro de cerca de três dias (Figura 2). Para imunocitoquímica (ICC) ensaios, as células foram plaqueadas em 4 poços de cultura de lâminas com 200.000 células por cavidade. A fim de demonstrar que as células em cultura são NRCMs as células foram marcadas com α-SA e visualizados utilizando microscopia de fluorescência. Existem numerosas células positivas α-SA indicando NRCMs na cultura (Figura 4). Outras experiências foram realizadas incluindo culNRCMs turing com exossomos derivados de células-tronco cardíacas humanas para testar as propriedades regenerativas do exossomos (Figura 5).
Figura 1. NRCM Proliferação Na imagem A microscopia de fluorescência de NRCM com coloração para α-SA (verde), Ki67 (vermelho) Vitro., E DAPI (azul), tanto para (A) NRCMs recentemente isolados e (B) criopreservados NRCMs depois descongeladas. Arrows indica células em proliferação (ki67-positivo). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A contração do Cryopreserved e Thawed NRCM In Vitro. NRCMs spontaneously contratação in vitro. Ao contrário NRCMs recentemente isolados, pode levar alguns dias antes da contratilidade é recuperado. Vídeo foram registrados cinco dias após o descongelamento. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Figura 3. A contração do recentemente isolados NRCM In Vitro. Freshly isolado NRCMs contrair espontaneamente in vitro. Essas células vão começar a exibir contratilidade muito mais cedo. Vídeo foram registrados 3 dias após o isolamento. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Figura 4. A pureza da cultura NRCM. </ Forte> imagens de microscopia de fluorescência de ambos (A) NRCMs em cultura e (B) e criopreservadas NRCMs descongeladas recentemente isoladas após 5 dias em cultura. NRCMs mostrar coloração positiva para α-SA (verde), enquanto que os fibroblastos podem ser vistos onde núcleos (azul) não são cercados por α-SA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Uso de Thawed NRCM para Cell-Based Assay. Image microscopia confocal de NRCMs, com destaque para α-SA (verde), incubadas com exossomos DiI-marcados (vermelho) a partir de células-tronco cardíacas. Núcleos de células marcadas com DAPI (azul). A fim de criar um modelo de stress oxidativo, NRCMs foram tratados com peróxido de hidrogénio 100 ^ M durante 18 h, antes de ser incubada com exosomes para 4 horas para reverter o estresse oxidativo. As setas indicam regiões de altas concentrações de exossomo em algumas células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo permite que os NRCMs a ser isolado, criopreservadas e descongeladas. A descongelação das células é uma parte essencial do processo. Uma série de diluições de DMSO é usado para remover lentamente DMSO a partir das células 14. É importante que a extracção de DMSO ser realizado mais rapidamente que as células são particularmente sensíveis a morrer imediatamente após a descongelação. Se as células mais ou menos são requeridos para a descongelação, os volumes das soluções em DMSO podem ser dimensionadas, conforme necessário.
Um desafio para NRCM isolamento e a cultura é a rápida proliferação de fibroblastos. Este protocolo utiliza preplating que foi mostrado para reduzir o número de fibroblastos 15. Preplating obras usando não revestidos balões para que os fibroblastos ligam muito mais rápido do que os cardiomiócitos. A sequência de mudanças de suporte pode ser alterada para reduzir o crescimento de fibroblastos. Os fibroblastos vai superar NRCMs em 10% mídia NRCM, mas de crescimento de fibroblastos é significativamente mais lento em 2% NRCM media. Existem outros métodos, tais como os gradientes de Percoll para remover fibroblastos antes do plaqueamento 16,17 ou a adição de BrdU ao retardar o crescimento de fibroblastos 3. O excesso de crescimento de fibroblastos pode ser difícil de detectar, utilizando microscopia de fase, mas é facilmente demonstrado utilizando NRCM coloração específica tal como α-SA (Figura 3). Se não permanece crescimento de fibroblastos excessiva, a quantidade de FBS nos meios de comunicação pode ser reduzida para 2% de FBS no dia 2. Se necessário, o chapeamento pode ser feito em 5% de meio de FBS, embora isto possa resultar num aumento da morte celular.
Este procedimento é limitada e não mais benéfico se utilizando culturas de células que requerem grandes quantidades de células 18,19. Nos casos em que a quantidade de células necessárias abordagens a metade da quantidade de células possíveis para a colheita de uma ninhada, este procedimento vai exigir mais animais uma vez que cerca de metade das células são perdidos devido à criopreservação. Os benefícios da criopreservação são maiores quando se usa menos cells para ensaios, tais como imunomarcação.
Este protocolo ilustra os métodos para o isolamento, criopreservação e subsequente de NRCMs. Há poucas alternativas, como a compra de células congeladas de fornecedores, a utilização deste método, mas as células de compra pode ser custo proibitivo para alguns laboratórios. Os nossos métodos requerem apenas materiais e reagentes vulgarmente utilizados na cultura de células. Além disso, utilizando estes métodos podem aumentar muito a eficiência e a flexibilidade do trabalho de laboratório, reduzindo o uso de animais de laboratório. Os métodos descritos produzir culturas viáveis que podem ser usados para subsequente estudos in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
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