Introduction
Kardiyomiyositlerin Hücre kültürü, modern kardiyak araştırma kritik bir araçtır. Yenidoğan sıçan kardiyomiyositler (NRCMs) yaygın izolasyon beri kullanılan ve kültür yetişkin sıçan kardiyomiyositlerde 1 daha kolaydır. NRCM yöntemi hala çanak, uzun izolasyon prosedürü ve sınırlı hücre çoğalması dahil olmak üzere, çeşitli sınırlamalar vardır. En genel iş 2-6 4-48 saat gerektiren NRCMs izolasyonu için çok sayıda protokoller vardır. Buna ek olarak, hücreler sıklıkla 2 günlük sıçan yavrularından 2,4-7 1'den izole edilir; Doğum zamanlaması laboratuarında diğer çalışmaları ile öngörülemeyen ve çatışma olabilir. hücrelerin sadece küçük bir miktar deneyler için gerekli olup olmadığını izolasyon israf olduğu olabilir. Izolasyon süresini azaltarak iş akışı odak iyileştirilmesi çoğu çabaları, henüz bu yavruların doğum zamanlama sorunları çözmez.
Alternatif olarak, birçok laboratuvar kullanmakEmbriyonik kök hücreler (EKH) ya da uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) türetilen kardiyomiyositlerde. Ancak, yeniden programlama ve / veya farklılaşma süreci çok zaman alıcı ve masraflı de olabilir. In vitro olarak, miyosit model olarak, bu hücreler kullanılarak başka problemler de olabilir. Hem Esc ve iPSC- türetilmiş kardiyomiyositlerde birincil kardiyomiyositlerde 8-10 elektrofizyoloji farklılıkları sergiledikleri gösterilmiştir.
Disosiye NRCMs soğutma 11 kullanılarak birkaç gün depolanan yeteneğine sahip, henüz bu uzun süreli depolama için izin vermez. Sıvı azot tipik olarak belli bir süre ile hücreleri korumak için kullanılır, ancak dimetil sülfoksit (DMSO) gibi bir dondurarak saklama koruyucusu gibi gerektirir. Önceki araştırmalar dondurma medyada% 5-10 DMSO arasında ideal konsantrasyon NRCMs iyileştirilmesi için izin verdiğini göstermiştir, ancak o zaman bile canlılığı düşük 12 kalır. DMSO ücretsiz sırasında hücrelerin korunmasına yardımcı olur rağmenkuvvet, 1.5,% 13 üzerindeki konsantrasyonlarda hücreler için toksik olabilir. Daha önce yapılan çalışmalar yavaş hücrelerden DMSO kaldırma hücre canlılığı 14 iyileştirebileceğini göstermektedir.
Bu ayrılmasından sonra cryopreserving hücreleri tarafından NRCM hücre bazlı deneylerde verimliliğini artırmak için çalışmıştır. Bu hücreler çözülür ve gerektiğinde, izolasyonları ve hayvan tüketimi sıklığının azaltılması kullanılacak sağlar. Bu yöntemi kullanarak, bu NRCMs dondurularak saklanabilmesi ve daha sonraki bir zamanda kullanılmak üzere çözülme mümkün olduğunu göstermektedir. Çözülme sonra hücreler kabul edilebilir canlılığını korumak ve kendiliğinden α-aktinin sarkomerik (α-SA) ve sözleşme için pozitif NRCM kültürleri üretmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol, yenidoğan sıçan yavrularından (10-14 yavrular) bir çöp den, kardiyomiyositler izolasyonu için tasarlanmıştır. Çöp boyutu önemli ölçüde farklı ise, prosedür telafi etmek ölçekli gerekebilir. yavrular etrafında 48 ± 6 saat eski olmalıdır. Tüm işlemler Burada North Carolina State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre İzolasyonu hazırlanması
NOT: izolasyon önce aşağıdaki adımları uygulayın gün.
- Büyük makas, küçük makas, küçük keskin forseps, büyük forseps: Aşağıdaki otoklavlayın. 121 ° C, en az 30 dakikalık bir kuruma süresi 60 dakika boyunca yerçekimi döngüsü kullanın.
- / N O çözülme buzdolabı içinde% 0.1 tripsin solüsyonu 40 ml yerleştirin. Buzdolabında Hank'in Dengeli Tuzları Çözüm (HBSS) zaten soğuk değilse. % 20 fetal sığır serumu (FBS), hisse senedi ortam çözeltisi hazırlayın.
- Isc'den 400 ml'likOve'nin Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) içinde 100 ml FBS, 5 mi, L-glutamin (200 mM), 2.5 mi gentamisin (10 mg ml-1) ve 0.9 ml 2-merkaptoetanol ekleyin. Vakum filtre kullanarak sterilize. Mağaza kadar 3 hafta boyunca 4 ° C'de medya ve bu küçük veya daha büyük hacimler için ölçeklenebilir. % 10 FBS NRCM medya üretmek için IMDM ile 1:% 20 FBS stok Ortamı 1 seyreltin. Sadece tekrarlanan ısıtma ve medya soğumasını önlemek için küçük gruplar halinde olun.
2. Hücre İzolasyonu 1. Gün
- Numunelerin kirlenmesini önlemek için kültür kaputu aşağıdaki çalışmaları yapınız. Bir O / N inkübasyon orada beri en iyi zamanlama için öğleden sonra bu işe başlamak.
- Steril bir kültür kaput içinde çalışma alanını hazırlayın. Kültür kaputu tezgah yastık yerleştirin. % 70 etanol ile iki adet 250 ml'lik beher doldurun ve onları cerrahi aletleri yerleştirin. Kaputu buz küçük kova yerleştirin. Birkaç tüpleri ve 150 mm çanak tutmak için yeterince büyük olduğundan emin olun. Fo kaputu sterilize UVR 10 dk. Buz üzerinde 40 mi% 0.1 tripsin yerleştirin.
- Anneden yenidoğan sıçan yavrular alın. Kullanılıncaya kadar sıcak hayvanları tutmak için, böyle sıcak tutmak için bir tezgah pad sarılmış bir buz kovası olarak yalıtılmış bir kap koyun.
- 25 mi HBSS ile 150 mm kültür çanağı doldurun ve buz üzerine yerleştirin. Unwrap 2-3 gazlı bez ve çalışma alanında yer. Boyun arkasındaki cilt tarafından yavru tutarak, kaputun içinde% 70 etanol ve yer ile sprey. NOT: En iyi sterilite korumak için, bu daha sonra kaputu temizlenmiş yavru yerleştirir başka bir kişi tarafından yapılabilir olduğunu.
- Boyun arkasındaki cilt tarafından yavru tutun. Sonra başları kesilerek euthanize bir hızlı, güçlü kesim, büyük makas kullanarak. Gazlı bez ile kan kurulayın. NOT: IACUC gereksinimleri değişimlerine, bir etanol ile yavru temizlemek için daha uygun olabilir nedeniyle onu püskürtme yerine silin. Bu adım için kendi kurallarına gibi üniversite IACUC ile kontrol ettiğinizden emin olun.
- Ch ön tarafı aşağı kesim Devamgöğüs kafesi üzerinden est. Kalp görünür kadar göğüs kafesi açmak yardımcı olmak için boyun cildi sıkın. Küçük makas kullanarak, buz üzerinde HBSS kültür çanak kalp ve yer çıkarın. Diğer yavrular için tekrarlayın.
- Örneklerden olmayan kalp dokusu çıkarın ve kalpleri yıkamak için hafifçe HBSS girdap. Taze HBSS içeren başka kültür çanak kalp dokusu aktarın ve daha doku yıkayın. Adet 1-3 mm 3 kadar daha doku kesin, ve sonra tripsin solüsyonu transfer. 4 ° C soğutma O / N rocker üzerinde tripsin çözüm yerleştirin.
Hücre İzolasyonu 2. Gün
Not: Aşağıdaki adımlarda aspire ederken, bir vakum hattı yerine bir pipet kullanın. Doku kolayca hareket, ve bir vakum hattı yapışmasına veya hücreleri içeren hala doku kaldıracaktır. Bunun yerine aspirasyon için bir pipet kullanmak en iyisidir. Doku pipet girerse, pipet çıkarmak için dışarı geri.
- T yap% 10 NRCM Medya ANTE'lerin alikotları: 15 ml, 25 ml, bir ve iki. 37 ° C su banyosunda medyanın bir 25 ml'lik tüp yerleştirin. 5 farklı 15 ml konik tüplere 4 mi HBSS ekleyin ve buz üzerinde her yerleştirin. Her 15 ml tüp # 1-5 Etiket.
- 50 ml'lik bir konik tüp, 40 ml HBSS ekleyin. HBSS 10 ml askıya, pipet kollajenaz ekle, ve 50 ml 1 mg ml -1 kollajenaz çözüm oluşturmak için çözümler birleştirir. 0.22 mikron vakum filtre kullanılarak sterilize ve oda sıcaklığında saklayın.
- Kalp dokusu / tripsin tüp alın. Emin olun tripsin açıktır, ve doku kabarık görünür. Doku tüp ve aspirat köşesine kadar sıvı mümkün olduğunca yerleşmek için izin verin.
- Elle tüp ve girdap 25 ml sıcak% 10 FBS NRCM medya ekleyin. Kap ve 2 dakika için 37 ° C su banyosu içinde döner. Yine aspire sıvı. Doku bu aşamada yüzer gerekir; eğer öyleyse, tüpün dibinden aspire.
- 10 mi kolajenaz ekleyin. 2 dakika boyunca ya da çözelti, bulanık olana kadar su banyosunda döndürün. Quickly sıvı aspire. Doku içeren bir tüpe 10 ml taze kolajenaz ilave edin ve 2 dakika boyunca bir su banyosu içinde döner. Pipet, tüp # 1 transfer çözüm karıştırmak ve buz üzerinde yerleştirmek için. Bu sıvının kaldırmak mümkün olmayabilir. Dier üç 15 ml konik tüpler için 3,2-3,6 adımları. Tüp # 5 kalan sıvı aktarın.
- Santrifüj 8 dakika 410 RCF 15 ml tüpler. Santrifüj birlikte, su banyosu içinde, 15 ml% 10 FBS NRCM ortam tüp yerleştirin. 40 mikron hücre 50 ml'lik konik tüp üstünde süzgeç ve 2 ml soğuk HBSS ile ıslak yerleştirin.
- Aşağı bükülmüş hücrelerden aspire süpernatant. Her bir tüp ve tekrar süspansiyon 6 ml soğuk HBSS ekleyin. 50 ml'lik konik içine süzgecinden Pipet hücre süspansiyonları herhangi bir doku kaldırmak için. 3 ml soğuk HBSS her 15 ml tüp kenarlarını durulayın ve süzgeç ekleyin. 10 dakika boyunca 410 RCF Santrifüj hücreleri. Süpernatant aspire. T-75 şişeye 10 mi% 10 FBS NRCM ortam transfer içinde süspanse hücre topağı. 5ml medya ile konik durulayın ve fl eklemeksormak.
- 37 ° C'de 1 saat karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin. Su banyosu içine son 15 ml% 10 FBS NRCM medya tüpü yerleştirin. T-75, yeni bir T-175 balonuna içeriğini aktarın 15 mi ortam ile T-75 durulama ve T-175 ilave edin. 1 saat süre ile inkübe edilir.
4. Kriyoprezervasyon
- Buz medya dondurma yerleştirin. T-175-50 ml konik tüp hücre ortamı aktarın ve hücre Tripan mavisi kullanarak sayılması için hücre süspansiyonu 10 ul toplamak. 5 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Santrifüj sırasında, bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.
- Ml başına 2-4000000 hücre konsantrasyonunda ortam donma aspire kültür ortamı, ve tekrar süspansiyon hücreleri. Kriyojenik şişe içinde hücre süspansiyonu 1 ml yerleştirin ve yer -80 ° C dondurucu O / N kontrollü soğutma kabı donma hızı ve yer şişeler. 1-2 gün sonra, sıvı azot içinde şişeleri aktarın.
5. Çözülme Hücreler
- 250 ul çözerek fibronektin içinde Coat çanak60; 9.75 ml su (nihai konsantrasyon 0.025 mg ml -1) içine fibronektin (stok konsantrasyonu 1 mg ml -1) olarak. Kültürü plakası kapağı ve en az 30 dakika boyunca 37 C 'de inkübe etmek yeterli bir çözüm ekleyin.
- 20% Medya DMSO ekleyerek aşağıdaki gibi dört 15 ml konik tüplerde, DMSO / medya karışımları yapmak. 500 ul DMSO ile (% 5) 9.5 ml ortam ekleyin. 250 ul DMSO ile (% 2.5), 9.75 mi ortam ekleyin. 10 ml medya (bu iki yapmak) ekleyin.
- 37 ° C su banyosu içinde yukarıda belirtilen ortam karışımları ısıtın. Sıvı azot hücreleri çıkarın ve kuru buz üzerinde yerleştirin. Medya karışımlar sıcak olduğunda sadece çözülmüş kadar, 37 ° C su banyosunda hücreleri eritin. Bu hücrelere zarar verebilir gibi çok uzun süre su banyosunda hücreleri bırakmayın.
- % 5 DMSO / ortam tüpüne kriyojenik bir şişenin muhtevasının aktarın. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant. % 2.5 DMSO / medya tüpünün içeriği pelet ve r hücre ekleesuspend. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant.
- Pelet ve tekrar süspansiyon hücre, bir 0% DMSO / medya tüpünün içeriğini ekleyin. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant.
- Hücre pelet ve tekrar süspansiyon ikinci 0% DMSO / medya içeriğini ekleyin. Hücre sayımı için küçük bir örnek alın. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Bir hematositometrede santrifüj sayısı hücreleri Tripan Blue kullanırken ölü hücreleri etiketlemek için. Tutanak hücre miktarı, yanı sıra canlılık.
- Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant. % 10 NRCM medyada süspanse (opsiyonel: 100 mcM bromodeoxyuridine (BrdU) ekleyin) fibronektin-kaplı yemekleri ve plaka hücreleri.
6. Hücre Kültürü
- Cm 2 başına yaklaşık 100k hücre Plaka hücreleri. Kültür kullanım amacına göre kaplama yoğunluğu ayarlayın. 1:10 oranında IMDM içerisinde% 20 Ortamı seyreltilmesi ile% 2 NRCM ortamı hazırlar. Aşağıdaki tipik bir kültürün bir taslaktır. </ Li>
- 1 gün, uzak, sıcak IMDM ile ölü hücreleri yıkayın% 10 NRCM (isteğe bağlı 100 mcM BrdU) ekleyin. 2 gün, uzak, sıcak IMDM ile ölü hücreleri yıkayın% 10 NRCM ekleyin. Gün 3-eklemek% 2 NRCM. 4 gün% 2 NRCM ekleyin. 5. günde hücreler belirsiz ve dayak olduğundan emin olun. Yaklaşık bir hafta boyunca kültür içinde hücreleri koruyun. Bu noktada fibroblastlar anlamlı NRCMs büyümek başlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yenidoğan Sıçan kardiyomiyositlerinde izolasyonundan sonra, hücreler sıvı azot kadar dondurulur ve en az birkaç ay boyunca saklanabilir. Tipik haliyle eritme üzerine, Tripan mavisi analizi ile belirlenen canlılık% 40-60 arasında olacaktır. Bu doğru tohumlama ve kültürü ile, diğer hücre türlerine göre daha düşük olmasına rağmen hücreleri (Şekil 1) çoğalacak. Kasılma doğrulamak için, hücreler, bir faz kontrast mikroskobisi kullanılarak görüntülenebilir. Hücreler kendiliğinden yaklaşık üç gün (Şekil 2) içinde sözleşme başlamalıdır. İmmünositokimya (ICC) deneyleri için, hücreler, göz başına 200.000 hücre ile 4 oyuklu kültür slaytlar kaplanmıştır. Amacıyla kültür hücreleri hücreleri α-SA ile etiketlenmiş NRCMs ve floresan mikroskobu kullanarak görüntülü olduğunu göstermek için. Kültürdeki NRCMs (Şekil 4) gösteren çok sayıda α-SA pozitif hücreler vardır. Diğer deneyler de dahil olmak üzere, Cul yapılmıştırinsan kardiyak kök hücre-türevli eksozom ile Turing NRCMs eksozom (Şekil 5) rejeneratif özellikleri test etmek için.
Şekil 1. NRCM Vitro. Α-SA (yeşil), Ki67 (kırmızı) ile boyama NRCM bir floresan mikroskobu resimde çoğalması ve DAPI hem (A) açısından (mavi), yeni izole edilmiş NRCMs ve (B) 'dondurulan sonra çözülmüş NRCMs. Oklar hücreleri çoğalan gösterir (Ki67 pozitif). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Vitro. NRCMs SPONTAN olarak KRİYOPREZERVE ve Çözülmüş NRCM Şekil 2. daralmaously vitro daralan. Kontraktilite kurtarıldı önce taze izole NRCMs aksine, birkaç gün sürebilir. Video beş gün çözüldükten sonra kaydedildi. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil In Vitro Taze izole edilmiş NRCM 3. daralma. Yeni izole edilmiş olan NRCMs kendiliğinden vitro daralan. Bu hücreler daha çabuk kasılma sergilemeye başlayacak. Video 3 gün izolasyondan sonra kaydedildi. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NRCM Kültür Şekil 4. Saflık. </ Strong> taze kültür içinde 5 gün sonra kültür ve (B) Kriyoprezerve içinde NRCMs ve çözülmüş NRCMs izole hem (A) Floresans mikroskop görüntüleri. NRCMs çekirdekleri (mavi) α-SA ile çevrili olmayan yerlerde fibroblastlar görülebilir ise α-SA (yeşil) için pozitif boyanma gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Hücre Bazlı Tahlil için Çözülmüş NRCM 5. kullanımı. NRCMs Konfokal mikroskopi görüntüsü, α-SA (yeşil) ile gösterildi, kardiyak kök hücrelerinden DII etiketli eksozom (kırmızı) ile inkübe edildi. DAPI (mavi) ile etiketlenmiş hücre çekirdekleri. Bir oksidatif stres modeli oluşturmak amacıyla, NRCMs önce exoso ile inkübe edilmeden, 18 saat süre ile 100 uM hidrojen peroksit ile muamele edildi4 saat mes oksidatif stres ters. Oklar, bazı hücrelerde yüksek konsantrasyonlarda eksozom bölgeleri göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NRCMs, izole dondurulan ve çözülmüş olması için bu protokol sağlar. Hücrelerin çözülmesi prosedürünün çok önemli bir kısmıdır. DMSO Bir dizi sıvı yavaşça hücreler 14 DMSO'yu çıkarmak için kullanılır. Bu DMSO çıkarma hücreleri çözüldükten sonra hemen ölen özellikle duyarlı hızlı bir şekilde yapılması önemlidir. Daha fazla veya daha az hücre eritme işlemi için gerekli olan, gerektiğinde, DMSO çözeltisi hacimleri ölçeklendirilebilir.
NRCM izolasyonu ve kültürü için bir meydan okuma fibroblast hızla çoğalması olduğunu. Bu protokol, fibroblastlar 15 sayısını azaltmak için gösterilmiştir preplating kullanır. Fibroblastlar kardiyomiyositlere çok daha hızlı eklemek hangi kaplanmamış şişeler kullanarak eserlerini Preplating. Vasat değişikliklerinin dizisi fibroblast büyüme azaltılması için değiştirilebilir. Fibroblastlar,% 10 NRCM medya NRCMs büyümek, ancak fibroblast büyüme% 2 NRCM med önemli ölçüde daha yavaş biria. Önce, fibroblast büyüme 3 yavaş 16,17 veya BrdU eklenmesi kaplama için fibroblast gidermek için, Percoll gradyenleri gibi başka yöntemler de vardır. Aşırı fibroblast büyüme fazı mikroskopi kullanılarak tespit etmek zor olabilir, ancak kolayca NRCM gibi α-SA gibi spesifik boyama (Şekil 3) kullanılarak gösterilmektedir. Aşırı fibroblast büyüme kalması halinde, medya FBS miktarı günde 2 Gerekirse% 2 FBS ile azaltılabilir, kaplama, bu artan hücre ölümüne neden olsa,% 5 FBS ortamı içinde yapılabilir.
Bu prosedür, sınırlı ve hücrelerin 18,19 büyük miktarlarda ihtiyaç hücre kültürleri kullanıyorsanız artık faydalıdır. Gereken hücre miktarı, çöp hasat etmek mümkün Hücrelerin yarısının miktarda yaklaşımlar durumlarda, bu yöntem, hücrelerin yaklaşık yarısı dondurarak saklama nedeniyle kaybedilen çünkü daha fazla hayvan gerektirecektir. Daha az cel kullanırken dondurulmasının faydaları büyüktürörneğin immüno-lekeleme gibi tahliller için mi.
Bu protokol, izolasyon, dondurarak saklama ve NRCMs sonraki için metotları göstermektedir. Böyle bu yöntemi kullanarak, satıcılardan donmuş hücreleri satın ama satın alma hücreleri, bazı laboratuvarlar için fahiş maliyet olabilir gibi birkaç alternatif vardır. Bizim yöntemler sadece hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan maddeler ve reaktifler gerektirir. Laboratuar hayvanlarının kullanımını azaltırken ek olarak, bu yöntemleri kullanarak büyük ölçüde laboratuar çalışmalarının verimliliğini ve esnekliğini artırabilir. Tarif edilen yöntemler, in vitro çalışmalar sonraki kullanılabilir uygulanabilir kültürleri üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
