Protocol
1. הכנה של 3% 2-Hydroxyethyl Agarose
- לתוך בקבוק נקי, יבש 100 מיליליטר זכוכית, להוסיף 0.9 גרם של agarose 2-hydroxyethyl (Agarose VII) ואחריו 30 מיליליטר של מים מזוקקים.
- מיקרוגל את התערובת במשך 15 שניות ועדינות מערבולת. חזור על שלב זה לפחות עוד שלוש פעמים עד שאבקת agarose מתמוססת באופן מלא.
- החיטוי הבקבוק המכיל פתרון במשך 15 דקות.
- אפשר פתרון agarose להתקרר לRT לפני שימוש נוסף. אחסן את הפתרון בRT.
2. הכנת השכבה התחתונה: 0.6% Agarose ג'ל
- טרום חם 5 מיליליטר ו -10 מיליליטר בטפטפות 37 ° C חממה כמה למנוע agarose לחיזוק בפיפטה בעת טיפול.
- חלקית לשחרר את מכסה הבקבוק ומיקרוגל 3% פתרון agarose 2-hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. ואז, בעדינות מערבולת הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות. זהירות: היזהרי בעת מתערבלת agaroפתרון se כי הפתרון עולה כאשר נחשף לאוויר ויכול לגלוש.
- אם יש ג'ל השייר המוצק בבקבוק, מיקרוגל לעוד כמה שניות.
- שמור את הבקבוק המכיל את פתרון agarose באמבט מים C ° 45 במהלך השלבים הבאים כדי למנוע את פתרון agarose מהגיבוש בטרם עת.
- תקשורת MCF10DCIS חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: תקשורת MCF10DCIS מורכבת DMEM / F12, 5% בסרום סוס, 5% סטרפטומיצין פניצילין.
- העברה 3 מיליליטר של פתרון agarose 3% באמצעות טפטפות המחוממות מראש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
- מייד להוסיף 12 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה ועדינות להפוך את צינור חרוטי לערבב agarose עם התקשורת. נסה לא ליצור בועות כפי שיפריע למושבה ספירה מאוחר יותר.
- בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תערובת זו לכל גם צלחת תרבות 6 היטב בלי להרכיב את כל בועות אוויר.
- דגירה horizonta צלחת תרבות 6 היטבlly על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
- לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה למשך 30 דקות. השכבה התחתונה היא מוכנה לשימוש.
3. הכנת השכבה המכיל הנייד: 0.3% Agarose ג'ל
- תאי Trypsinize MCF10DCIS ולדלל אותם לריכוז תא של 4 x 10 4 מיליליטר /.
- קח 2 מיליליטר של agarose 3% באמצעות טפטפות מחוממות מראש ולהעביר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
- מייד להוסיף 8 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS לצינור חרוטי ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יצירת בועות.
- קח 2 מיליליטר של תאי MCF10DCIS (4 x 10 4 / מיליליטר) ולטפל עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
- בדילול 1: 1, לערבב את התאים עם agarose 0.6%.
- קח 1 מיליליטר של תערובת התא-agarose ועדינות להוסיף על השכבה התחתונה של עמ 'תרבות 6 היטב(2 x 10 4 תאים / מיליליטר) מאוחר.
- מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את השכבה העליונה כדי לחזק.
- לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה במשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה.
4. הכנת שכבת המזין: 0.3% Agarose ג'ל
- מיקרוגל 3% פתרון agarose 2-Hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. מערבולת בעדינות את הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות.
- לאזן את בקבוק פתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
- לחמם את תקשורת MCF10DCIS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- מערבבים 1 מיליליטר של 3% פתרון agarose עם 9 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יוצר בועות אוויר.
- פנק את התערובת עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
- בעדינות להוסיף 1 מיליליטר של תערובת זו (בלי למינג בועות) לבאר כל צלחת תרבות 6 היטב המכילה את החלק התחתון ושכבות רכות.
- מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
- לאחר שכבת המזין מתמצקת, למקם את הצלחת לתוך 37 ° C חממה.
- חזור שבועי הליך זה על ידי האכלה כיסה 1 מיליליטר של 0.3% פתרון agarose / בינוניים / טיפול על שכבת המזין הקיימת כדי לחדש את התאים עם תקשורת חדשה עד הקמת מושבה הוא ציין. הערה: אגר בשכבות הרכות ומזין היא רכה מאוד, ולכן, חומרים מזינים הגיעו משכבת המזין יהיו מוכנים לפזר את השכבה המכיל תא כדי להגיע לתאים.
5. איסוף נתונים
- לאחר 2.5 שבועות של צמיחת תאים באגרו הרך, לספור את מספר המושבות בכל טוב באמצעות מיקרוסקופ אור. כדי להקל על כימות, להדפיס רשת על שקיפות ולצרף את הרשת ל6-גם צלחת לסיוע באיתור שבו התאים נמצאים בספירה. מאז גודל מושבה (כלכמת ידי הקוטר של כל מושבה) ישתנה, להגדיר מראש גודל מושבה התייחסות כדי לקבוע אילו מושבות יהיה כבש. לדוגמא, כוללים גדלי מושבה של 70 מיקרומטר או גדולים יותר בניתוח הנתונים.
- אחסן את הדגימות ב 4 ° C כדי למנוע היווצרות מושבה נוספת ולספירת עתיד. חותם את צלחת תרבות 6 היטב עם Parafilm כדי למנוע את ג'לי מהתייבשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay הקמת המושבה אגר הרך יכול לשמש למגוון רחב של יישומים המתעדים את tumorigenicity של תאים סרטניים. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שמטריצת חצי מוצקה סלקטיבי מעדיפה את הצמיחה של תאים שיכולים להתרבות באופן עצמאי מעגן-. תכונה זו היא בעיקר הפגינה תאים סרטניים אך לא בתאים נורמלים. אנחנו בעיקר להשתמש בטכניקה זו כדי לבדוק את היעילות של עיכוב צמיחת גידול על ידי תרופות ולבדוק את ההשפעה של ביטוי יתר או דלדול של הגנים שלנו של עניין, כוללים גני PADI, בtumorigenicity של תאי סרטן השד. כאן, אנו הערכנו את ההשפעה של BB-CLA על עיכוב סרטני של תאי MCF10DCIS ביתר-PADI2 (איור 1 ו -2).
התוצאות מראות שBB-CLA מעכב את ההיווצרות של מושבות תאים שמקורם MCF10DCIS באופן משמעותי. איור 3 מראה כי, בנוכחות מעכב PADI t, כאן הייתה ירידה בשני גודל הקמת המושבה ומושבה בהשוואה לשליטת DMSO. [הערה:. BB-CLA פורקה ב DMSO ובכך, DMSO שימש כביקורת] הגודל של מושבות לBB-CLA טופל תאי MCF10DCIS היו בעיקר בטווח של 20 עד 100 מיקרומטר בעוד הגודל של מושבות לDMSO שליטה הציגה מגוון רחב יותר של 70 מיקרומטר עד 150 לאחר 2.5 שבועות של צמיחה.
מושבות גדולות יותר מ -70 מיקרומטר נספרו וניתחו (איור 4). היה ממוצע של 3536 מושבות בשליטת DMSO ואילו רק 1,967 מושבות ראו בקבוצה שטופלה BB-CLA לאחר 2.5 שבועות של תרבות אגר רכה. זה מייצג ירידה של 44% בהקמת המושבה הממוצעת בנוכחות 1 מיקרומטר BB-CLA, המצביע על עיכוב משמעותי סרטני של תאי סרטן השד (תאי MCF10DCIS) על ידי מעכב PADI.
טען / 52,727 / 52727fig1.jpg "/>
איור 1. מבנה הכימי של BB-CLA.
איור 2. סכמטי סקירה כללית של הפרוטוקול עבור assay כינונה רך אגר מושבה. גם כל תרבות צלחות 6-גם הייתה מצופה ראשון עם 0.6% agarose ג'ל (שכבה תחתונה). תערובת agarose ג'ל 0.3% המכילה את תאי MCF10DCIS וגם מעכב BB-CLA (1 מיקרומטר) או DMSO (שליטה) הייתה אז שכבות על גבי ג'ל 0.6%. פעם בשבוע, 0.3% תערובת agarose ג'ל (המכיל BB-CLA) נוספה על גבי השכבה הרכה. לאחר 2 עד 4 שבועות, הקמת מושבה נצפתה ונספרה לניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. כימות MCF10DCIS מושבה מספר התאים לאחר BB-CLA הטיפול. MCF10DCIS גדלו באגרו רך בריכוזים שונים של BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO), או 1 מיקרומטר BB-CLA). לאחר 2.5 שבועות, ה גדולה מושבות בודדות70 מיקרומטר נספר. ניסויים חוזרים ונשנים 4 פעמים (n = 4). המובהקות הסטטיסטיות של הבדל ספירת תאים הכולל בין דגימות בקרה וטיפול נקבעו על ידי מבחן t שני מדגם (* p <0.005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קצב היווצרות מושבה באגרה רך משתנה בהתאם לסוג התא 9. לכן, מספר התאים להתחיל עם צריך להיות מותאם ובהתאם. מגוון התחלה הציע הוא בין 5 x 02-01 אוקטובר x 10 4 תאים לכל גם באמצעות צלחת 6 היטב. בנוסף, גודל מושבה משתנה בהתאם לקצב הצמיחה של כל תא. לכן, יש צורך בחתך מוגדר מראש לגודל מושבה כדי להוסיף הערות מושבות בודדות עבור ניתוחים כמותיים במורד הזרם. כאן, מושבות גדולות יותר מ -70 מיקרומטר היו לכמת כדי למנוע הכללה של תאים מתרבים שאינם נגזרים מהציפוי הראשוני.
לצמיחה אופטימלית, בעת ביצוע ג'ל agarose 3D, רצוי להשתמש באותו מדיום תרבית תאים משמש בדרך כלל לתרביות תאי 2D. סיבה לכך הוא שינוי בינוני לעתים קרובות פעמים משנה את קצב צמיחת תאים, ובכך חייב passaging נוסף כדי לאפשר לתאים להסתגל למדיום החדש. לדוגמה, ניתן לגדל תאי MCF10DCIS בצורה אופטימלית בRPMI-1640, DMEM, או תקשורת / F12 DMEM. עם זאת, כאשר תקשורת ותרבות MCF10DCIS משתנה מRPMI-1640 לDMEM / F12, יש ירידה ניכרה בשיעור התפשטות תאים. בנוסף, יש להקפיד לשמור על ריכוזים בסרום ברמה קבועה, כי, ללא סרום, הקמת מושבה תהיה מעוכבת 10. יתר על כן, לאחר agarose הוא במיקרוגל, לאפשר את הבקבוק לאזן באמבט מים C ° 45 לפני הערבוב עם מדיה המכילה תאים כדי למנוע התחממות יתר התאים. בהתחשב בכך שagarose מתמצק במהירות בטמפרטורת חדר, אנו ממליצים שכל טפטפות ותרבות צלחות 6-גם הם שחומם מראש בחממה 37 ° C לפני הוספת פתרון agarose כדי למנוע התמצקות מוקדמת בזמן הטיפול.
בעוד טכניקת הקמת המושבה אגר הרכה היא כלי רב ערך למדידת tumorigenicity בטווח של שורות תאי הסרטן, כמה שורות לא גדלות באגרו רך. Anotהחסרון הפוטנציאלי של השיטה הוא שלא ניתן לשחזר תאי קיימא ברגע שהם מצופים לתוך אגר רכים. בנוסף, אם יש מתחם תקופה קצרה זמינות ביולוגית, צעד ההאכלה צריך להתבצע בתדירות גבוהה יותר (כלומר בכל יום אחר) והדגימות צריכה להיות שנאספו בפחות משבעה ימים. הסף לגודל המושבה גם צריך להיות מופחת תוך מתן להבדלים אפשריים בין הדגימות שנצפו. במקרים אלה, בקרות הייתם צריכים להיות משולבות כדי לייעל פרמטרים ניסיוניים כדי למזער תוצאות חיוביות שגויות וכוזבות שליליות. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות זמן רב וקשה כאשר בודק מספר גדול של דגימות. עם זאת, התקדמות טכנולוגית סייעה להתגבר על חלק ממגבלות אלה. Assay הקונבנציונלי הרך אגר (כפי שתועד בכתב היד הזה) משתמש בדרך כלל צלחות תרבות 6 היטב או תרבות מנות 6 מ"מ. עם קוראי צלחת אוטומטיים, לעומת זאת, multiplיכולות להיות מעובד דגימות דואר בצלחות 384 גם 11. לדוגמא, חוקרים טעונים מראש תאי גידול עם צבעים כגון alamarBlue וצבעים tetrazolium ומושבות לכמת באמצעות צלחת קורא, כך מייתר את הצורך לספור מספר המושבה 11 באופן ידני. יכולת תפוקה גבוהה זה היא, אפוא, נוח למסכי תרופה לסרטן בקנה מידה גדולה.
לסיכום, assay אגר הרך הוא טכניקה פרה-קלינית רבת ערך שיכול לשמש כדי להעריך את tumorigenicity של מגוון רחב של תאי סרטן (שד, ערמונית, השחלות, ואחרים) בכל הקשור לרגישותם לתרופות, הורמונים, חום, היפוקסיה, ומספר רב של תנאי טיפול אחרים. Assay ממשיך לספק כלי פשוט ואינפורמטיבי לחוקרי סרטן שרוצים להבין טוב יותר את המנגנונים של התקדמות הסרטן ולבדוק את הפוטנציאל אנטי-הסרטני של טיפולים בסרטן חדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
