Protocol
1. إعداد 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الاغاروز
- إلى الجافة زجاجة نظيفة، 100 مل، إضافة 0.9 غرام من 2-هيدروكسي إيثيل الاغاروز (الاغاروز السابع) تليها 30 مل من الماء المقطر.
- الميكروويف الخليط لمدة 15 ثانية، وبلطف دوامة. كرر هذه الخطوة لا يقل عن ثلاث مرات حتى يذوب مسحوق الاغاروز تماما.
- الأوتوكلاف الزجاجة التي تحتوي على حل لمدة 15 دقيقة.
- السماح الحل الاغاروز ليبرد لRT قبل استخدامها مرة أخرى. تخزين الحل في RT.
2. إعداد الطبقة السفلية: 0.6٪ الاغاروز جل
- قبل عدة الحارة 5 مل و 10 مل ماصات في 37 ° C حاضنة لمنع الاغاروز من التصلب في ماصة عند التعامل مع.
- تخفيف جزء من غطاء زجاجة والميكروويف 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الحل الاغاروز مسبقة الصنع لمدة 15 ثانية. ثم، دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى. تحذير: كن حذرا عندما يحوم agaroالحل ذاته لأن الحل ترتفع عند تعرضها للهواء، ويمكن أن تمتد.
- إذا كان هناك هلام الصلبة المتبقية في زجاجة، الميكروويف لبضع ثوان.
- إبقاء زجاجة تحتوي على الحل الاغاروز في 45 ° C حمام الماء خلال الخطوات التالية لمنع الحل الاغاروز من ترسيخ قبل الأوان.
- وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئ في 37 ° C حمام الماء. ملاحظة: يتكون MCF10DCIS وسائل الإعلام من DMEM / F12، 5٪ مصل الحصان، 5٪ البنسلين ستربتومايسين.
- نقل 3 مل من محلول الاغاروز 3٪ باستخدام ماصات قبل تحسنت في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- على الفور إضافة 12 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئة وعكس بلطف أنبوب مخروطي لخلط الاغاروز مع وسائل الإعلام. ليس محاولة لتشكيل أي فقاعات لأنها سوف تتداخل مع مستعمرة العد في وقت لاحق.
- بلطف إضافة 2 مل من هذا الخليط في كل بئر من لوحة الثقافة 6 جيدا دون تشكيل أي فقاعات الهواء.
- احتضان 6 جيدا لوحة الثقافة افقياLLY على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح للخليط ليصلب.
- بعد يتصلب الخليط، ووضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلى هي الآن جاهزة للاستخدام.
3. إعداد طبقة التي تحتوي على الخلايا: 0.3٪ الاغاروز جل
- خلايا يعرض للتريبسين MCF10DCIS وتمييع منهم إلى تركيز خلية من 4 × 10 4 / مل.
- خذ 2 مل من الاغاروز 3٪ باستخدام ماصات قبل تحسنت ونقل إلى العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- إضافة على الفور 8 مل من MCF10DCIS وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي الشكل وعكس بلطف لمزج الاغاروز مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل أي فقاعات.
- خذ 2 مل من الخلايا MCF10DCIS (4 × 10 4 / مل)، وعلاج مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
- في 1: 1 التخفيف، ومزيج من الخلايا التي تحتوي على الاغاروز 0.6٪.
- تأخذ 1 مل من الخليط خلية الاغاروز وإضافة بلطف على الطبقة السفلية من 6 جيدا ثقافة صفي وقت متأخر (2 × 10 4 خلية / مل).
- وضع لوحة ثقافة 6 جيدا أفقيا على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح الطبقة العليا ليصلب.
- بعد يتصلب الخليط، ووضع لوحة في حاضنة C 37 درجة لمدة أسبوع قبل أن يضيف طبقة التغذية.
4. إعداد طبقة الطاعم: 0.3٪ الاغاروز جل
- الميكروويف 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الحل الاغاروز مسبقة الصنع لمدة 15 ثانية. دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
- تتوازن الزجاجة الحل الاغاروز في حمام مائي 45 ° C.
- تدفئة وسائل الإعلام MCF10DCIS في حمام مائي 37 ° C.
- مزيج 1 مل من 3٪ حل الاغاروز مع 9 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئ في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وعكس بلطف لمزج الاغاروز مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- علاج الخليط مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
- بلطف إضافة 1 مل من هذا الخليط (بدون لمينغ فقاعات) في كل بئر من لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على القاع وطبقات لينة.
- وضع لوحة ثقافة 6 جيدا أفقيا على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط ليصلب.
- بعد ترسخ الطبقة المغذية، وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
- كرر هذا الإجراء أسبوعيا التغذية التي تتراكب 1 مل من 0.3٪ محلول الاغاروز / متوسطة / العلاج على طبقة المغذية الموجودة لتجديد الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة حتى لوحظ تشكيل مستعمرة. ملاحظة: آجار في الطبقات الناعمة والمغذية لينة جدا، وبالتالي فإن العناصر الغذائية المضافة من الطبقة المغذية منتشر بسهولة إلى الطبقة التي تحتوي على خلية للوصول إلى الخلايا.
5. جمع البيانات
- بعد 2،5 أسابيع من نمو الخلايا في أجار لينة، وحساب عدد المستعمرات في كل بئر باستخدام المجهر الضوئي. لتسهيل الكمي، طباعة الشبكة على الشفافية وإرفاق شبكة للوحة 6 جيدا للمساعدة في تحديد موقع حيث كانت الخلايا أثناء الفرز. منذ حجم مستعمرة (كما كميا من قطر كل مستعمرة) سوف تختلف، تحديد مسبق حجم مستعمرة مرجعية لتحديد المستعمرات سيتم سجل. على سبيل المثال، تشمل أحجام مستعمرة من 70 ميكرون أو أكبر في تحليل البيانات.
- تخزين العينات في 4 درجات مئوية لمنع المزيد من تشكيل مستعمرة والعد في المستقبل. ختم لوحة الثقافة 6 جيدا مع parafilm لمنع المواد الهلامية من الجفاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات توثيق tumorigenicity الخلايا السرطانية. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن المصفوفة شبه صلبة تفضل بشكل انتقائي من نمو الخلايا التي يمكن أن تتكاثر بطريقة-مرسى مستقل. وعرضت هذه الصفة بشكل رئيسي من قبل الخلايا السرطانية ولكن ليس عن طريق الخلايا الطبيعية. نحن نستخدم بشكل رئيسي هذه التقنية لاختبار فعالية الورم النمو المخدرات عن طريق تثبيط واختبار تأثير overexpression أو استنزاف جيناتنا المصالح، بما في ذلك الجينات PADI، على tumorigenicity خلايا سرطان الثدي. هنا، قمنا بتقييم تأثير BB-CLA على تثبيط مكون للأورام الخلايا MCF10DCIS-overexpressing PADI2 (الشكل 1 و 2).
وتبين النتائج أن BB-CLA يمنع إلى حد كبير في تشكيل MCF10DCIS المستعمرات المستمدة من الخلية. ويبين الشكل 3 أنه في وجود المانع PADI، ر كان هنا انخفاضا في كل من تشكيل مستعمرة ومستعمرة حجم بالمقارنة مع السيطرة DMSO. [ملاحظة: تم حله BB-CLA في DMSO وبالتالي، كانت تستخدم DMSO كعنصر تحكم] حجم المستعمرات لBB-CLA معاملة كانت خلايا MCF10DCIS في الغالب ضمن مجموعة من 20-100 ميكرون في حين أن حجم المستعمرات لDMSO السيطرة عرضت مجموعة أكبر من 70-150 ميكرون بعد 2.5 أسابيع من النمو.
احصي المستعمرات أكبر من 70 ميكرون وتحليلها (الشكل 4). كان هناك ما معدله 3536 المستعمرات في السيطرة DMSO في حين شوهدت فقط 1967 المستعمرات في المجموعة التي تلقت العلاج BB-CLA بعد 2.5 أسابيع من ثقافة أجار لينة. هذا يمثل انخفاضا بنسبة 44٪ في متوسط تشكيل مستعمرة في وجود من 1 ميكرومتر BB-CLA، مما يدل على تثبيط كبير مكون للأورام خلايا سرطان الثدي (خلايا MCF10DCIS) من قبل المانع PADI.
pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
الشكل 1. التركيب الكيميائي للBB-CLA.
والمغلفة الشكل 2. تخطيطي لمحة عامة عن بروتوكول لتشكيل الفحص لينة آجار مستعمرة. كل بئر من لوحات ثقافة 6 جيدا أولا مع 0.6٪ هلام الاغاروز (الطبقة السفلية). A 0.3٪ خليط agarose هلام يحتوي على خلايا MCF10DCIS وإما المانع BB-CLA (1 ميكرومتر) أو DMSO (مراقبة) ثم الطبقات العليا من هلام 0.6٪. مرة واحدة في الأسبوع، وأضاف 0.3٪ الاغاروز مزيج هلام (التي تحتوي على BB-CLA) على الجزء العلوي من طبقة لينة. بعد 2-4 أسابيع، لوحظ تشكيل مستعمرة وعدها لتحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الكمي لMCF10DCIS مستعمرة عدد بعد ما نمت الخلايا المعالجة BB-CLA. MCF10DCIS في أجار لينة بتركيزات مختلفة من BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر BB-CLA). بعد 2،5 أسابيع، المستعمرات الفردية عشر أكبرتم احتساب 70 ميكرون. وتكررت التجارب 4 مرات (ن = 4). تم تحديد دلالة إحصائية من مجموع الفرق عدد خلايا بين عينات مراقبة والعلاج الطالب اختبار t-عينة اثنين و(* P <0.005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معدل تكوين مستعمرة في أجار لينة يختلف باختلاف نوع من الخلايا 9. ولذلك، فإن عدد الخلايا لبدء ينبغي أن يكون الأمثل وتبعا لذلك مع. وهناك مجموعة انطلاق المقترح هو بين 5 × 02-01 أكتوبر × 10 4 خلايا لكل بئر باستخدام لوحة 6 جيدا. بالإضافة إلى ذلك، حجم مستعمرة يختلف تبعا لمعدل نمو كل خلية. وبالتالي، هناك حاجة إلى معرفة مسبقا وقف انتاج المواد الانشطارية لحجم مستعمرة لتعليم المستعمرات الفردية للالتحليلات الكمية المصب. هنا، المستعمرات أكبر من 70 ميكرون وكميا لتجنب إدراج خلايا غير المتكاثرة المستمدة من الطلاء الأولي.
لتحقيق النمو الأمثل، عندما جعل المواد الهلامية الاغاروز 3D، فمن المستحسن استخدام نفس مستنبت الخلايا المستخدمة عادة لزراعة الخلايا 2D. وذلك لأن تغيير المتوسطة في كثير من الأحيان يغير معدل نمو الخلايا، مما يستلزم الركض إضافية للسماح للخلايا للتكيف مع هذه الوسيلة الجديدة. مثلاوالخلايا MCF10DCIS يمكن زراعتها على النحو الأمثل في RPMI-1640، DMEM، أو DMEM وسائل الإعلام / F12. ومع ذلك، عندما يتم تغيير MCF10DCIS سائل الإعلام والثقافة من RPMI-1640 لDMEM / F12، هناك انخفاض ملحوظ في معدل تكاثر الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي توخي الحذر للحفاظ على تركيزات مصل على مستوى ثابت لأنه بدون مصل، وسوف تحول دون تشكيل مستعمرة (10). وعلاوة على ذلك، بعد المايكرويف الاغاروز، والسماح للزجاجة للتوازن في 45 ° C حمام الماء قبل الاختلاط مع وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا لمنع الانهاك الخلايا. وبالنظر إلى أن الاغاروز يتصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة، ونحن نوصي أيضا أن جميع الماصات وأطباق ثقافة 6 جيدا ومسخن في الحاضنة 37 درجة مئوية قبل إضافة حل الاغاروز لمنع التصلب المبكرة بينما المناولة.
في حين لينة أجار تقنية تشكيل مستعمرة هي أداة قيمة لقياس tumorigenicity في مجموعة من خطوط الخلايا السرطانية، بعض الخطوط التي لا تنمو في أجار لينة. Anotلها العيب المحتمل للطريقة هو أن خلايا قابلة للحياة لا يمكن استردادها مرة واحدة ومطلي انهم في أجار لينة. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المركب له فترة أقصر التوافر البيولوجي، سوف تحتاج خطوة التغذية التي يتعين القيام بها على نحو أكثر تواترا (أي كل يوم) وسوف تحتاج العينات التي سيتم جمعها في أقل من سبعة أيام. والحد الأدنى لحجم مستعمرة تحتاج أيضا إلى انخفاض في حين لا يزال يسمح للاختلافات محتملة بين العينات التي يتعين مراعاتها. في هذه الحالات، سيحتاج الضوابط التي ستدرج لتحسين المعلمات التجريبية للحد من نتائج إيجابية كاذبة وزائفة سلبية. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التقنية أن يكون مضيعة للوقت وصعوبة عند اختبار عدد كبير من العينات. ومع ذلك، فقد ساعد التقدم التكنولوجي للتغلب على بعض من هذه القيود. مقايسة أجار لينة التقليدية (كما هو موثق في هذا المخطوط) يستخدم عادة لوحات ثقافة 6 جيدا أو أطباق ثقافة 6MM. مع القراء لوحة الآلية، ومع ذلك، multiplيمكن معالجة عينات الإلكترونية في لوحات 384 جيدا 11. على سبيل المثال، محققين قبل تحميلها الخلايا السرطانية مع الأصباغ مثل alamarBlue والأصباغ نتروبلو والمستعمرات وكميا باستخدام قارئ لوحة، وبالتالي تنتفي الحاجة إلى الاعتماد مستعمرة رقم 11 يدويا. هذه القدرة الإنتاجية العالية هي، بالتالي، قابلة للشاشات سرطان المخدرات على نطاق واسع.
وباختصار، فإن فحص أجار لينة هو أسلوب ما قبل السريرية القيمة التي يمكن استخدامها لتقييم tumorigenicity من مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية (سرطان الثدي والبروستاتا والمبيض، وغيرها) فيما يتعلق حساسيتها للعقاقير، الهرمونات، الحرارة، ونقص الأكسجين، وعدد كبير من الظروف العلاج الأخرى. يستمر الاختبار لتوفير أداة واضحة ومفيدة للباحثين السرطان الذين يرغبون في فهم أفضل لآليات تطور السرطان واختبار إمكانات المضادة للورم علاجات جديدة للسرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
