Protocol
1. Préparation de 3% de 2-hydroxyéthyle Agarose
- Dans un endroit propre, sec 100 ml bouteille en verre, ajouter 0,9 g de 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII), suivie par 30 ml d'eau distillée.
- Micro-ondes le mélange pendant 15 secondes et agiter doucement. Répétez cette étape au moins trois fois jusqu'à ce que la poudre d'agarose dissout complètement.
- Autoclaver la bouteille contenant la solution pendant 15 min-.
- Laisser la solution d'agarose à refroidir à température ambiante avant une nouvelle utilisation. Conserver la solution à la température ambiante.
2. Préparation de la couche inférieure: 0,6% gel d'agarose
- Pré-réchauffer plusieurs 5 ml et 10 ml de pipettes dans un incubateur à 37 ° C pour empêcher la solidification de l'agarose dans la pipette lors de la manipulation.
- Desserrer partiellement le couvercle de la bouteille et micro-ondes la solution d'agarose à pré-mesure de 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. Ensuite, mélanger doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes. ATTENTION: Soyez prudent lorsque vous tourner le agarosolution soi parce que la solution se lève lorsqu'il est exposé à l'air et peut déborder.
- Si il ya gel solide résiduel dans la bouteille, micro-ondes quelques secondes de plus.
- Gardez la bouteille contenant la solution d'agarose dans un bain d'eau à 45 ° au cours des prochaines étapes pour empêcher la solution d'agarose de se solidifier prématurément.
- Médias MCF10DCIS chaud dans un bain d'eau à 37 C ° de. Remarque: MCF10DCIS support est constitué de DMEM / F12, de sérum de cheval à 5%, 5% de pénicilline streptomycine.
- Transfert 3 ml de la solution d'agarose à 3% en utilisant les pipettes préchauffées dans un tube conique de 50 ml stérile.
- Immédiatement ajouter 12 ml de milieu de MCF10DCIS chaudes et inverser doucement le tube conique de mélanger l'agarose avec les médias. Essayez de ne pas former des bulles comme il va interférer avec la colonie comptant plus tard.
- Ajouter doucement 2 ml de ce mélange dans chaque puits d'une plaque de culture à 6 puits sans former de bulles d'air.
- Incuber le 6 puits plaque de culture horizontally sur une surface plane à 4 ° C pendant 1 heure pour permettre au mélange de se solidifier.
- Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° de 30 min. La couche inférieure est maintenant prêt à l'emploi.
3. Préparation de la couche contenant des cellules: 0,3% gel d'agarose
- Trypsiniser les cellules MCF10DCIS et les diluer à une concentration cellulaire de 4 x 10 4 / ml.
- Prendre 2 ml de l'agarose à 3% en utilisant des pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique de 50 ml stérile.
- Immédiatement ajouter 8 ml de MCF10DCIS médias pour le tube conique et inverser doucement pour mélanger l'agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles.
- Prendre 2 ml de cellules MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) et traiter avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 um).
- Dans une dilution 1: 1, le mélange des cellules avec le 0,6% d'agarose.
- Prélever 1 ml du mélange de cellules-agarose et ajouter doucement sur la couche inférieure de la culture à 6 puits pfin (2 x 10 4 cellules / ml).
- Placer la plaque de culture à 6 puits à l'horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre à la couche de recouvrement se solidifier.
- Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant de une semaine avant d'ajouter la couche d'alimentation.
4. Préparation de la couche d'alimentation: 0,3% Agarose Gel
- Micro-ondes de la solution d'agarose préfabriqué 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. agiter doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes.
- Equilibrer la bouteille de solution de gélose dans un bain d'eau à 45 ° C.
- Réchauffez les médias MCF10DCIS dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Mélanger 1 ml de solution d'agarose à 3% avec 9 ml de milieu de MCF10DCIS chaud dans un tube conique de 50 ml et inverser doucement pour mélanger l'agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles d'air.
- On traite le mélange avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 pM).
- Ajouter délicatement 1 ml de ce mélange (sans pourming bulles) dans chaque puits de la plaque de culture de 6 puits contenant le fond et couches molles.
- Placer la plaque de culture à 6 puits à l'horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier.
- Après la couche d'alimentation se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C.
- Répétez cette procédure hebdomadaire alimentation en superposant 1 ml de solution d'agarose / moyen / traitement de 0,3% sur la couche d'alimentation existante pour reconstituer les cellules avec les nouveaux médias jusqu'à ce que la formation de colonies est observée. Remarque: Agar dans les couches molles et d'alimentation est très doux et, par conséquent, les éléments nutritifs ajoutés à partir de la couche d'alimentation seront facilement diffuser dans la couche contenant des cellules d'atteindre les cellules.
5. Collecte de données
- Au bout de 2,5 semaines de croissance cellulaire dans la gélose molle, compter le nombre de colonies dans chaque puits en utilisant un microscope optique. Pour faciliter la quantification, imprimer une grille sur une transparence et fixer la grille pour laPlaque de 6 puits pour aider à localiser où les cellules sont en cours de comptage. Étant donné que la taille des colonies (telle que quantifiée par le diamètre de chaque colonie) varie prédéfinir une taille de colonie de référence pour déterminer les colonies qui sera reçu. Par exemple, inclure la taille des colonies de 70 um ou plus dans l'analyse de données.
- Stocker les échantillons à 4 ° C pour empêcher la formation de colonies pour le comptage et futur. Sceller le 6 puits plaque de culture avec du Parafilm pour éviter les gels de se dessécher.
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Representative Results
Le dosage de formation de colonies sur gélose molle peut être utilisée pour une large gamme d'applications documentant la tumorigénicité des cellules cancéreuses. Un avantage majeur de cette technique est que la matrice semi-solide favorise sélectivement la croissance des cellules qui peuvent proliférer d'une manière indépendante de l'ancrage. Cette caractéristique est principalement exposée par les cellules cancéreuses, mais pas par les cellules normales. Nous utilisons cette technique principalement pour tester l'efficacité de l'inhibition de la croissance tumorale par les médicaments et pour tester l'effet de la surexpression ou de l'épuisement de nos gènes d'intérêt, y compris les gènes PADI, sur la tumorigénicité de cellules de cancer du sein. Ici, nous avons évalué l'effet de BB-CLA sur l'inhibition tumorigène des cellules surexprimant PADI2-MCF10DCIS (Figure 1 et 2).
Les résultats montrent que BB-CLA inhibe de manière significative la formation de colonies MCF10DCIS dérivés de cellules. La figure 3 montre que, en présence d'un inhibiteur de PADI, t ici est à la fois une réduction de la formation de colonies et la taille des colonies, par rapport au témoin de DMSO. [Note:. CLA-BB a été dissous dans du DMSO et ainsi, le DMSO a été utilisé comme témoin] La taille des colonies pour BB-CLA MCF10DCIS cellules traitées étaient principalement dans la plage de 20 à 100 um tandis que la taille des colonies pour le DMSO témoin présente une plus grande gamme de 70 à 150 um après 2,5 semaines de croissance.
Les colonies de plus de 70 um ont été comptées et analysées (Figure 4). Il y avait une moyenne de 3 536 colonies dans le contrôle de DMSO alors que seulement 1 967 colonies ont été observées dans le groupe traité BB-CLA après 2,5 semaines de culture agar mou. Cela représente une diminution de 44% de la formation de colonies moyenne en présence de 1 uM BB-CLA, ce qui indique une inhibition significative tumorigène de cellules de cancer du sein (cellules MCF10DCIS) par l'inhibiteur de PADI.
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Figure 1. Structure chimique de BB-CLA.
Figure 2. Schéma Aperçu du Protocole pour la Formation de dosage souple Agar colonie. Chaque puits des plaques de culture à 6 puits a été revêtue d'un gel d'agarose à 0,6% (couche de fond). Un mélange de gel d'agarose à 0,3% contenant les cellules et MCF10DCIS soit l'inhibiteur BB-CLA (1 uM) ou du DMSO (témoin) a été ensuite déposé en couche sur le dessus du gel de 0,6%. Une fois par semaine, le mélange de gel d'agarose à 0,3% (contenant BB-CLA) a été ajouté sur le dessus de la couche douce. Après 2 à 4 semaines, la formation de colonies a été observée et a compté pour l'analyse des données. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Quantification des MCF10DCIS Nombre Colony après que les cellules de traitement BB-CLA. MCF10DCIS ont été cultivées dans de l'agar mou à différentes concentrations de BB-CLA (0 pm (DMSO) ou 1 uM BB-CLA). Après 2,5 semaines, des colonies individuelles plus grande eun 70 um ont été comptées. Les expériences ont été répétées quatre fois (n = 4). La signification statistique de la différence totale de comptage de cellule entre les échantillons témoins et traités a été déterminée par le test t de Student à deux échantillons (* p <0,005).
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Discussion
Le taux de formation de colonies dans de l'agar mou varie en fonction du type de cellule 9. Par conséquent, le nombre de cellules pour commencer devrait être optimisé et ajusté en conséquence. Une gamme départ suggéré est entre 5 x 10 2 à 1 x 10 4 cellules par puits en utilisant une plaque de 6 puits. En outre, la taille des colonies varie en fonction du taux de croissance de chaque cellule. Par conséquent, un prédéfini une coupure pour la taille des colonies est nécessaire pour annoter des colonies individuelles pour des analyses quantitatives en aval. Ici, colonies supérieur à 70 um ont été quantifiés pour éviter l'inclusion de cellules non-proliférantes provenant de la plaque initiale.
Pour une croissance optimale, en faisant les gels d'agarose 3D, il est conseillé d'utiliser le même milieu de culture de cellules normalement utilisé pour les cultures de cellules 2D. Ceci est parce que changer milieu souvent modifie le taux de croissance des cellules, nécessitant ainsi des passages supplémentaires pour permettre aux cellules de se adapter à ce nouveau média. Par exemple, Les cellules peuvent être cultivées MCF10DCIS optimale dans RPMI-1640, DMEM, ou du milieu DMEM / F12. Toutefois, lorsque MCF10DCIS milieux de culture est changé à partir de RPMI-1640 à du milieu DMEM / F12, il ya une réduction notable de la vitesse de prolifération cellulaire. En outre, il faut prendre soin de maintenir les concentrations sériques à un niveau constant, parce que, sans sérum, la formation de colonies sera inhibée 10. En outre, après l'agarose est au micro-ondes, de permettre la bouteille à équilibrer dans un bain d'eau à 45 ° avant de les mélanger avec les médias contenant des cellules pour éviter la surchauffe des cellules. Étant donné que agarose se solidifie rapidement à la température ambiante, nous recommandons également que toutes les pipettes et des plaques de culture à 6 puits sont préchauffées dans un incubateur à 37 ° C avant d'ajouter la solution d'agarose pour empêcher la solidification prématurée lors de la manipulation.
Bien que la technique de formation de colonies sur gélose molle est un outil précieux pour la mesure de la tumorigénicité dans une gamme de lignées cellulaires de cancer, certaines lignes ne poussent pas dans la gélose molle. Anotson inconvénient potentiel de la méthode est que les cellules viables ne peuvent pas être récupérées une fois qu'ils sont plaqués dans la gélose molle. En outre, si un composé a une période plus courte de la biodisponibilité, l'étape d'alimentation devra être effectué plus fréquemment (par exemple tous les deux jours) et les échantillons doit être collecté en moins de sept jours. Le seuil pour la taille de la colonie devra également être réduite tout en tenant compte des différences potentielles entre les échantillons à être observées. Dans ces cas, devraient être incorporés pour optimiser les paramètres expérimentaux pour minimiser résultats faux-positifs et faux négatifs contrôles. En outre, cette technique peut être fastidieuse et difficile lors du test d'un grand nombre d'échantillons. Cependant, les progrès technologiques ont permis de surmonter certaines de ces limitations. Le dosage de l'agar mou classique (tel que documenté dans ce manuscrit) utilise généralement 6 puits des plaques de culture ou des boîtes de culture de 6mm. Avec des lecteurs de plaques automatisés, cependant, multiplDes échantillons de e peuvent être traitées dans des plaques de 384 puits 11. Par exemple, les enquêteurs pré-chargé cellules tumorales avec des colorants tels que les colorants et alamarBlue de tétrazolium et colonies sont quantifiés en utilisant un lecteur de plaque, évitant ainsi la nécessité de compter manuellement le numéro de la colonie 11. Cette capacité à haut débit est donc prête pour les écrans de médicaments contre le cancer à grande échelle.
En somme, le dosage de l'agar mou est une technique pré-clinique précieux qui peut être utilisé pour évaluer la tumorigénicité d'un large éventail de cellules cancéreuses (sein, prostate, de l'ovaire, et autres) en ce qui concerne leur sensibilité aux médicaments, hormones, chaleur, l'hypoxie, et une multitude d'autres conditions de traitement. L'essai continue de fournir un outil simple et instructif pour les chercheurs de cancer qui souhaitent mieux comprendre les mécanismes de la progression du cancer et de tester le potentiel anti-tumoral de nouvelles thérapies contre le cancer.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
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- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
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