Protocol
1. Herstellung von 3% 2-Hydroxyethyl Agarose
- In einem sauberen, trockenen 100 ml-Glasflasche, fügen Sie 0,9 g 2-Hydroxyethyl Agarose (Agarose VII), gefolgt von 30 ml destilliertem Wasser.
- Mikrowelle die Mischung für 15 Sekunden und leicht schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens drei weitere Male, bis die Agarose-Pulver vollständig auflöst.
- Autoklavieren der Lösung enthaltende Flasche für 15 min.
- Lassen Sie die Agarose-Lösung auf RT vor der weiteren Verwendung abkühlen. Bewahren Sie die Lösung bei RT.
2. Herstellung der Unterschicht: 0,6% Agarosegel
- Vorwärmen mehrere 5 ml und 10 ml-Pipetten in einem Inkubator bei 37ºC, um die Agarose erstarrt in der Pipette bei der Handhabung zu verhindern.
- Teilweise lösen Sie die Flaschendeckel und Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. Dann sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec. ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig beim Schwenken des agarose Lösung, da die Lösung erhebt sich an der Luft und können überschwappen.
- Wenn es Rest festes Gel in der Flasche, Mikrowelle für ein paar Sekunden.
- Halten Sie die Flasche mit der Agarose-Lösung in einem 45 ° C Wasserbad während der nächsten Schritte, um die Agarose-Lösung verfestigt vorzeitig zu verhindern.
- Warm MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad. Anmerkung: MCF10DCIS Medien besteht aus DMEM / F12, 5% Pferdeserum, 5% Penicillin-Streptomycin.
- Übertragungs 3 ml der 3% igen Lösung unter Verwendung der vorgewärmten Pipetten in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen.
- Sofort im 12 ml warmem MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen das konische Röhrchen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Versuchen Sie nicht, alle Blasen zu bilden, wie es mit der Koloniezahl später stören.
- Vorsichtig 2 ml dieser Mischung in jede Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte hinzufügen, ohne die Bildung von Luftblasen.
- Inkubieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontally auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für 1 Stunde, damit die Mischung zu verfestigen.
- Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für 30 Minuten. Die untere Schicht ist jetzt einsatzbereit.
3. Herstellung der zellhaltigen Schicht: 0,3% Agarosegel
- Trypsinize MCF10DCIS Zellen und verdünnen, um eine Zellkonzentration von 4 x 10 4 / ml.
- Nehmen Sie 2 ml der 3% igen mit vorgewärmten Pipetten und Überführung in eine sterile 50 ml konischen Röhrchen.
- Sofort an den konischen Rohr 8 ml MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie bilden keine Blasen.
- Nehmen Sie 2 ml der MCF10DCIS Zellen (4 x 10 4 / ml) und behandle mit BB-CLA (0 uM (DMSO) oder 1 & mgr; M).
- In einem 1: 1-Verdünnung, Mischen der Zellen mit 0,6% Agarose.
- Nimm 1 ml der Zelle-Agarose-Mischung und schonend hinzuzufügen auf die untere Schicht der 6-Well-Kultur pspät (2 x 10 4 Zellen / ml).
- Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 Minuten, damit die obere Schicht zu verfestigen.
- Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für eine Woche vor der Zugabe des Fütterungsschicht.
4. Vorbereitung der Feeder-Schicht: 0,3% Agarosegel
- Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec.
- Äquilibrieren Sie die Agarose-Lösung Flasche in einem 45 ° C Wasserbad.
- Wärmen Sie die MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad.
- Mix 1 ml 3% Agarose-Lösung mit 9 ml warmem MCF10DCIS Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen und vorsichtig umgedreht, um die Agarose zu den Medien mischen. Vermeiden Sie Luftblasen bilden.
- Behandlung der Mischung mit BB-CLA (0 & mgr; (DMSO) oder 1 & mgr; M).
- Vorsichtig 1 ml dieser Mischung (ohne fürming Blasen) in jedes Well der 6-Well-Kulturplatte, die den Boden und weichen Schichten.
- Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 min, die Mischung zu verfestigen.
- Nachdem der Feeder-Schicht erstarrt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator.
- Wiederholen Sie diese Prozedur Zufuhr wöchentlich durch Überlagerung von 1 ml 0,3% Agarose / mittel / Behandlungslösung auf den vorhandenen Futterschicht, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet. Hinweis: Agar in den weichen und Feeder-Schichten sehr weich ist, und daher wird die zugesetzten Nährstoffe aus der Feeder-Schicht leicht in die Zellen enthaltende Schicht diffundieren, um die Zellen zu erreichen.
5. Data Collection
- Nach 2,5 Wochen Zellwachstum in dem weichen Agar, zählen die Anzahl der Kolonien in jeder Vertiefung unter Verwendung eines Lichtmikroskops. Um eine Quantifizierung zu ermöglichen, drucken Sie ein Raster auf eine Transparenz und befestigen Sie das Raster, um die6-Well-Platte, um zu lokalisieren, wo die Zellen während der Zählung sind. Da Koloniegröße (wie durch den Durchmesser jeder Kolonie quantifiziert) variiert vordefinieren eine Referenzkoloniegröße zu bestimmen, welche Kolonien erzielt wird. Beispielsweise umfassen Koloniegrößen von 70 um oder in der Datenanalyse größer.
- Lagern die Proben bei 4 ° C weiter Koloniebildung und für zukünftige Zählung zu verhindern. Verschließen Sie den 6-Well-Kulturplatte mit Parafilm, um die Gele vor dem Austrocknen zu verhindern.
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Representative Results
Die Koloniebildung in Weichagar-Assay kann für eine breite Palette von Anwendungen dokumentieren die Tumorigenität von Krebszellen verwendet werden. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die halbfeste Matrix selektiv begünstigt das Wachstum von Zellen, die in einem verankerungsunabhängigen Weise vermehren können. Diese Eigenschaft wird hauptsächlich durch die Krebszellen, aber nicht von normalen Zellen zeigten. Verwendet werden vor allem diese Technik, um die Wirksamkeit der Hemmung des Tumorwachstums durch Medikamente zu testen und um den Effekt der Überexpression oder Erschöpfung der Gene von Interesse, einschließlich PADI Gene zu testen, auf die Tumorigenität von Brustkrebszellen. Hier untersuchten wir die Wirkung von CLA auf die BB-tumorigenen Hemmung PADI2 überexprimierende MCF10DCIS Zellen (Abbildung 1 und 2).
Die Ergebnisse zeigen, daß BB-CLA die Bildung MCF10DCIS Zellen abgeleiteten Kolonien deutlich hemmt. 3 zeigt, dass in Gegenwart eines PADI Inhibitor, t Hier war eine Reduktion sowohl der Koloniebildung und Koloniegröße, verglichen mit der DMSO-Kontrolle. [Anmerkung:. BB-CLA wurde in DMSO gelöst und auf diese Weise wurde DMSO als Kontrolle] Die Grße der Kolonien für BB-CLA behandelt MCF10DCIS Zellen wurden überwiegend im Bereich von 20 bis 100 um, während die Größe der Kolonien auf die DMSO Steuer zeigte einen größeren Bereich von 70 bis 150 & mgr; m nach 2,5 Wochen Wachstum.
Kolonien von mehr als 70 um wurde gezählt und analysiert (Abbildung 4). Es war ein Durchschnitt von 3536 Kolonien in der DMSO-Kontrolle während nur 1.967 Kolonien wurden in der BB-CLA behandelten Gruppe nach 2,5 Wochen der Soft-Agar-Kultur gesehen. Dies stellt eine 44% ige Abnahme der durchschnittlichen Koloniebildung in Gegenwart von 1 uM BB-CLA, was auf eine signifikante Hemmung der tumorigenen Brustkrebszellen (MCF10DCIS Zellen) durch den PADI Inhibitor.
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Abbildung 1: Chemische Struktur von BB-CLA.
Abbildung 2. Schematische Übersicht des Protokolls für die Koloniebildung in Weichagar-Assay. Jede Vertiefung der 6-Well-Kulturplatten wurde zunächst mit 0,6% Agarose-Gel (untere Schicht) beschichtet. Ein 0,3% iges Agarosegel Mischung die MCF10DCIS Zellen und entweder das BB-CLA-Inhibitor (1 & mgr; M) oder DMSO (Kontrolle) enthielt, wurde dann auf der Oberseite der 0,6% igen Gel geschichtet. Einmal in der Woche wurde die 0,3% Agarose-Gel-Mischung (enthaltend BB-CLA) auf der weichen Schicht zugegeben. Nach 2 bis 4 Wochen wurde die Koloniebildung beobachtet und für die Datenanalyse gezählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Bilder der Koloniebildung in BB-CLA-behandelten MCF10DCIS Cells. MCF10DCIS Zellen wurden in Weichagar in der Gegenwart (1 & mgr; M BB-CLA) oder Abwesenheit von BB-CLA (0 uM DMSO) gewachsen. Nach 2,5 Wochen Kolonien wurden mit einem inversen Mikroskop mit geringer Vergrößerung für Bilder und ein Lichtmikroskop auf hoher Vergrößerung Bilder abgebildet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Quantifizierung MCF10DCIS Koloniezahl nach BB-CLA Behandlung. MCF10DCIS Zellen wurden in Weichagar mit unterschiedlichen Konzentrationen von BB-CLA (0 & mgr; (DMSO) oder 1 & mgr; BB-CLA) gezüchtet. Nach 2,5 Wochen einzelnen Kolonien größer thund 70 & mgr; m gezählt. Experimente wurden 4 mal wiederholt (n = 4). Die statistische Signifikanz der Gesamtzellzahl Differenz zwischen Behandlungs- und Kontrollproben wurde durch zwei Stichproben Student-t-Test (* p <0,005) bestimmt wird.
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Discussion
Die Rate der Koloniebildung in Weichagar in Abhängigkeit von dem Zelltyp 9 abhängig. Daher ist die Anzahl von Zellen mit zu optimieren und entsprechend angepasst werden starten. Eine vorgeschlagene Startbereich liegt zwischen 5 x 2 bis 01 Oktober x 10 4 Zellen pro Vertiefung unter Verwendung einer 6-Well-Platte. Außerdem variiert Koloniegröße von der Wachstumsrate jeder Zelle abhängig. Daher wird ein vordefinierter ein cut-off für die Koloniegröße erforderlich, um einzelne Kolonien für nachgeschaltete quantitative Analysen mit Anmerkungen zu versehen. Hier Kolonien größer als 70 & mgr; m wurden quantifiziert, um die Aufnahme von nicht-proliferierenden Zellen von der ersten Beschichtung abgeleitet vermeiden.
Für ein optimales Wachstum, bei der die 3D-Agarosegelen, ist es ratsam, den gleichen Zellkulturmedium, in der Regel für die 2D-Zellkulturen verwendet wird. Dies liegt daran, Änderungsmedium oft ändert die Zellen Wachstumsrate, so dass zusätzliche Passagieren zu ermöglichen, dass die Zellen, um auf das neue Medium anpassen. Zum Beispiel, MCF10DCIS Zellen optimal in RPMI-1640, DMEM oder DMEM / F12-Medium gezüchtet werden. Wenn jedoch MCF10DCIS Kulturmedien aus RPMI-1640 zu DMEM / F12 geändert wird, gibt es eine deutliche Reduzierung der Zellproliferationsrate. Zusätzlich sollte darauf geachtet werden, die Serumkonzentration auf einem konstanten Niveau zu halten, da ohne Serum, wird die Koloniebildung inhibiert 10 werden kann. Ferner wird, nachdem die Agarose in der Mikrowelle, damit die Flasche in einem 45 ° C Wasserbad vor dem Mischen mit Medium, das Zellen Überhitzung der Zellen zu verhindern, zu äquilibrieren. Da die Agarose erstarrt schnell bei Raumtemperatur wird empfohlen, dass alle Pipetten und 6-Well-Kulturplatten in einem Inkubator bei 37ºC vor Zugabe Agaroselösung auf vorzeitige Erstarrung zu verhindern, während der Handhabung vorgewärmt.
Während der Koloniebildung in Weichagar-Technik ist ein wertvolles Werkzeug für die Messung Tumorigenität in einem Bereich von Krebszelllinien, einige Leitungen nicht wachsen in Weichagar. Anotihr möglicher Nachteil des Verfahrens ist, dass lebensfähige Zellen können nicht wiederhergestellt, sobald sie in den Weichagar plattiert werden. Außerdem, wenn eine Verbindung, einen kürzeren Zeitraum Bioverfügbarkeit hat, wird der Zufuhrschritt müssen häufiger (dh jeden zweiten Tag) durchgeführt werden, und die Proben müssen in weniger als sieben Tagen abgeholt werden. Die Schwelle für die Koloniegröße müssen auch reduziert werden, während noch zulassen Potentialdifferenzen zwischen den Proben zu beobachten. In diesen Fällen würde Kontrollen müssen einbezogen werden, um Versuchsparameter zu optimieren, um falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse zu minimieren. Darüber hinaus kann diese Technik zeitaufwendig und schwierig sein, wenn die Prüfung einer großen Anzahl von Proben. Jedoch haben technologische Fortschritte dazu beigetragen, um einige dieser Beschränkungen zu überwinden. Die herkömmliche Soft-Agar-Assay (wie in diesem Manuskript dokumentiert) verwendet in der Regel 6-Well-Kulturplatten oder 6mm Kulturschalen. Mit automatisierte Plattenleser jedoch multiple Proben in 384-well Platten 11 verarbeitet werden. Zum Beispiel Ermittler vorinstallierte Tumorzellen mit Farbstoffen wie alamarBlue und Tetrazoliumfarbstoffe und Kolonien werden quantifiziert unter Verwendung von Plattenlesegerät, wodurch die Notwendigkeit zur Koloniezahl 11 manuell zu zählen. Dieses Hochdurchsatzleistungsfähigkeit ist daher zugänglich für große Krebsmedikament-Bildschirme.
In der Summe ist die Soft-Agar-Assay eine wertvolle vorklinischen Technik, die verwendet werden können, um die Tumorigenität einer breiten Palette von Krebszellen (Brust-, Prostata-, Eierstock- und andere) im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln, Hormonen bewerten, Wärme, Hypoxie, und eine Vielzahl von anderen Behandlungsbedingungen. Der Test nach wie vor eine einfache und informative Werkzeug für Krebsforscher, die zum besseren Verständnis der Mechanismen der Tumorprogression und testen Sie die Anti-Tumor-Potenzial neuer Krebstherapien wollen bieten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
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