Protocol
% 3 2-Hidroksietil Agaroz hazırlanması 1.
- Temiz ve kuru bir 100 ml'lik cam şişe içine, damıtılmış su, 30 ml, ardından 2-hidroksietil agaroz (Agaroz VII) 0.9 g.
- 15 saniye hafifçe için karışım girdap mikrodalga. Agaroz tozu tamamen eriyene kadar bu adımı en az üç kez daha tekrarlayın.
- 15 dakika için çözelti içeren bir şişe otoklava.
- Agaroz çözüm daha kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Oda sıcaklığında çözelti saklayın.
Alt Katman 2. Hazırlık:% 0.6 Agaroz Jel
- Tutarken pipet katılaşmasını agaroz önlemek için 5 ml 37 ° C kuluçka makinesi içinde 10 mi pipetler önceden sıcak birçok.
- Kısmen şişe kapağı ve mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-hidroksietil agaroz çözümü gevşetin. Daha sonra, yumuşak bir 15 sn için çözelti ve mikrodalga girdap. DİKKAT: Agaro dönen dikkatli olunse çözümü çözüm havaya maruz ve yayılabilir zaman yükselir çünkü.
- Şişede kalan katı jel, birkaç saniye mikrodalga varsa.
- Erken katılaşmasını agaroz çözüm önlemek için bir sonraki adımları sırasında 45 ° C su banyosunda agaroz solüsyon içeren şişe tutun.
- 37 ° C su banyosu içinde sıcak MCF10DCIS ortamı. Not: MCF10DCIS ortam DMEM / F12,% 5 at serumu,% 5 penisilin streptomisin oluşur.
- Aktarım steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler kullanılarak% 3 agaroz çözeltisi 3 mi.
- Hemen sıcak MCF10DCIS medya 12 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için konik tüp ters. Bu koloni sonradan sayım engel olacak herhangi bir kabarcıkları oluşturmak için çalışın.
- Yavaşça hava kabarcıklarını oluşturucu olmayan bir 6-yuvalı kültür plakasının her bir oyuğuna, bu karışım 2 ml ekleyin.
- 6-çukurlu kültür plakası Horizonta inkübelly, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye karışımın sertleşmesine izin vermek.
- Karışım katılaşmasından sonra, 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin. alt tabaka artık kullanıma hazırdır.
Hücre içeren katmanın 3. hazırlanması:% 0.3 agaroz jel
- Trypsinize MCF10DCIS hücreler 4 x 10 4 / ml'lik bir hücre konsantrasyonuna seyreltilmesi ve.
- Bir steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler ve transferi ile% 3 agaroz 2 ml alın.
- Hemen konik tüp MCF10DCIS medya 8 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için ters. Herhangi kabarcıkları oluşturan kaçının.
- (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) MCF10DCIS hücreleri (4 x 10 4 / ml) 2 ml alın ve BB-CLA ile tedavi edilir.
- Bir 1: 1 seyreltme,% 0.6 agaroz ile hücrelerin karışımı.
- Hücre-agaroz karışımının 1 ml alın ve yavaşça 6 oyuklu kültür p alt tabakanın üzerine eklemekGeç (2 x 10 4 hücre / ml).
- Üst tabaka katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
- Karışım katılaşmasından sonra, besleme tabakanın ilave edilmeden önce bir hafta boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.
Besleyici Katman 4. Hazırlanması:% 0.3 Agaroz Jel
- Mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-Hidroksietil agaroz çözüm. yavaşça başka bir 15 saniye için çözüm ve mikrodalga girdap.
- 45 ° C su banyosu içinde agaroz çözelti şişe dengelenmesi.
- 37 ° C su banyosunda MCF10DCIS medyayı ısıtın.
- 50 ml konik bir tüp içine, sıcak MCF10DCIS ortam 9 ml% 3 agaroz çözeltisi 1 ml karıştırın ve yavaşça ortam ile agaroz karıştırmak için ters. Hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
- BB-CLA ile karışım (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) tedavi edin.
- Yavaşça için olmayan (bu karışıma 1 ml ekleMing alt ve yumuşak tabakalar ihtiva eden 6 oyuklu kültür plakasının her oyuğuna) kabarcıklar.
- Karışım, katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
- Besleyici tabakası katılaşır sonra, 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.
- Koloni oluşumu gözlenir kadar yeni medya ile hücreleri doldurmak için mevcut besleyici tabakası üzerine% 0.3 agaroz / orta / işleme çözeltisinin 1 ml kaplayan bu beslenme prosedürü haftalık tekrarlayın. Not: Agar yumuşak ve besleyici tabakalar bundan dolayı, besleyici tabaka ile ilgili ilave besinler kolaylıkla hücreler ulaşmak için hücre içeren bir tabaka halinde yayılır, çok yumuşak ve.
5. Veri Toplama
- Yumuşak agar içinde hücre büyümesinin 2.5 hafta sonra, her bir göze, bir ışık mikroskobu kullanarak koloni sayısı. Ölçümü kolaylaştırmak için, bir şeffaflık üzerine ızgara yazdırmak ve ızgara takmak6-plaka hücreleri sayma sırasında nerede bulmanıza yardımcı olmak için. (Her koloninin çapı ile miktarı gibi) koloni büyüklüğü değişebilir olduğundan, atılır olan koloniler belirlemek için bir referans koloni boyutunu önceden tanımlamak. Örneğin, 70 mikron ya da veri analizinde büyük bir koloni boyutları içerir.
- Daha fazla koloni oluşumunu ve gelecekteki sayım önlemek için 4 ° C'de örnekleri saklayın. Kurumasını önlemek için jeller Parafilm ile 6-kuyu kültür plaka Seal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
yumuşak agar koloni oluşturma deneyi kanser hücrelerinin tümör oluşum nedenlerinin belgeleyen çok geniş bir uygulama aralığı için kullanılabilir. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yan-katı bir matris seçici bir ankrajdan bağımsız bir şekilde prolifere olabilir hücrelerin büyümesini yana olmasıdır. Bu özellik esas olarak, kanser hücreleri tarafından değil, normal hücreler tarafından sergilenir. Öncelikle ilaçlar ile tümör büyüme inhibisyonu etkinliğini test etmek için, meme kanseri hücrelerinin bedenindeki, aşırı ekspresyonu veya PADI genleri de dahil olmak üzere ilgi eden genler, tükenmesi etkisini test etmek için bu tekniği kullanır. Burada, PADI2-aşırı ifade MCF10DCIS hücrelerinin tümörijenik inhibisyonu BB-CLA etkisi değerlendirildi (Şekil 1 ve 2).
Sonuçlar BB-CLA anlamlı MCF10DCIS hücresinden türetilmiş koloni oluşumunu önlediğini de gösterir. Şekil 3 gösterir, bu PADI inhibitörünün varlığında, t DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında burada her iki koloni oluşumu ve koloni boyutunda bir azalma oldu. [Not:. BB-CLA DMSO içinde çözündürüldü ve bu nedenle, DMSO, bir kontrol olarak kullanılmıştır] bb-CLA için koloni büyüklüğü MCF10DCIS hücreler 100 um, 20 ila ağırlıklı olan tedavi sırasında DMSO için koloni büyüklüğü Kontrol büyüme 2,5 hafta sonra 70 mikron 150 daha geniş bir yelpazede sergiledi.
70 um'den daha büyük koloniler sayıldı ve (Şekil 4) kullanılarak analiz edilmiştir. Sadece 1967 koloniler yumuşak agar kültürü 2,5 hafta sonra BB-CLA tedavi edilen grupta görüldü ise DMSO kontrol 3536 kolonilerin ortalama vardı. Bu PADI inhibitörü ile göğüs kanseri hücrelerinin önemli bir tümör oluşturucu inhibisyon (MCF10DCIS hücreleri) gösteren, 1 uM BB-CLA varlığında ortalama koloni oluşumu bir% 44 azalmayı temsil etmektedir.
pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
BB-CLA Şekil 1. Kimyasal Yapısı.
Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi için Protokol Şekil 2. şematik genel bir bakış. 6 oyuklu kültür plakalarının her bir kuyu önce% 0.6 agaroz jeli (alt katman) ile kaplandı. MCF10DCIS hücreleri ve BB-CLA inhibitörü (1 uM) veya DMSO (kontrol) ya da ihtiva eden bir% 0.3 agaroz jel karışımı daha sonra% 0.6 jel üzerine tabaka halinde serilir. Haftada bir kere,% 0.3 agaroz jel karışımı, (BB-CLA ihtiva eder), yumuşak tabakanın üzerine eklendi. 2 ila 4 hafta sonra, koloni oluşumu gözlendi ve veri analizi için sayıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
BB-CLA-muamele MCF10DCIS Hücreler içinde koloni oluşumu Şekil 3. Çıkan. MCF10DCIS hücreler BB-CLA (0 uM DMSO) varlığında (1 uM BB-CLA) veya yokluğunda, yumuşak agar içinde büyütülmüştür. 2.5 hafta, koloniler düşük büyütme görüntüleri için ters bir mikroskop ve yüksek büyütme görüntüler için ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir edildikten sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
MCF10DCIS koloni sayısının Şekil 4. Niceleme BB-CLA tedavisi. MCF10DCIS hücreler BB-CLA (0 uM (DMSO) ya da 1 uM BB-CLA) farklı konsantrasyonlarda yumuşak agar içinde yetiştirilmiştir sonra. 2.5 hafta sonra ayrı ayrı koloniler, daha büyük bir inciBir 70 um sayılmıştır. Deneyler 4 kez tekrarlandı (n = 4). Kontrol ve tedavi örnekler arasında, toplam hücre sayısı farkın istatistiksel olarak anlamlı iki örneklem Student t-testi (* p <0.005) ile belirlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
yumuşak agar içinde koloni oluşumu oranı hücre tipi 9 bağlı olarak değişir. Bu nedenle, hücre sayısı optimize edilmiş ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır ile başlayın. Önerilen bir başlangıç aralığı oyuk, 6 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 4 ila 10 x 02-1 Ekim x 5 arasındaki hücreleridir. Buna ek olarak, koloni büyüklüğü her bir hücrenin büyüme hızına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, koloni boyutu için önceden tanımlanmış bir cut-off aşağı kantitatif analizler için bireysel koloniler açıklamak gereklidir. Burada, daha büyük 70 mikron ilk kaplama türetilen çoğalan hücrelerin oluşumunu önlemek için nicelendirildi koloniler.
3D agaroz jelleri yaparken optimum büyüme için, normal olarak 2B hücre kültürlerinde için kullanılan aynı hücre kültürü ortamını kullanmak tavsiye edilir. Genellikle kez orta değişen ve böylece hücrelerin yeni ortama uyum sağlamak için ek pasajlanmasını gerektiren hücreler büyüme hızını değiştirir olmasıdır. Örneğin, MCF10DCIS hücreleri, RPMI-1640, DMEM ya da DMEM / F12 ortamında, en iyi şekilde yetiştirilebilir. MCF10DCIS kültür ortamı DMEM / F12 RPMI-1640 değiştirildiğinde, ancak, hücre proliferasyon hızı gözle görülür bir azalma vardır. Buna ek olarak, bakım serumsuz, koloni oluşumu 10 inhibe olacak, çünkü sabit bir seviyede serum konsantrasyonlarını korumak için önlem alınmalıdır. Agaroz mikro sonra Ayrıca, şişe ortam hücreleri aşırı ısınmasını önlemek için hücreleri ihtiva ile karıştırılmadan önce 45 ° C su banyosu içinde dengelenmeye bırakın. Agaroz, oda sıcaklığında hızlı bir şekilde katılaşan göz önüne alındığında, aynı zamanda, tüm pipetler ve 6 oyuklu kültür plakaları taşıma sırasında erken katılaşmasını önlemek için agaroz çözeltisi ilave edilmeden önce 37 ° C kuluçka makinesi içinde ön ısıtmaya tabi tavsiye edilir.
Yumuşak agar koloni oluşumu tekniği kanseri hücre çizgileri, bir dizi tümör oluşum nedenlerinin ölçmek için değerli bir araç olmakla birlikte, bazı hatlar, yumuşak agar içerisinde büyüme yok. AnotYöntemin onun potansiyel dezavantajı yumuşak agar içine kaplı kez canlı hücreler geri alınamaz olmasıdır. Bir bileşik kısa biyoyararlanım süresi vardır, ayrıca, beslenme adım daha sık (örneğin her gün) yapılması gerekir ve örnekler az yedi gün içinde tahsil edilmesi gerekir. koloni boyutu için eşik de hala uyulması gereken numuneler arasındaki potansiyel farkları için izin verirken azaltılması gerekecektir. Bu gibi durumlarda, kontrol-yanlış pozitif ve yanlış-negatif sonuçları en aza indirmek için deney parametreleri optimize etmek için dahil edilmesi gerekir. Örneklerin çok sayıda test Dahası, bu teknik, zor ve zaman alıcı olabilir. Ancak, teknolojik gelişmeler, bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için yardımcı olmuştur. (Bu yazıda belirtildiği gibi) geleneksel yumuşak agar tahlil genellikle 6 kuyu kültür plakaları veya 6mm kültür yemekleri kullanır. Otomatik plaka okuyucu ile, ancak, multiplE numuneleri 384 oyuklu plakalar 11 işlenebilir. Örneğin, araştırmacılar, böylece elle koloni sayısını 11 saymak gerek kalmayabilir, plaka okuyucu kullanılarak değerlendirilmiştir edilir gibi AlamarBIue olarak boyalar ve tetrazolium boyalar ve kolonileri ile tümör hücrelerini önceden yüklenmiş. Bu yüksek verimlilik kapasitesi, bu nedenle, büyük ölçekli kanser ilaç ekranlar için elverişlidir.
Sonuç olarak, yumuşak agar tahlili, ilaçlar, hormonlar duyarlılıkları açısından, kanser hücrelerinin (göğüs, prostat, yumurtalık, ve diğerleri) geniş bir aralığı tümör oluşum nedenlerinin değerlendirmek için kullanılabilecek değerli bir ön-klinik bir tekniktir Isı, hipoksi ve diğer işlem şartlarına bir katman ortaya çıkacaktır. Tahlil daha iyi kanser ilerleme mekanizmaları anlamak ve yeni kanser tedavileri, anti-tümör potansiyelini test etmek isteyen araştırmacılar için kanser basit ve bilgilendirici bir araç vermeye devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
