Protocol
1.制备3％2-羟乙基琼脂糖
- 到一个干净，干燥的100 ml玻璃瓶中加入0.9克2-羟乙基琼脂糖（琼脂糖VII），随后加入30ml蒸馏水。
- 微波15秒，轻轻混合漩涡。重复此步骤至少三次，直到琼脂糖粉末完全溶解。
- 高压釜中加入含有溶液的瓶子15分钟。
- 允许琼脂糖解决方案，进一步使用前冷却至室温。存储溶液在RT。
2.编写底层：0.6％琼脂糖凝胶
- 预暖几个5毫升和10ml移液器在37℃培养箱中，以防止琼脂糖从搬运时固化在吸管。
- 部分地松开瓶盖和微波15秒的预制备3％2-羟乙基琼脂糖溶液。然后，轻轻地旋转解决方案和微波了15秒钟。注意：在纷飞的时候琼胶要小心本身的方案，因为当暴露于空气中，并可以溢出的溶液上升。
- 如果存在残留的固体凝胶在瓶中，微波几秒钟。
- 保持含在下一步骤，以防止该琼脂糖溶液从固化过早在45℃水浴琼脂糖溶液的瓶中。
- 温馨MCF10DCIS媒体在37℃水浴。注意：MCF10DCIS媒体包括DMEM / F12，5％马血清，5％青霉素链霉素。
- 转印3毫升使用预热的移液管的3％的琼脂糖溶液加入到无菌的50ml锥形管中。
- 立即加列12毫升温MCF10DCIS媒体和轻轻颠倒锥形管混合与媒体的琼脂糖。尽量不形成任何气泡，因为它会与殖民地后计数干扰。
- 轻轻加入2毫升该混合物到6孔培养板的各孔而不形成任何气泡。
- 孵育的6孔培养板horizontaLLY在平坦表面上，在4℃下1小时，以允许混合物固化。
- 混合物固化后，将板放入37℃培养箱中30分钟。底层是现在可以使用。
3.制备含细胞层：0.3％琼脂糖凝胶
- Trypsinize MCF10DCIS细胞并稀释至4×10 4个/ ml的细胞浓度。
- 取2毫升使用预热移液器并传输3％琼脂糖的进入无菌50ml锥形管中。
- 立即添加8毫升MCF10DCIS媒体到锥形管并轻轻颠倒混合与媒体的琼脂糖。避免形成任何气泡。
- 取2毫升MCF10DCIS细胞（4×10 4个/ ml）的中和治疗与BB-CLA（0μM（DMSO）或1μM的）。
- 以1：1稀释，混合细胞与0.6％的琼脂糖。
- 取1毫升细胞 - 琼脂糖混合物，轻轻加入到6孔培养p的底层晚期（2×10 4个细胞/ ml）。
- 水平放置的6孔培养板中在一个平面上，在4℃下至少15分钟，以允许在顶层固化。
- 混合物固化后，将板放入37℃培养箱中培养一周增加馈送层之前。
4.准备饲养层的0.3％琼脂糖凝胶
- 微波15秒的预制备3％2-羟乙基琼脂糖溶液。轻轻摇动解决方案和微波了15秒钟。
- 平衡的琼脂糖溶液瓶在45℃水浴中。
- 暖MCF10DCIS媒体在37℃水浴。
- 混合1毫升3％的琼脂糖溶液用9ml温暖MCF10DCIS媒体到50ml锥形管中并轻轻颠倒混合与媒体的琼脂糖。避免形成气泡。
- 治疗与BB-CLA的混合物（0μM（DMSO）或1μM的）。
- 轻轻加1ml该混合物中（不包括用于明气泡）到含有底和软层中的6孔培养板的每个孔中。
- 水平放置的6孔培养板中在一个平面上，在4℃下至少15分钟以使该混合物固化。
- 饲养层固化后，将板放入37℃培养箱中。
- 通过叠加将1ml 0.3％琼脂糖/中/处理溶液到现有的饲养层来补充细胞与新媒体直到集落形成观察到重复此馈送过程每周。注意：琼脂在柔软和饲养层是非常柔软的，因此，从饲养层添加的营养物将容易地扩散入含细胞层到达细胞。
5.数据收集
- 2.5周细胞生长在软琼脂后，计数在使用光学显微镜每孔的集落数。为了便于定量，打印网格到透明度和电网连接到6孔板，以帮助找到那里的细胞计数中。自菌落大小（如量化由每个菌落的直径）将变化，预定义的参考菌落大小，以确定哪些集落进行评分。例如，包括70微米或在数据分析中较大的菌落尺寸。
- 储存样品在4℃以防止进一步的集落形成，并为未来的计数。密封6孔培养板用封口膜，以防止凝胶干燥。
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Representative Results
软琼脂集落形成测定法可用于范围广泛的应用中记录癌细胞的致瘤性。这种技术的主要优点是，半固体基质选择性有利于细胞，它可以在一个锚定非依赖性方式增殖的生长。此特征主要表现由癌细胞而不由正常细胞。我们主要使用这种技术通过药物测试的肿瘤生长抑制的效果和测试对于过表达或我们的基因的兴趣，包括PADI基因的耗竭的效果，对乳腺癌细胞的致瘤性。这里，我们评估BB-CLA对的PADI2过表达MCF10DCIS细胞瘤抑制效果（图1和2）。
结果表明，BB-CLA显著抑制MCF10DCIS细胞的集落的形成; 图3示出的是，在一个PADI抑制剂的存在下，叔这里是在这两个集落形成和细胞集落大小减小时相比，DMSO对照。 [注：BB-CLA溶于DMSO并且因此，将DMSO用作对照]菌落为BB-CLA的大小处理的MCF10DCIS细胞主要20的范围内，以100微米，而菌落的DMSO中尺寸控制表现出更大的范围为70到150微米的2.5周增长之后。
菌落比70微米大的计数并进行分析（ 图4）。在DMSO对照而只有1967个菌落2.5周软琼脂培养后可见的BB-CLA处理组中的平均3536菌落有。这代表了降低的平均集落形成在1μM的BB-CLA的存在下44％，这表明乳腺癌细胞的一个显著致瘤抑制（MCF10DCIS细胞）由PADI抑制剂。
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BB-CLA的图1的化学结构。
该议定书的图2.概述为软琼脂集落形成测定。在6孔培养板的每孔首先用0.6％琼脂糖凝胶（底层）。然后层叠在0.6％的凝胶的顶部含有MCF10DCIS细胞，要么将BB-CLA抑制剂（1μM）或DMSO（对照）A 0.3％琼脂糖凝胶混合物。每周一次，在0.3％的琼脂糖凝胶混合物（含有BB-CLA）的溶液中加入在软层的顶部。 2〜4周后，克隆形成，观察和计算进行数据分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.量化MCF10DCIS菌落数后的BB-CLA处理。MCF10DCIS细胞以不同浓度的BB-CLA（0μM（DMSO）或1μM的BB-CLA）的生长在软琼脂。 2.5周后，单个菌落大日一个70微米的计数。实验重复4次（n = 4）。控制和治疗样品之间总细胞计数差异的统计显着性由两样本学生t检验（* P <0.005）测定。
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Discussion
的集落形成在软琼脂速率的变化取决于细胞类型9。因此，细胞的数量，以开始与应优化，并相应地调整。一个建议的起始范围为每使用公一个6孔板在5×10 2〜1×10 4个细胞。此外，菌落大小取决于每个细胞的生长速度。因此，一个预定的截止菌落大小是需要的注释下游定量分析单个菌落。这里，菌落大于70微米的被量化，以避免包含非增殖细胞从最初的镀衍生的。
对于最佳生长，使得3D琼脂糖凝胶时，最好是使用通常用于2D细胞培养相同细胞培养基。这是因为变换媒体经常倍改变的细胞的生长速率，因而需要额外的传代，以使细胞适应新的平台。例如，MCF10DCIS细胞可以在RPMI-1640，DMEM，或DMEM / F12培养基最佳生长。然而，当MCF10DCIS培养介质从RPMI-1640改变为DMEM / F12，有一个显着减少细胞增殖速率。此外，应注意维持血清浓度在恒定的水平，因为没有血清，集落形成将被抑制10。此外，琼脂糖微波后，允许瓶子与媒体含有细胞，以防止过热的细胞混合前在45℃水浴中平衡。鉴于琼脂糖在室温下迅速固化，我们还建议，所有移液管和6孔培养板中加入琼脂糖溶液，以防止过早固化，同时处理之前被预热在37℃培养箱。
而软琼脂集落形成的技术是，用于测量致瘤性的范围内的肿瘤细胞株的有价值的工具，某些行不生长在软琼脂。 ANOT她的潜力的方法的缺点是活细胞不能恢复一旦被镀到软琼脂。此外，如果化合物具有较短的生物利用度期间，进给步骤将需要更频繁地（ 即每隔一天）进行，并且样品将需要收集在少于七天。为菌落大小阈还将需要，同时仍然允许被观察的样本之间的电位差减小。在这些情况下，控制将要被并入到优化实验参数以最小化假阳性和假阴性结果。此外，这种技术可以在测试大量样品时是费时和困难的。然而，技术的进步已帮助克服这些局限性。传统的软琼脂法（如记录在这个手稿）通常使用6孔培养板或6毫米培养皿。随着自动化板块的读者，但是，含多处ê样品可以在384孔板11进行处理。例如，调查预加载的肿瘤细胞与染料如的AlamarBlue和四唑鎓染料和菌落利用板读数器定量，从而不需要手动计数菌落数11。这个高吞吐量能力，因此，适合于大规模癌症药物屏幕。
总之，软琼脂测定法是一种有价值的临床前的技术，可用于与问候其对药物的敏感性，激素评估一个宽范围的癌症细胞（乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和其他）的致瘤性，热，缺氧，和大量的其他处理条件。该试验继续提供一个直接和信息的工具，癌症研究人员谁希望更好地了解癌症进展的机制和测试新的癌症疗法的抗肿瘤潜力。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
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