Protocol
1. Bereiding van 3% 2-hydroxyethyl Agarose
- In een schone, droge 100 ml glazen fles, voeg 0,9 g 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII), gevolgd door 30 ml gedestilleerd water.
- Magnetron het mengsel gedurende 15 sec en zachtjes wervelen. Herhaal deze stap ten minste nog drie keer tot de agarose poeder volledig oplost.
- Autoclaaf de oplossing bevattende fles voor 15 min.
- Laat de agarose oplossing afkoelen tot kamertemperatuur vóór verder gebruik. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.
2. Bereiding van de onderste laag: 0,6% agarosegel
- Pre-warm verscheidene 5 ml en 10 ml pipetten in een 37 ° C incubator om te voorkomen dat de agarose stollen in de pipet bij het hanteren.
- Gedeeltelijk draai de fles deksel en een magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose oplossing voor 15 sec. Vervolgens voorzichtig zwenken de oplossing en magnetron nog eens 15 sec. LET OP: Wees voorzichtig bij het wervelende de agarose oplossing omdat de oplossing stijgt bij blootstelling aan lucht en kan overslaan.
- Als er overblijvende vaste gel in de fles, magnetron gedurende enkele seconden.
- Houd de fles met de agarose oplossing in een 45 ° C waterbad tijdens de volgende stappen om de agarose oplossing voorkomen stollen voortijdig.
- Warm MCF10DCIS media in een 37 ° C waterbad. Opmerking: MCF10DCIS media bestaat uit DMEM / F12, 5% paardenserum, 5% penicilline streptomycine.
- Overdracht 3 ml van 3% agarose-oplossing met de voorverwarmde pipetten in een steriele 50 ml conische buis.
- Onmiddellijk toevoegen 12 ml warm MCF10DCIS media en voorzichtig omkeren van de conische buis om de agarose met de media te mengen. Probeer om geen luchtbellen te vormen zoals het zal interfereren met de kolonie later tellen.
- Voeg voorzichtig 2 ml van dit mengsel in elk putje van een 6-well cultuur plaat zonder vormen eventuele luchtbellen.
- Incubeer de 6-well cultuur plaat horizontally op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende 1 uur om het mengsel stollen.
- Nadat het mengsel vast wordt, plaatst de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten. De onderste laag is nu klaar voor gebruik.
3. Bereiding van de Cell-bevattende laag: 0,3% agarosegel
- Trypsinize MCF10DCIS cellen en verdun ze een celconcentratie van 4 x 10 4 / ml.
- Neem 2 ml van 3% agarose behulp voorverwarmd pipetten en over in een steriele 50 ml conische buis.
- Onmiddellijk toevoegen 8 ml MCF10DCIS media om de conische buis en voorzichtig omkeren aan de agarose met de media te mengen. Vermijd de vorming van eventuele luchtbellen.
- Neem 2 ml van de MCF10DCIS cellen (4 x 10 4 / ml) en behandel met BB-CLA (0 uM (DMSO) en 1 uM).
- In een 1: 1 verdunning, meng de cellen met 0,6% agarose.
- Neem 1 ml van de cel-agarose mengsel en voeg voorzichtig op de onderste laag van de 6-well kweek plate (2 x 10 4 cellen / ml).
- Plaats de 6-well kweekplaat horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende ten minste 15 minuten om de toplaag te stollen.
- Nadat het mengsel vast wordt, plaatst de plaat in een 37 ° C incubator gedurende een week vóór het toevoegen van de voeding laag.
4. Voorbereiding van de Feeder laag: 0,3% agarosegel
- Magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose oplossing voor 15 sec. Zwenk de oplossing en een magnetron voor nog eens 15 sec.
- Equilibreer de agarose oplossing fles in een 45 ° C waterbad.
- Verwarm de MCF10DCIS media in een 37 ° C waterbad.
- Meng 1 ml 3% agarose oplossing 9 ml warm MCF10DCIS media in een 50 ml conische buis en voorzichtig omkeren om de agarose met de media te mengen. Vermijd de vorming van luchtbellen.
- Behandel het mengsel BB-CLA (0 uM (DMSO) of 1 uM).
- Voeg voorzichtig 1 ml van dit mengsel (zonder voorming bellen) in elk putje van de 6-well kweekplaat die de bodem en zachte lagen.
- Plaats de 6-well kweekplaat horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende ten minste 15 minuten om het mengsel stollen.
- Nadat de feeder layer stolt, plaats de plaat in een 37 ° C incubator.
- Herhaal deze procedure voeren wekelijks door overlaying 1 ml 0,3% agarose / medium / behandeling oplossing op de bestaande feeder laag om de cellen te vullen met nieuwe media tot kolonievorming wordt waargenomen. Opmerking: Agar in de zachte feeder lagen is zeer zacht en daarom wordt de extra voedingsstoffen uit de voederlaag gemakkelijk diffunderen in de cel-bevattende laag op de cellen te bereiken.
5. Data Collection
- Na 2,5 weken van celgroei in zachte agar, tel het aantal kolonies in elk putje met behulp van een lichtmicroscoop. Om kwantificering te vergemakkelijken, drukt u een raster op een transparantie en bevestig het rooster aan de6-putjesplaat te bepalen waar de cellen tijdens het tellen. Aangezien kolonie grootte (zoals gekwantificeerd door de diameter van elke kolonie) variëren, vooraf instellen verwijzing koloniegrootte te bepalen welke kolonies worden gescoord. Bijvoorbeeld omvatten kolonie groottes van 70 micrometer of groter de gegevensanalyse.
- Bewaar de monsters bij 4 ° C tot verdere vorming kolonie toekomstige tellen te voorkomen. Sluit de 6-well kweekplaat met Parafilm te voorkomen dat de gel uitdroogt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De zachte agar kolonievorming test kan worden gebruikt voor een groot aantal toepassingen documenteren van de tumorigeniciteit van kankercellen. Een groot voordeel van deze techniek is dat de halfvaste matrix selectief bevordert de groei van cellen die kunnen prolifereren in een verankering-onafhankelijke wijze. Deze eigenschap is vooral vertoond door kankercellen, maar niet normale cellen. We gebruiken voornamelijk deze techniek om de effectiviteit van tumorgroei inhibitie testen van drugs en testen op het effect van overexpressie of uitputting van onze genen van belang, met inbegrip PADI genen op de tumorigeniciteit van borstkankercellen. Hier werd het effect van CLA op BB-tumorigene remming van PADI2 overexpressie MCF10DCIS onderzochten we cellen (Figuur 1 en 2).
De resultaten tonen aan dat de BB-CLA remt significant de vorming van MCF10DCIS cellen afgeleide kolonies. Figuur 3 toont aan dat, in aanwezigheid van een inhibitor PADI t, Hier werd een reductie van zowel kolonievorming en koloniegrootte vergelijking met de DMSO-controle. [Noot:. BB-CLA werd opgelost in DMSO en derhalve DMSO werd toegepast als controle] De grootte van de kolonies van BB-CLA behandelde MCF10DCIS cellen waren overwegend binnen het traject van 20 tot 100 urn terwijl de grootte van de kolonies van de DMSO controle vertoonde een groter bereik van 70 tot 150 pm na 2,5 weken groei.
Kolonies groter dan 70 urn werden geteld en geanalyseerd (figuur 4). Er was gemiddeld 3536 kolonies in de DMSO controle terwijl slechts 1.967 kolonies werden waargenomen in de BB-CLA behandelde groep na 2,5 weken zachte agar kweek. Dit betekent een afname 44% in de gemiddelde kolonievorming in aanwezigheid van 1 uM BB-CLA, hetgeen een aanzienlijke tumorigene remming van borstkankercellen (MCF10DCIS cellen) van het PADI inhibitor.
Pbelasting / 52.727 / 52727fig1.jpg "/>
Figuur 1. chemische structuur van BB-CLA.
Figuur 2. Schematisch overzicht van het protocol voor de Soft Agar Kolonie Formatie Assay. Elk putje van de 6-putjes werd eerst bekleed met 0,6% agarose gel (onderste laag). Een 0,3% agarose gel mengsel dat de MCF10DCIS cellen en hetzij de BB-CLA remmer (1 uM) of DMSO (controle) werd daarna gelaagd bovenop de 0,6% gel. Eenmaal per week, de 0,3% agarose gel mengsel (dat BB-CLA) toegevoegd bovenop de zachte laag. Na 2 tot 4 weken, werd kolonievorming waargenomen en geteld voor data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Foto's van kolonievorming in BB-CLA behandelde MCF10DCIS cellen. MCF10DCIS cellen werden gekweekt in zachte agar met (1 uM BB-CLA) of afwezigheid van BB-CLA (0 uM DMSO). Na 2,5 weken, kolonies werden afgebeeld met behulp van een omgekeerde microscoop voor lage vergroting beelden en een lichtmicroscoop voor hoge vergrotingsfactor beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Kwantificering van MCF10DCIS aantal kolonies na BB-CLA Treatment. MCF10DCIS cellen werden gekweekt in zachte agar bij verschillende concentraties van BB-CLA (0 uM (DMSO), of 1 uM BB-CLA). Na 2,5 weken, individuele kolonies groter thEen 70 urn geteld. De experimenten werden 4 keer herhaald (n = 4). De statistische significantie van de totale celtelling verschil tussen de behandelde en controlegroepen monsters werd bepaald door t-test voor twee steekproeven Student (* p <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mate van kolonievorming in zachte agar varieert afhankelijk van het celtype 9. Daarom is het aantal cellen te beginnen moet worden geoptimaliseerd en aangepast. Voorgestelde start bereik ligt tussen 5 x 02-01 oktober x 10 4 cellen per putje met behulp van een 6-wells plaat. Bovendien varieert koloniegrootte afhankelijk van de groeisnelheid van elke cel. Daarom wordt een vooraf gedefinieerde een cut-off voor kolonie maat die u nodig individuele kolonies voor downstream kwantitatieve analyses annoteren. Hier kolonies groter dan 70 urn werden gekwantificeerd opname van niet-prolifererende cellen afgeleid van het oorspronkelijke beplating voorkomen.
Voor optimale groei bij de in 3D agarose gels is handig hetzelfde celkweekmedium gewoonlijk gebruikt voor 2D celkweken gebruikt. Dit is omdat het veranderen medium vaak wijzigt de cellen groeisnelheid, dienen daarom additionele passages om de cellen aan te passen aan het nieuwe medium. Bijvoorbeeld, MCF10DCIS cellen optimaal worden gekweekt in RPMI-1640, DMEM of DMEM / F12 medium. Wanneer echter MCF10DCIS kweekmedium wordt veranderd van RPMI-1640 met DMEM / F12, er een aanzienlijke vermindering van celproliferatiesnelheid. Bovendien moet erop worden gelet dat serumconcentraties op een constant niveau omdat zonder serum, wordt kolonievorming geremd 10. Ook nadat de agarose is correct, zodat de fles equilibreren in een 45 ° C waterbad voor het mengen met medium bevattende cellen voorkomen oververhitting van de cellen. Aangezien agarose stolt snel bij kamertemperatuur wordt aanbevolen dat alle pipetten en 6 putjes worden voorverwarmd in een 37 ° C incubator voor agaroseoplossing toegevoegd aan voortijdige stolling te voorkomen tijdens het hanteren.
Terwijl de zachte agar kolonievorming techniek is een waardevol instrument voor het meten van tumorvorming in verschillende kankercellijnen, sommige lijnen niet groeien in zachte agar. Anothaar mogelijk nadeel van de methode is dat levensvatbare cellen niet kunnen worden hersteld zodra ze uitgeplaat in zachte agar. Als bovendien een verbinding een kortere biobeschikbaarheid periode zal de toevoerstap moet vaker (bijv afwisselende dagen) worden uitgevoerd en de monsters moeten worden verzameld in minder dan zeven dagen. De drempel voor de koloniegrootte moet ook worden verminderd terwijl nog waardoor mogelijke verschillen tussen de monsters worden genomen. In deze gevallen zouden controles moeten worden opgenomen experimentele parameters te optimaliseren om vals-positieve en vals-negatieve resultaten te minimaliseren. Bovendien kan deze methode tijdrovend en moeilijk zijn bij het testen van een groot aantal monsters. Echter, technologische vooruitgang geholpen sommige van deze beperkingen te overwinnen. De conventionele zachte agar assay (zoals beschreven in dit manuscript) gebruikt doorgaans 6 putjes of 6 mm kweekschalen. Met geautomatiseerde plaat lezers echter multiple monsters kunnen worden verwerkt in 384 putjes 11. Bijvoorbeeld, onderzoekers vooraf geladen tumorcellen met kleurstoffen zoals AlamarBlue en tetrazolium kleurstoffen en kolonies worden gekwantificeerd met behulp van plaat lezer, waardoor het wegnemen van de noodzaak om de kolonie nummer 11 handmatig tellen. Deze high-throughput capaciteit is derhalve vatbaar voor grootschalige kanker drug schermen.
Kortom, de zachte agar assay is een waardevolle preklinische techniek die kan worden gebruikt om de tumorigeniciteit van een breed scala van kankercellen (borst-, prostaat-, eierstok- en andere) te evalueren met betrekking tot hun gevoeligheid voor geneesmiddelen, hormonen, hitte, hypoxie, en een veelheid van andere behandelingsomstandigheden. De bepaling blijft een eenvoudige en informatieve hulpmiddel voor kanker onderzoekers die de mechanismen van kankerprogressie beter te begrijpen en test de anti-tumor potentieel van nieuwe kankertherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
