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Neuroscience

निकोटीन प्रेरित कैल्शियम संकेतन और उदर Hippocampal Axons साथ neurotransmitter रिहाई के रहते इमेजिंग

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52730

Introduction

सर्किट excitability की कोलीनर्जिक मॉडुलन अनुभूति के बुनियादी पहलुओं के लिए योगदान देता है, और बदल कोलीनर्जिक मॉडुलन अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, मानसिक असंतुलन और नशे की लत 1-4 सहित neurodegenerative और neuropsychiatric विकारों की एक विशेषता है। सीएनएस में synaptic प्रसारण की कोलीनर्जिक सुविधा की स्थापना की एक तंत्र पूर्व synaptic स्थलों पर स्थानीयकृत nAChRs के प्रत्यक्ष सक्रियण के माध्यम से है। परोक्ष रूप से कुछ nAChR उपप्रकार है, और के अपेक्षाकृत उच्च कैल्शियम प्रवाहकत्त्व को सीधे दोनों की वजह से होकर इंट्रासेल्युलर संकेत Cascades - इन पूर्व synaptic रिसेप्टर्स की सक्रियण इंट्रासेल्युलर सीए 2 + ([सीए 2 +] मैं) पूर्व synaptic टर्मिनलों में वृद्धि करने के लिए सुराग 5, जिससे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज बढ़ाने के। वास्तव में, पूर्व synaptic nAChRs की सक्रियता ग्लूटामेट सहित न्यूरोट्रांसमीटर की एक विस्तृत विविधता, गाबा, ACH, की रिहाई में परिवर्तन के साथ जोड़ा गया है एकएन डी डोपामाइन 6-10। इस प्रक्रिया को परोक्ष रूप से विभिन्न synapses पर electrophysiological विधियों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, के ऑप्टिकल संवाददाताओं [सीए 2 +] मैं और synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग पूर्व synaptic घटना की अधिक प्रत्यक्ष और अस्थायी सटीक माप अनुमति देते हैं।

NAChRs की पूर्व synaptic स्थानीयकरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म (ईएम) स्तर 11,12 पर nAChRs के प्रत्यक्ष इम्युनो सोने की लेबलिंग के साथ आसानी से प्रदर्शन किया गया है। कई अन्य तकनीकों का भी सभ्य न्यूरॉन्स 13,14 में nAChRs subunit- फ्लोरोसेंट प्रोटीन काइमेरा के स्थानों का पता लगाने सहित, परोक्ष रूप से nAChR स्थानीयकरण संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अन्तर्ग्रथनी टर्मिनलों 15,16 में nAChR धाराओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग, [में सीए निकोटीन प्रेरित परिवर्तन की निगरानी द्वारा synaptic टर्मिनल पर लाइव सेल इमेजिंग 17, और neurotransmitter रिहाई के अप्रत्यक्ष निगरानी द्वारा अन्तर्ग्रथनी तंत्रिका टर्मिनलों में 2 +] मैंstyryl amphipathic एफएम रंजक (FM1-43 और FM4-64) और / या synapto-pHluorin द्वारा और इस तरह के ग्लूटामेट के लिए ACH और iGluSnFr के लिए CNiFERs के रूप में विशिष्ट फ्लोरोसेंट न्यूरोट्रांसमीटर संवाददाताओं ने देखा synaptic vesicles के एक्सोसाइटोसिस सहित फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ लाइव सेल इमेजिंग तकनीक, 18-20। कुल मिलाकर, nAChRs की पूर्व synaptic स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए इन वर्तमान दृष्टिकोण जटिल कर रहे हैं, और विश्वसनीय पहचान और पूर्व synaptic गतिविधि के शारीरिक निगरानी की अनुमति देने के लिए विशेष व्यवस्था और तकनीक की आवश्यकता है।

की पहचान करने और synaptic प्रसारण के पूर्व और बाद synaptic घटकों दोनों का विश्लेषण करने के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है कि नाभिक accumbens (nAcc) सर्किट - यहाँ हम एक उदर हिप्पोकैम्पस (vHipp) की एक में इन विट्रो सह संस्कृति प्रणाली के लिए प्रोटोकॉल और उपकरणों का वर्णन है। हम पूर्व synaptic nAChRs के स्थानीयकरण और सीए 2 + संकेतन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज alo मध्यस्थता nAChR का जीना सेल इमेजिंग के उदाहरण दिखानेएनजी vHipp एक्सोन। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का एक प्राकृतिक (और सीधा) विस्तार अलग जीनोटाइप से न्यूरॉन्स के शामिल पूर्व और बाद synaptic संपर्कों की तैयारी है। इस तरीके में मॉडुलन के पूर्व और / या बाद synaptic तंत्र के लिए एक विशेष जीन उत्पाद के योगदान को सीधे मूल्यांकन किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों (2012 में संशोधित, एनआईएच प्रकाशन सं 80-23) प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार किए गए और अध्ययन संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा अनुमोदित और पथरीले पर रिसर्च समितियों के लिए प्रयोग किया गया ब्रूक विश्वविद्यालय (# 1618 और # 1792)।

1. vHipp-nAcc अन्तर्ग्रथनी सह संस्कृतियों

  1. बलिदान चूहों (प्रसव के बाद दिन 0 - जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) या α7 nAChRs ट्रांसजेनिक माउस लाइन से 3,) सीओ 2 के साथ। एक पिल्ला सिर काटना और कार्योत्तर जीनोटाइपिंग के लिए एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूंछ बचाने के लिए। एक निष्फल हुड में निम्न चरणों का प्रदर्शन।
  2. पूरे मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए कैंची और संदंश के साथ खोपड़ी के शीर्ष निकालें। एक दूसरे को दुमदारी से मस्तिष्क cortices हिस्सा है, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत vHipp 5,21 सहित पीछे cortices में शामिल है कि एक राज्याभिषेक अनुभाग प्राप्त जहां मोड़ पर शुरू।
  3. वी काटनाएक विकासशील माउस ब्रेन एटलस 22 (चित्रा 1 ए) के अनुसार सीए 1-subiculum क्षेत्र से बाहर युक्त Hipp ऊतक स्ट्रिप्स। ठंड संस्कृति मीडिया (4 डिग्री सेल्सियस) से युक्त एक 35 मिमी संस्कृति डिश के लिए स्थानांतरण, छोटे पतले स्लाइस (माइक्रोन करीब 100 × 100 माइक्रोन microslices) में कटौती।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम 30 मिनट के लिए संस्कृति मीडिया (~ 500 μl) के साथ 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों के अंदर 12 मिमी पाली डी lysine / laminin लेपित गिलास coverslips पूर्व सेते हैं। Microslices चढ़ाना पहले मीडिया निकालें।
  5. (Microslices की ~ 20 टुकड़ों से युक्त ~ 50 μl) मीडिया की न्यूनतम राशि के साथ coverslip के केंद्र में एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ प्लेट explants की कुर्की की सुविधा के लिए। एक भी जानवर से होने वाले प्लेट vHipp microslices (या तो / + + या - / - ट्रांसजेनिक α7 लाइन के जीनोटाइप) प्रत्येक coverslip पर।
  6. Explants coverslip पर बसने के बाद, धीरे वें द्वारा अतिरिक्त मीडिया (~ 100 μl) जोड़नेई दीवार इतनी है कि मीडिया के स्तर पर नहीं बल्कि उन coverslip के केंद्र में है, पूरी तरह परिधि पर explants कवर करने के लिए काफी अधिक है।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस में एक हे / एन ऊष्मायन के बाद, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर, प्रसव के बाद 1 दिन WT चूहों को भ्रूण दिन 18 से nAcc न्यूरॉन्स को फैलाने और explants में जोड़ें।
    1. एक विकासशील माउस ब्रेन एटलस 20 (चित्रा 1 बी) के अनुसार nAcc ऊतकों काटना।
    2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और हस्तांतरण (500 500 माइक्रोन microslices × माइक्रोन के आसपास) छोटे टुकड़ों में काट।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन (2 एमएल) के साथ समझो। धो ऊतक हिस्सा ठंड धोने मीडिया के साथ तीन बार (5 मिलीलीटर, 4 डिग्री सेल्सियस) ठंड संस्कृति मीडिया में एक धोने के बाद (5 मिलीलीटर, 4 डिग्री सेल्सियस)। निलंबन प्रत्येक धोने चरण में 5 मिनट के लिए आराम करने के लिए, और फिर ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद डालना करने की अनुमति दें।
    4. एक हल्के ढंग से आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोमल विचूर्णन द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना।
    5. ट्रांस5 मिनट के लिए 2,000 एक्स rpm पर एक और 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र fer सेल निलंबन। सतह पर तैरनेवाला निकालें और 6 पिल्ले प्रति 1 मिलीलीटर में संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं resuspend। धीरे एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ मीडिया में कई बार pipetting द्वारा कोशिकाओं को फैलाने।
    6. VHipp explants के साथ प्रत्येक coverslip को तितर-बितर nAcc कोशिकाओं के 0.25 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस में संस्कृतियों को बनाए रखने, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर। यंत्रवत् synapse गठन की सुविधा को स्थिर करने और नमी बनाए रखने के लिए घटा बाँझ धुंध पैड पर संस्कृति प्लेटों रखें।

2. Immunocytochemistry

  1. संस्कृतियों फिक्स - 4% paraformaldehyde / 4% sucrose में (5 इन विट्रो में 7 दिन) / पीबीएस (~ coverslip प्रति 500 μl, 20 मिनट, आर टी)।
  2. 0.25% ट्राइटन X-100 / पीबीएस के साथ Permeabilize संस्कृतियों (~ coverslip प्रति 500 ​​μl, 5 मिनट, आर टी)।
  3. पीबीएस में 10% सामान्य गधा सीरम के साथ ब्लॉक संस्कृतियों (~ coverslip प्रति 500 ​​μl, 30 मिनट, आर टी) antibod करने से पहलेY धुंधला हो जाना। 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। , विरोधी vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (1: 250), विरोधी GAD65 (1: 100):;: विरोधी nAChRs (एंटी-α 5 सब यूनिटों, 1 500 500 α 4 -ECD 1:) निम्न प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  4. (Coverslip प्रति 3 बार / ~ 500 μl, 5 मिनट) पीबीएस के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी बाहर धोने और उसके बाद (~ coverslip प्रति 500 ​​μl, 1: 500) एलेक्सा 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी में संस्कृतियों सेते हैं या coverslip प्रति एलेक्सा 594 (~ 500 μl , 1: 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 500)।
  5. पूर्व लेबलिंग सतह α7 * nAChRs के लिए निर्धारण करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए: (संस्कृति मीडिया में 1000 ~ coverslip प्रति 500 ​​μl, 1) एलेक्सा 594 संयुग्मित αBgTx में संस्कृतियों सेते हैं।
  6. माउंट और सील coverslips।
  7. योजना Apochromat उद्देश्यों (0.8 एनए या 1.4 एनए के साथ 63X तेल के साथ 20X) के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और एक सीसीडी कैमरा के साथ छवियों पर कब्जा।

3. FM1-43 आधार Vesicular फ्यूजन

  1. , एक इमेजिंग चैम्बर में - (इन विट्रो में 7 दिन 5) डिस्क confocal खुर्दबीन कताई पर चैम्बर माउंट संस्कृतियों को बनाए रखने। लगातार आरटी पर जोड़ने कॉकटेल के साथ (1 मिलीग्राम / मिनट) छिड़कना।
  2. 90 सेकंड के लिए 56 मिमी + K ACSF (~ 500 μl) (धुंधला) में 10 माइक्रोन FM1-43 के साथ छिड़काव और लोड संस्कृतियों बंद करो, सीए 2 + ADVASEP-7 (0.1 मिमी) युक्त मुक्त HBS के साथ 15 मिनट के लिए दूर बाहरी डाई धोने झिल्ली ही सीमित FM1-43 मांजना।
  3. 120 सेकंड के लिए FM1-43 के बिना 56 मिमी + K ACSF (~ 500 μl) (destaining) के साथ संस्कृतियों को उत्तेजित एक ही शर्तों का उपयोग FM1-43 साथ संस्कृतियों को फिर से लोड, और क्षमताओं के साथ फिर से युक्त 2 + मुक्त जोड़ने धोने ADVASEP-7 के लिए 15 मिनट।
  4. एक सीसीडी कैमरा के साथ एक योजना Apochromat उद्देश्य (1.4 एनए के साथ 60X पानी, उत्तेजना 488 एनएम, उत्सर्जन 530 एनएम) और कब्जा छवियों के साथ सुसज्जित कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ FM1-43 प्रतिदीप्ति छवियों मोल।
  5. 1 मिनट के लिए आधारभूत FM1-43 प्रतिदीप्ति छवियों (हर 2 एस लीजिए) पूर्व निकोटीन नियंत्रण के रूप में; 1 मिनट के लिए तेजी से छिड़काव (2 मिलीग्राम / मिनट) द्वारा निकोटीन (1 माइक्रोन) लागू होते हैं, और फिर बाहर जोड़ने कॉकटेल के साथ निकोटीन धो लें। 5 मिनट के लिए हर 2 सेकंड के दौरान, और निकोटीन आवेदन के बाद, पहले कब्जा समय चूक छवियों रखें।
  6. पहले FM1-43 प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ धुंधला) और बाद में (एफ destaining) प्रत्येक अन्तर्ग्रथनी bouton पर निकोटीन आवेदन यों।
  7. पहले और निकोटीन आवेदन (ΔF = एफ धुंधला एफ destaining) के बाद FM1-43 प्रतिदीप्ति तीव्रता का अंतर बढ़ाता द्वारा vHipp एक्सोन साथ Releasable FM1-43 प्रतिदीप्ति की कुल राशि की गणना। निम्नलिखित समीकरण के साथ निकोटीन के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी के अंश का विश्लेषण करें: एफ कमी% = ΔF / एफ धुंधला हो जाना।

4. कैल्शियम इमेजिंग

  1. तो (5 माइक्रोन Fluo-4 सीए 2 + सूचक के साथ संस्कृतियों लोड, सामान्य जोड़ने के साथ जल्दी - (इन विट्रो में 7 दिन 5) संस्कृतियों कुल्लापूर्वाह्न एस्टर) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए जोड़ने में 0.02% Pluronic एफ-127 (2 मिलीलीटर)।
  2. (3 बार / 5 मिनट) जोड़ने के साथ Fluo-4 समाधान बाहर धो लें। (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2) में कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर संस्कृतियों लौटें।
  3. एक ही इमेजिंग कक्ष और FM1-43 आधारित vesicular संलयन खंड में वर्णित के रूप में एक ही स्थिति में संस्कृतियों को बनाए रखने (3.1 कदम देखें)।
  4. एक योजना Apochromat उद्देश्य (1.4 एनए के साथ 60X पानी, उत्तेजना 488 एनएम, उत्सर्जन 530 एनएम) और एक सीसीडी कैमरा के साथ vHipp सूक्ष्म स्लाइस से axonal अनुमानों के Fluo-4 प्रतिदीप्ति छवियों लीजिए।
  5. 1 मिनट के लिए तेजी से छिड़काव (2 मिलीग्राम / मिनट) द्वारा निकोटीन (1 माइक्रोन) को लागू करने, पूर्व निकोटीन नियंत्रण के रूप में आधारभूत Fluo-4 प्रतिदीप्ति छवियों (2 मिनट के लिए हर 10 सेकंड) ले लीजिए, और फिर बाहर जोड़ने कॉकटेल के साथ निकोटीन धो लें। 30 मिनट के लिए हर 10 सेकंड के दौरान, और निकोटीन आवेदन के बाद, पहले कब्जा समय चूक छवियों रखें।
  6. की एक श्रृंखला के रूप में कच्चे Fluo-4 प्रतिदीप्ति छवियों, निर्यात के सभी तख्ते को बचानेआगे विश्लेषण के लिए झगड़ा प्रारूप छवियों।
  7. पहले vHipp एक्सोन साथ और निकोटीन आवेदन के बाद Fluo-4 प्रतिदीप्ति की एकीकृत तीव्रता लीजिए।
  8. निम्नलिखित समीकरण के साथ एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता मानक के अनुसार: ΔF / एफ 0 = (एफएफ 0) / एफ 0 पृष्ठभूमि को सही पूर्व निकोटीन एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता है और F हर समय बिंदु पर vHipp एक्सोन साथ एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता है, जहां एफ 0, निकोटीन आवेदन के बाद। विश्लेषण और सामान्यीकृत एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता साजिश है।

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Representative Results

नियोजित तैयारी के लिए इन विट्रो में vHipp-nAcc सर्किट के जीन काइमेरिक सह संस्कृतियों के होते हैं। VHipp microslices से निकलती अनुमानों, पूर्व synaptic axonal निवेश के रूप में, बाद synaptic लक्ष्य, nAcc से छितरी न्यूरॉन्स के साथ synaptic संपर्क कर सकते हैं। VHipp द्वारा innervated nAcc न्यूरॉन्स से glutamatergic संचरण का एक निरंतर (≥ 30 मिनट) सरलीकरण प्रेरित निकोटीन पूर्व synaptic α7 * nAChRs के माध्यम से vHipp एक्सोन 5 के साथ संकेत 21 और लंबे समय तक कैल्शियम axons।

चित्रा 1 vHipp सूक्ष्म स्लाइस से अनुमानों (vGluT1 सकारात्मक) glutamatergic हैं और वह सीधे दर्शाता संपर्कों nAcc से छितरी हुई GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स के साथ बना रहे हैं कि (जीएडी सकारात्मक, चित्रा 1C, डी)। (Α4 और α5 सब यूनिटों सहित) α7 * और गैर α7 दोनों * nAChRs स्थलों पर विशेष रूप से vHipp एक्सोन (चित्रा 1E जी) और साथ में पाए गएजहां vHipp अनुमानों nAcc न्यूरॉन्स से संपर्क करें। यह nAcc से छितरी हुई न्यूरॉन्स α7 * nAChRs (चित्रा 1H) व्यक्त नहीं करते कि ध्यान दिया जाना चाहिए; यानी संपर्कों पर रिसेप्टर समूहों सख्ती से (चित्रा 1 मैं) प्रीसानेप्टिक हैं, भी संदर्भ 5 में चित्रा 1 देखें।

काइमेरिक सह संस्कृतियों स्थापित किया गया है एक बार, के रहते इमेजिंग [सीए 2 +] मैं और synaptic साथ और / या निकोटीन न्यूरॉन्स के लिए कोई स्पष्ट क्षति के बिना अप करने के लिए 30 मिनट के लिए दर्ज किया जा सकता बिना vHipp एक्सोन साथ फ्यूजन vesicles।

छवियों प्रतिनिधि, निकोटीन प्रेरित Fluo-4 [सीए 2 +] मैं vHipp एक्सोन साथ संकेतन के लिए समय चूक फिल्मों और quantifications चित्रा 2 और पूरक मूवी 1 और 2 में दिखाया जाता है। हम निकोटीन लाती द्वारा vHipp nAChRs की है कि सक्रियण सीए निरंतर पाया पूर्व synaptic एक्सोन में 2 + तांता (2A चित्रा, डी)। निरंतर चरण[सीए 2 +] मैं vHipp एक्सोन साथ सिगनल में निकोटीन प्रेरित बढ़ जाती है की विशिष्ट α7 * nAChR प्रतिपक्षी αBgTx नहीं, बल्कि गैर-α7 * nAChR प्रतिपक्षी DHβE (2A चित्रा-सी) द्वारा अवरुद्ध किया गया था।

गतिविधि पर निर्भर FM1-43 डाई endocytosis और एक्सोसाइटोसिस के प्रत्यक्ष दृश्य परोक्ष रूप से प्रीसानेप्टिक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 23, 24 की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, FM1-43 द्वारा कल्पना vHipp एक्सोन साथ निकोटीन प्रेरित vesicular संलयन के लिए प्रतिनिधि छवियों और मात्रा का ठहराव चित्रा में दिखाए जाते हैं 3 (चित्रा 3 ए, सी)। पूर्व synaptic α7 की उपस्थिति * nAChRs अधिक से अधिक निकोटीन प्रेरित पुटिका संलयन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज (चित्रा 3 बी, सी) के लिए आवश्यक है।

चित्र 1
NAcc साथ vHipp चित्रा 1. अन्तर्ग्रथनी सह संस्कृति examinatio की अनुमति देता हैnAChRs की पूर्व synaptic स्थानीयकरण के एन। (एसी) उदर हिप्पोकैम्पस / subiculum (ए) के अलग चढ़ाना द्वारा तैयार जीनोटाइप-विशेष में इन विट्रो सर्किट (सी) के योजनाबद्ध कार्टून।   / - - एक व्यक्ति गुम्मट या α7 से स्लाइस गुम्मट नाभिक से माउस और छितरी न्यूरॉन्स (बी) accumbens। आक, जलसेतु (Sylvius), महानिदेशक, दांतेदार गाइरस, मुरली, औसत दर्जे का mammillary नाभिक; PMCo, posteromedial कॉर्टिकल amygdaloid नाभिक, आरएफ, rhinal विदर, एफएमआई, महासंयोजिका की नाबालिग संदंश, एल.वी., पार्श्व वेंट्रिकल; तू, घ्राण tubercle, वी.पी. , उदर पैलिडम। (डी) vHipp microslices GAD65 सकारात्मक (हरा) से संपर्क करें कि vGluT1 सकारात्मक (लाल) axonal अनुमानों nAcc न्यूरॉन्स (सफेद तीर उन संपर्क साइटों के उदाहरण हैं) का विस्तार। स्केल बार: 10 माइक्रोन (ई।जी)), हरी vGluT1 साथ गुम्मट vHipp axons की प्रतिनिधि micrographs (धुंधला α4 के लिए दिखाए जाते हैं * nAChR (ई), α5 * nAChR (एफ) और सतह α7 * लाल समूहों (सफेद तीर) में nAChR (जी) धुंधला हो जाना। स्केल बार:।। 5 माइक्रोन (एच) कोई सतह α7 अकेले nAcc से छितरी GABAergic न्यूरॉन्स पर * nAChR समूहों (GAD65 सकारात्मक) कर रहे हैं सतह α7 * nAChR (सफेद तीर) (i) लाल "समूहों" उन लोगों में देखा जा सकता है छितरी न्यूरॉन्स सह सुसंस्कृत vHipp microslices साथ। स्केल बार:। 5 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
NAcc साथ vHipp चित्रा 2. अन्तर्ग्रथनी सह संस्कृति निकोटीन प्रेरित कैल्शियम संकेत की परीक्षा के लिए अनुमति देता हैvHipp एक्सोन साथ आईएनजी। कैल्शियम की (ए) प्रतिनिधि Fluo-4 छवियों को एक गुम्मट vHipp अक्षतंतु से पहले (ऊपर), 1 साथ Fluo-4 छद्म रंग पैमाने में ही '(मध्य), और 30' निकोटीन आवेदन के बाद (नीचे)। निकोटीन प्रेरित सीए 2 + प्रतिक्रिया के निरंतर चरण (30 ') α7 के अलावा द्वारा सफाया कर दिया है * nAChR चयनात्मक प्रतिपक्षी αBgTx (100 एनएम) (बी) नहीं, बल्कि गैर-α7 * nAChR चयनात्मक प्रतिपक्षी DHβE के अलावा द्वारा (1 माइक्रोन) (सी)। स्केल बार: 5 माइक्रोन 1 मिनट के लिए निकोटीन (1 माइक्रोन) के साथ perfused एक लाइव गुम्मट vHipp अक्षतंतु से सामान्यीकृत Fluo-4 एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता (डी) प्रतिनिधि साजिश है।। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
NAcc साथ vHipp चित्रा 3. अन्तर्ग्रथनी सह संस्कृति vHipp एक्सोन साथ (FM1-43) के साथ निकोटीन प्रेरित vesicular neurotransmitter रिहाई की परीक्षा की अनुमति देता है। (ए) से पहले (ऊपर) और (नीचे) निकोटीन आवेदन के बाद (FM1-43, हरे रंग के साथ भरी हुई) गुम्मट vHipp axons की प्रतिनिधि छवियाँ। (बी) FM1-43 के साथ भरी हुई गुम्मट vHipp axons की छवियों प्रतिनिधि (α7 साथ pretreated * (ऊपर) और बाद (नीचे) निकोटीन आवेदन से पहले nAChR चयनात्मक प्रतिपक्षी 15 मिनट के लिए αBgTx)। स्केल बार:।। 5 माइक्रोन (सी) निकोटीन अभाव में उपचार (डब्ल्यूटी) या α7 की * nAChR प्रतिपक्षी उपस्थिति (डब्ल्यूटी + αBgTx) निम्न axonal FM1-43 प्रतिदीप्ति (एफ कमी) में परिवर्तन की मात्रा का ठहराव से पता चलता है कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

1 हटो
पूरक मूवी 1: vHipp एक्सोन साथ बेसल Fluo-4 / सीए 2 + प्रतिदीप्ति के समय चूक रहते इमेजिंग।

vHipp एक्सोन साथ Fluo-4 / सीए 2 + प्रतिदीप्ति के समय चूक छवियों को एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 30 मिनट के लिए एक 60x उद्देश्य पानी लेंस के साथ हर 10 सेकंड का अधिग्रहण किया गया था। अधिग्रहीत छवियों छद्म रंग पैमाने पर संकेत और एस प्रति 2 तख्ते पर एक फिल्म के रूप में वापस खेला गया। इस फिल्म के साथ जोड़ने कॉकटेल के साथ perfused गुम्मट vHipp अक्षतंतु रहते Fluo-4 / सीए 2 + प्रतिदीप्ति गतिविधि के आधार रेखा से पता चलता है।

मूवी 2
पूरक मूवी 2: प्रेरित निकोटीन के समय चूक रहते इमेजिंग Fluo-4 / सीए निरंतर 2 + vHipp एक्सोन साथ प्रतिदीप्ति> ऊपर।

vHipp एक्सोन साथ Fluo-4 / सीए 2 + प्रतिदीप्ति के समय चूक छवियों को एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 30 मिनट के लिए एक 60x उद्देश्य पानी लेंस के साथ हर 10 सेकंड का अधिग्रहण किया गया था। अधिग्रहीत छवियों छद्म रंग पैमाने पर संकेत दिया है और प्रति सेकंड 2 तख्ते पर एक फिल्म के रूप में वापस खेला गया। इस फिल्म निकोटीन से पता चलता है (समय बिंदु 43 से कम में perfused 1 माइक्रोन, समय बिंदु 49 पर जोड़ने कॉकटेल के साथ बाहर धोया) के साथ गुम्मट vHipp अक्षतंतु रहते Fluo-4 / सीए 2 + प्रतिदीप्ति गतिविधि प्रेरित किया। निकोटीन आवेदन vHipp एक्सोन साथ Fluo-4 / सीए 2 + प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई।

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Discussion

सह संस्कृति तैयारी वर्णित फिर से capitulates इन विट्रो में उदर हिप्पोकैम्पस accumbens सर्किट। पूर्व synaptic nAChRs की सक्रियता glutamatergic संचरण 5, 21 बढ़ाया प्रकाश में लाना है जिसके द्वारा स्थानिक और लौकिक प्रोफाइल के इस तैयारी परमिट अपेक्षाकृत सरल और विश्वसनीय परीक्षा।

सह संस्कृतियों में विवो की तरह समारोह प्रदर्शित करने के लिए इन विट्रो में शारीरिक स्थितियों प्रदान कर सकते हैं, जो एक डिश में विभिन्न विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के विकास के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। परम्परागत न्यूरॉन न्यूरॉन सह संस्कृतियों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच अन्तर्ग्रथनी बातचीत के अध्ययन के लिए तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए पेश किया गया है। हालांकि, यह पूर्व और इन सह संस्कृतियों में synapses के बाद की साइटों की पहचान करना मुश्किल है। इस microslice-अलग न्यूरॉन सह संस्कृति प्रोटोकॉल पूर्व synaptic axons और बाद synaptic लक्ष्यों की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है। अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से उपयोग करते हुए microslices ओविभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त च ट्रांसजेनिक माउस लाइन, इस प्रोटोकॉल भी अक्षतंतु-अक्षतंतु बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस microslice-अलग न्यूरॉन्स सह संस्कृति प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम explants की कुर्की के लिए अनुमति देने के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान कर रहा है, अनुमानों के परिणाम और synapses के गठन। मीडिया की एक न्यूनतम मात्रा में microslices चढ़ाना और घटा बाँझ धुंध पैड पर संस्कृति प्लेटों को बनाए रखने microslice लगाव और synapse गठन के लिए दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इस सह-संस्कृति प्रोटोकॉल का मुख्य सीमा सभी छितरी नहीं nAcc न्यूरॉन्स vHipp एक्सोन के साथ कार्यात्मक अन्तर्ग्रथन कि फार्म है।

पूर्व और बाद अन्तर्ग्रथनी घटकों के जीनोटाइप में फेरबदल करके, इस तैयारी synaptic plasticity के पूर्व और बाद synaptic तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक जानकारीपूर्ण दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस तैयारी के तीन अलग विशेषताएं इन अध्ययनों के लिए यह आदर्श बनाते हैं। ब्रेन Rसामान्य रूप से बनाए रखा है, या आसानी से तीव्र स्लाइस में नहीं पहचाना जा सकता है कि फाइबर पथ, के माध्यम से विवो में जुड़े हुए हैं कि egions इस में इन विट्रो तैयारी में जोड़ा जा सकता है। पूर्व और बाद अन्तर्ग्रथनी घटकों पूर्व या बाद synaptic जीनोटाइप या तो स्वतंत्र परिवर्तन की अनुमति के विभिन्न चूहों से बनाने के लिए आते हैं। अलग अलग समय पर पूर्व और बाद synaptic घटकों चढ़ाना द्वारा, यह चुनिंदा पूर्व या बाद synaptic न्यूरॉन्स में या तो बहिर्जात जीन व्यक्त करने के लिए संभव है।

निकोटीन सभ्य न्यूरॉन्स, astrocytes में सूचित किया गया है nAChRs की सक्रियता से और nAChRs 25-27 व्यक्त कि कई सेल लाइनों में (मिनट श्रृंखला के लिए सेकंड में) सीए 2 + यात्रियों प्रेरित किया। हालांकि, इन अध्ययनों के सबसे लंबे समय तक प्रभाव लंबे समय तक इमेजिंग के दौरान फोटो क्षति के लिए काफी हद तक कम समय निकोटीन लोगों तक पहुंचाने के लिए (10 से अधिक मिनट) का पता नहीं चला। और तेजी से कताई डिस्क confocal छवि संग्रह ऊपर वर्णित संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग करके,निकोटीन प्रेरित सीए 2 + संकेतन, अन्तर्ग्रथनी पुटिका संलयन और ग्लूटामेट रिहाई न्यूरॉन्स के लिए कोई स्पष्ट क्षति के बिना अप करने के लिए 1 घंटे के लिए दर्ज किया जा सकता (पूरक मूवी 1, 2)।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture Media (50 ml)
Neurobasal  GIBCO 10888022 48 ml
B-27 Supplements GIBCO 0080085-SA 1 ml
Penicillin-Streptomycin GIBCO 10908-010 0.5 ml
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061 0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) GIBCO 15140-122 20 ng/ml
2. washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red  GIBCO 14175-095 99 ml
HEPES ( 1M) GIBCO 15630-130 1 ml
3. HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
tetrodotoxin  Tocris 1078 2 µM
bicuculline Tocris 131 10 µM
D-AP-5 Tocris 105 50 µM
CNQX Tocris 1045 20 µM
LY341495 Tocris 1209 10 µM
5. Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl Sigma S9888 119 mM
KCl Sigma P9333 56 mM
MgSO4.7H Sigma M1880 1.3 mM
CaCl2 Sigma C1016 2.5 mM
NaH2PO4 Sigma S8282 1 mM
NaHCO3 Sigma S5761 26.2 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 100 निकोटीन निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर कैल्शियम इमेजिंग प्रीसानेप्टिक एक्सोन neurotransmitter रिहाई synaptic प्रसारण
निकोटीन प्रेरित कैल्शियम संकेतन और उदर Hippocampal Axons साथ neurotransmitter रिहाई के रहते इमेजिंग
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Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L.More

Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).

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