Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Live avbildning av nikotin inducerad kalciumsignalering och frisättning av signalsubstans Längs Ventral Hippocampus Axoner

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52730

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cholinergic modulering av kretsen retbarhet bidrar till grundläggande aspekter av kognition, och förändrat kolinerga modulering är en funktion av neurodegenerativa och neuropsykiatriska störningar, inklusive Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, schizofreni och missbruk 1-4. En etablerad mekanism för kolinerga underlättande av synaptisk transmission i CNS är via direkt aktivering av nAChRs lokaliserade vid presynaptiska webbplatser. Aktivering av dessa presynaptiska receptorer leder till ökad intracellulär Ca2 + ([Ca2 +] i) i presynaptiska terminaler - både direkt, på grund av den relativt höga kalcium konduktansen hos vissa nAChR-subtyper, och indirekt, via intracellulära signaleringskaskader 5, och därigenom öka neurotransmittorfrisättning. I själva verket har aktiveringen av presynaptiska nAChRs kopplats till förändringar i frisättning av ett stort antal olika signalsubstanser inklusive glutamat, GABA, ACh, ennd dopamin 6-10. Även om denna process har studerats indirekt med hjälp av elektrofysiologiska metoder vid olika synapser, optiska reportrar i [Ca2 +] i och synaptiska vesikler återvinning möjliggöra mer direkt och tidsmässigt exakt mätning av presynaptiska företeelser.

Pre-synaptiska lokalisering av nAChRs har visats på ett övertygande sätt med direkt immun guld märkning av nAChRs på elektronmikroskopiska (EM) nivå 11,12. Flera andra tekniker har också använts för att behandla nAChR lokalisering indirekt, inklusive detektering placeringarna av nAChRs subunit- fluorescerande proteinchimärer i odlade neuroner 13,14, elektrofysiologiska inspelning av nAChR-strömmar i synaptiska ändarna 15,16, övervakning nikotin inducerade förändringar i [Ca 2 +] i i synaptiska nervterminaler efter levande cell imaging 17, och indirekt kontroll av neurotransmittorfrisättning vid synaptiska terminalen genomlevande cell avbildningstekniker med fluorescerande indikatorer, däribland exocytos av synaptiska vesiklar ses av styrylfärgämnen amfipatiska FM färgämnen (FM1-43 och FM4-64) och / eller synapto-pHluorin och specifika fluorescerande signalsubstans reportrar, såsom CNiFERs för ACh och iGluSnFr för glutamat 18-20. Sammantaget dessa aktuella metoder för att identifiera presynaptisk lokalisering av nAChRs är komplicerade och kräver särskilda system och tekniker för att möjliggöra säker identifiering och fysiologisk övervakning av presynaptisk aktivitet.

Här beskriver vi protokoll och utrustning för ett in vitro samodlingssystemet av en ventrala hippocampus (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) krets som ger direkt tillgång till kartlägga och analysera både före och postsynaptiska komponenter i synaptisk transmission. Vi visar exempel på presynaptisk lokalisering av nAChRs och levande cell imaging av nAChR medierad Ca2 + signalering och neurotransmittorfrisättning along vHipp axoner. En naturlig (och enkelt) förlängning av protokollet presenteras här är framställningen av före och efter synaptiska kontakter som består av nervceller från olika genotyper. På detta sätt kan bedömas bidraget av en viss gen produkt till för- och / eller postsynaptiska mekanismer moduleringen direkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur (NIH publikationerna nr 80-23, reviderad 2012) och undersökningar har godkänts av Institutional Animal Care och användning för forskning kommittéer vid Stony Brook University (# 1618 och # 1792).

1. vHipp-NACC Synaptic Samkulturer

  1. Sacrifice möss (postnatal dag 0 - 3 från vildtypen (WT) eller α7 nAChRs transgen mus linje) med CO2. Halshugga varje valp och spara svansen i en 1,5 ml centrifugrör för i efterhand genotypning. Utför följande steg i en steriliserad huva.
  2. Avlägsna toppen av skallen med sax och pincett för att exponera hela hjärnan. Börjar vid övergången där hjärnbarken del från varandra caudally, få en koronalt avsnitt som innehåller bakre cortex inklusive vHipp 5,21 under ett dissektionsmikroskop.
  3. Dissekera vHipp vävnadsremsor innehållande CA1-subiculum region i enlighet med ett utvecklings mushjärna atlas 22 (Figur 1A). Överföring till en 35 mm odlingsskål innehållande kallt odlingsmedium (4 ° C), skuren i små tunna skivor (cirka 100 pm x 100 pm microslices).
  4. Pre-inkubera 12 mm poly-D-lysin / laminin-belagda täckglas av glas inuti 24 brunnars vävnadskulturplattor med odlingsmedia (~ 500 | al) under minst 30 min i inkubatorn vid 37 ° C. Ta bort media innan plätering microslices.
  5. Platta med en brand-polerad pasteurpipett i mitten av täckglas med minimal mängd av media (~ 50 | il, innehållande ~ 20 stycken microslices) för att underlätta fastsättning av explantaten. Plate vHipp microslices härrör från ett enda djur (antingen + / + eller - / - genotyp av den transgena α7 linjen) på varje täck.
  6. Efter explantaten lösa på täck försiktigt lägga till ytterligare media (~ 100 l) av the väggen så att nivån av media är tillräckligt hög för att helt täcka explantaten i periferin, men inte de i mitten av täckglaset.
  7. Efter en O / N inkubation i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator, sprida NACC neuroner från embryonala dag 18 till postnatal dag 1 WT möss och lägg till explantaten.
    1. Dissekera ut NACC vävnader enligt ett utvecklings mushjärna atlas 20 (Figur 1B).
    2. Skär i små bitar (ca 500 pm x 500 pm microslices) och överför till en 15 ml rör.
    3. Behandla med 0,25% trypsin (2 ml) under 15 min vid 37 ° C. Tvätta vävnads bitar tre gånger med kall tvättmedia (5 ml, 4 ° C) följt av en tvätt i kallt odlingsmedium (5 ml, 4 ° C). Låt suspensionen till vila i 5 minuter i varje tvättsteg, och häll sedan bort supernatanten försiktigt.
    4. Dissociera cellerna under lätt triturering i 2 ml odlingsmedium med en lätt brand-polerad pasteurpipett.
    5. Tränsfer cellsuspension till en annan 15 ml rör och centrifugera vid 2000 x rpm under 5 minuter. Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna i odlingsmedium vid 1 ml per 6 valpar. Disperse celler genom att försiktigt pipettera i media flera gånger med en brand-polerat pasteurpipett.
    6. Lägg 0,25 ml spridda NACC celler till varje täck med vHipp explants.
    7. Bibehålla kulturerna i en fuktig 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Placera odlingsplattor på dämpade steril gasbinda kuddar för att mekaniskt stabilisera och upprätthålla luftfuktighet, vilket underlättar synaps bildning.

2. Immuncytokemi

  1. Fix kulturer (5-7 dagar in vitro) i 4% paraformaldehyd / 4% sackaros / PBS (~ 500 l per täck, 20 min, RT).
  2. Permeabilize kulturer med 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 | al per täckglas, 5 min, RT).
  3. Block kulturer med 10% normalt åsna serum i PBS (~ 500 mikroliter per täck, 30 min, RT) före Antibody-färgning. Inkubera med primära antikroppar O / N vid 4 ° C. Använd följande primära antikroppar: anti-nAChR (α 4 -ECD 1: 500, anti-α 5 subenheter, en: 500), anti vesikulär glutamat transportör 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
  4. Tvätta primära antikroppar med PBS (3 gånger / ~ 500 l per täck, 5 min) och sedan inkubera kulturer i sekundära antikroppar konjugerade med Alexa 488 (~ 500 l per täck, 1: 500) eller Alexa 594 (~ 500 mikroliter per täck , 1: 500) under 1 h vid 37 ° C.
  5. Inkubera kulturer i αBgTx konjugerade till Alexa 594 (~ 500 | al per täckglas, 1: 1000 i odlingsmedier) under 45 minuter vid 37 ° C före fixeringen för etikettyta α7 * nAChRs.
  6. Mount och tätningstäck.
  7. Ta bilder med ett fluorescensmikroskop utrustat med Plan-Apochromat mål (20X med 0,8 NA eller 63X olja med 1,4 NA) och en CCD-kamera.

3. FM1-43 Based Vesikulär Fusion

  1. Behåll kulturer (5-7 dagar in vitro) i en avbildning kammare, montera kammaren på spinning disk konfokalmikroskop. Kontinuerligt BEGJUTA (1 ml / min) med HBS cocktail vid RT.
  2. Stoppa perfusion och lastkulturer med 10 iM FM1-43 i 56 mM K + ACSF (~ 500 l) under 90 sekunder (färgning), tvätta extern färgämne bort under 15 minuter med Ca2 + gratis HBS innehållande ADVASEP-7 (0,1 mm) att eliminera membranbundet FM1-43.
  3. Stimulera kulturerna med 56 mM K + ACSF (~ 500 l) utan FM1-43 för 120 sek (avfärgning), ladda kulturer med FM1-43 användning av samma betingelser, och tvätta igen med Ca2 + gratis HBS innehållande ADVASEP-7 för 15 min.
  4. Förvärva FM1-43 fluorescens bilder med snurrande skiva konfokalmikroskop utrustad med en plan-Apochromat mål (60X vatten med 1,4 NA, excitation 488 nm, emission 530 nm) och ta bilder med en CCD-kamera.
  5. Samla baslinjen FM1-43 fluorescens bilder (var 2 s under 1 minut) Som pre-nikotin kontroll; tillämpa nikotin (1 pM) genom snabb perfusion (2 ml / min) under 1 min och sedan tvätta nikotin ut med HBS cocktail. Håll fånga tidsförlopp bilder före, under och efter nikotin ansökan varje 2 sek under 5 minuter.
  6. Kvantifiera FM1-43 fluorescensintensiteten före (F färgning) och efter (F avfärgning) nikotin ansökan vid varje synaptiska Bouton.
  7. Beräkna totala mängden lösgör FM1-43 fluorescens längs vHipp axoner genom att kvantifiera skillnaden i FM1-43 fluorescensintensiteten före och efter nikotin ansökan (AF = F färgning -F avfärgning). Analysera bråkdel av fluorescensintensitet minskning efter nikotin med följande ekvation: F minskning% = AF / F färgning.

4. Kalcium Imaging

  1. Skölj kulturer (5-7 dagar in vitro) snabbt med normal HBS, sedan ladda kulturer med 5 iM Fluo-4 Ca 2 + indikator (AM-ester) och 0,02% Pluronic F-127 i HBS (2 ml) under 30 min vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. Skölj Fluo-4-lösning med HBS (3 gånger / 5 min). Återgå kulturer till inkubator (37 ° C / 5% CO2) under minst 30 minuter.
  3. Bibehålla kulturer i samma avbildning kammaren och samma betingelser som beskrivits i FM1-43 baserat vesikulär fusionssektion (se steg 3.1).
  4. Samla Fluo-4 fluorescensbilder av axonal prognoser från vHipp mikro skivor med en plan-Apochromat mål (60X vatten med 1,4 NA, excitation 488 nm, emission 530 nm) och en CCD-kamera.
  5. Samla baslinje Fluo-4 fluorescensbilder (varje 10 sek under 2 min) som pre-nikotin kontroll, applicera nikotin (1 pM) genom snabb perfusion (2 ml / min) under 1 min och sedan tvätta nikotin ut med HBS cocktail. Håll fånga tidsförlopp bilder före, under och efter nikotin ansökan var 10 sekund under 30 minuter.
  6. Spara alla ramar av rå fluo-4 fluorescensbilder, export som en serieTIFF-format bilder för vidare analys.
  7. Samla den integrerade intensiteten av fluo-4 fluorescens längs vHipp axoner före och efter nikotin ansökan.
  8. Normalisera integrerade fluorescensintensiteten med den följande ekvationen: AF / F 0 = (FF 0) / F 0, där F 0 är bakgrundskorrigerade före nikotin integrerade fluorescensintensiteten och F är den integrerade fluorescensintensiteten längs vHipp axoner vid varje tidpunkt efter nikotin ansökan. Analysera och rita normaliserade integrerade fluorescensintensiteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beredningen användes består av gen chimär samkulturer av vHipp-NACC kretsar in vitro. Prognoser som härrör från vHipp microslices, som presynaptisk axonal ingång, kan göra synaptiska kontakter med postsynaptiska mål, de spridda neuroner från NACC. Nikotin framkallade en ihållande (≥ 30 min) underlättande av glutamaterg överföring från NACC nervceller innerverade av vHipp axoner 21 och långvarig kalcium signalering längs vHipp axoner 5 via presynaptisk α7 * nAChRs.

Figur 1 visar direkt att prognoserna från vHipp mikro skivor är glutamaterga (vGluT1 positiv) och att kontakter knyts med spridda GABAergic medel taggiga neuroner från NACC (GAD positiv, Figur 1C, D). Både α7 * och icke-α7 * nAChRs (inklusive α4 och α5 subenheter) konstaterades längs vHipp axoner (Figur 1E-G) och i synnerhet på platserdär vHipp utsprång kontakta NACC neuroner. Det bör noteras att dispergerade neuroner från NACC inte uttrycker α7 * nAChRs (Figur 1H); dvs. receptor kluster vid kontakter är strikt presynaptisk (figur 1I), se även figur 1 i referens 5.

När chimära samkulturer har fastställts, levande avbildning av [Ca2 +] i och synaptic blåsor fusion längs vHipp axoner med och / eller utan nikotin kan registreras i upp till 30 minuter utan någon synbar skada på nervceller.

Bilderna, tidsförlopp filmer och kvantifieringar för nikotin-inducerad fluo-4 [Ca2 +] i signalering längs vHipp axoner visas i figur 2 och kompletterande film 1 och 2. Vi fann att aktivering av vHipp nAChRs av nikotin inducerar ihållande Ca 2+ tillströmning till presynaptiska axoner (figur 2A, D). Den ihållande fasav nikotin inducerade ökningar i [Ca2 +] i signalering längs vHipp axoner blockerades av den specifika α7 * nAChR antagonisten αBgTx men inte av den icke-α7 * nAChR antagonisten DHβE (Figur 2A-C).

Direkt visualisering av aktivitetsberoende FM1-43 färgämne endocytos och exocytos har använts för att övervaka indirekt presynaptiska frisättningen av neurotransmittorer 23, 24. Här är representativa bilder och kvantifiering för nikotin-inducerad vesikulär sammansmältning längs vHipp axoner visualiserade genom FM1-43 visas i fig 3 (fig 3A, C). Närvaron av presynaptisk α7 * nAChR krävs för maximal nikotin inducerade vesikelfusion och neurotransmittorfrisättning (figur 3B, C).

Figur 1
Figur 1. Synaptic co-kultur vHipp med NACC tillåter examination presynaptisk lokalisering av nAChRs. (AC) Schematisk tecknad film av genotyp-specifika in vitro kretsar (C) framställda genom separat plätering av ventrala hippocampus / subiculum (A).   skivor från en enskild WT eller α7 - / - mus och spridda neuroner från WT nucleus accumbens (B). Aq, akvedukt (Sylvius), GD, dentate gyrus, MM, medial mammillary kärna, PMCo, posteromedial kortikala amygdaloid kärna, rf, rhinal spricka, FMI, pincett mindre av corpus callosum, LV, laterala ventrikeln, Tu, lukt knöl, VP , ventrala pallidum. (D) vHipp microslices sträcker vGluT1 positiva (röda) axonal prognoser som kommer i kontakt GAD65 positiva (grön) NACC neuroner (vita pilar är exempel på dessa kontaktplatser). Skala bar: 10 m (E.-G) Representativa mikrofotografier av WT vHipp axoner (färgning med vGluT1, grön) visas för α4 * nAChR (E), α5 * nAChR (F) och ytan α7 * nAChR (G) färgning i röda kluster (vita pilar). Skala bar:.. 5 pm (H) Det finns ingen yta α7 * nAChR kluster på spridda GABAerga neuroner (GAD65 positiv) från NACC ensam (I) Red "kluster" av ytan α7 * nAChR (vita pilar) kan ses i de dispergerade neuroner samodlas med vHipp microslices. Skala bar:. 5 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Synaptic co-kultur vHipp med NACC tillåter granskning av nikotin inducerade kalciumsignaling längs vHipp axoner. (A) Representativa fluo-4 bilder av kalcium bundna fluo-4 i pseudofärgskala längs en ​​WT vHipp axonet innan (Top), 1 '(USA), och 30 "(Bottom) efter nikotin ansökan. Den ihållande fas (30 ') hos nikotin-framkallade Ca2 + respons elimineras genom tillsats av α7 * nAChR-selektiv antagonist αBgTx (100 nM) (B), men inte genom tillsatsen av den icke-α7 * nAChR selektiv antagonist DHβE (1 pM) (C). Skala bar: 5 m (D) representant tomt på normaliserade fluo-4 integrerade fluorescensintensiteten från en levande WT vHipp Axon perfusion med nikotin (1 M) under 1 minut.. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Synaptic co-kultur vHipp med NACC tillåter granskning av nikotin inducerade vesikulär neurotransmittorfrisättning (med FM1-43) längs vHipp axoner. (A) Representativa bilder av WT vHipp axoner (laddade med FM1-43, grön) före (överst) och efter (nederst) nikotin ansökan. (B) Representativa bilder av WT vHipp axoner (laddade med FM1-43, förbehandlade med α7 * nAChR selektiv antagonist αBgTx under 15 min) före (överst) och efter (nederst) nikotin ansökan. Skala bar:. 5 m (C) visar kvantifiering av förändringar i axonal FM1-43 fluorescens (F minskning) efter nikotin behandling i frånvaro (WT) eller närvaro (WT + αBgTx) av α7 * nAChR antagonist. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Flytta 1
Kompletterande Movie 1: Time-lapse Live avbildning av basal Fluo-4 / Ca2 + fluorescens längs vHipp axoner.

De tidsförlopp bilder av Fluo-4 / Ca2 + fluorescens längs vHipp axoner förvärvades med en 60x objektiv vatten lins var 10 sekund under 30 minuter med en roterande skiva konfokalmikroskop. Förvärvade bilderna anges på pseudofärgskala och spelas upp som en film på 2 bilder per s. Denna film visar baslinjen Fluo-4 / Ca2 + fluorescens aktivitet längs bor WT vHipp Axon perfusion med HBS cocktail.

Film 2
Kompletterande Movie 2: Time-lapse Live avbildning av nikotin induceras ihållande Fluo-4 / Ca2 + fluorescens längs vHipp axoner.

De tidsförlopp bilder av Fluo-4 / Ca2 + fluorescens längs vHipp axoner förvärvades med en 60x objektiv vatten lins var 10 sekund under 30 minuter med en roterande skiva konfokalmikroskop. Förvärvade bilderna anges på pseudofärgskala och spelas upp som en film på 2 bildrutor per sekund. Denna film visar nikotin (1 iM, perfusion i vid tidpunkten 43, tvättades med HBS cocktail vid tidpunkten 49) inducerade Fluo-4 / Ca2 + fluorescens aktivitet längs bor WT vHipp axonet. Nikotin ansökan ökade fluo-4 / Ca2 + fluorescensintensitet längs vHipp axoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det co-kultur preparat som beskrivs åter kapitulerar ventrala hippocampus-accumbens kretsar in vitro. Detta möjliggör en relativt enkel och tillförlitlig undersökning av rumsliga och tidsmässiga profiler genom vilka aktivering av presynaptiska nAChRs framkalla förbättrade glutamaterg transmission 5, 21.

Samodlingar definieras som tillväxten av olika specifika celltyper i en maträtt som kan ge fysiologiska betingelser in vitro för att demonstrera in vivo-liknande funktion. Konventionella neuron-neuron co-kulturer har införts för att neurovetenskaplig forskning för att studera synaptiska interaktioner mellan olika celltyper. Emellertid är det svårt att identifiera den pre- och post-ställena i synapser i dessa samkulturer. Detta microslice-differentierade neuron co-kultur protokollet ger enkel erkännande av pre-synaptiska axoner och postsynaptiska mål. Använda microslices från olika hjärnregioner of transgen mus som uttrycker olika fluorescerande proteiner, kan detta protokoll också användas för att studera axon-Axon interaktioner.

Det kritiska steget i denna microslice-dissocierade neuroner samodling protokollet tillhandahåller en stabil miljö för att möjliggöra fastsättning av explantaten, utväxt av utsprången och bildningen av synapser. Bordläggningen de microslices i en minimal volym av media och upprätthålla odlingsplattor på dämpade steril gasbinda kuddar är de två viktigaste stegen för microslice kvarstad och synaps bildning. Den största begränsningen av detta samarbete kultur-protokollet är att inte alla spridda NACC nervceller bildar funktionella synapser med vHipp axoner.

Genom att ändra genotypen av de före och efter synaptiska komponenter, erbjuder denna beredning en informativ strategi för att studera de pre- och postsynaptiska mekanismer av synaptisk plasticitet. Tre olika funktioner i denna beredning gör den idealisk för dessa studier. Hjärna regions som normalt är kopplade in vivo via fibervägar som inte kan upprätthållas, eller lätt identifieras i akuta skivor, kan kombineras i detta in vitro beredning. Pre- och postsynaptiska komponenter kommer från olika möss gör att tillåta oberoende förändring av antingen pre- eller post-synaptisk genotyp. Genom utstrykning pre- och postsynaptiska komponenter vid olika tidpunkter, är det möjligt att selektivt uttrycka exogena gener i antingen pre- eller post-synaptiska neuroner.

Nikotin inducerad Ca 2 + transienter (i sekunder till minuter intervall) genom aktivering av nAChR har rapporterats i odlade neuroner, astrocyter och i flera cellinjer som uttrycker nAChRs 25-27. Men de flesta av dessa studier inte upptäcka långsiktiga effekter (över 10 min) av kort tid nikotinexponering till stor del beror på bild skador under långvarig avbildning. Genom att använda odlings protokoll som beskrivs ovan och snabb spinning-skiva konfokala bildsamling,nikotin inducerade Ca2 + signalering, synaptiska vesikelfusion och glutamatfrisättning kan registreras i upp till 1 timme utan någon synbar skada på nervceller (Supplemental Film 1, 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture Media (50 ml)
Neurobasal  GIBCO 10888022 48 ml
B-27 Supplements GIBCO 0080085-SA 1 ml
Penicillin-Streptomycin GIBCO 10908-010 0.5 ml
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061 0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) GIBCO 15140-122 20 ng/ml
2. washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red  GIBCO 14175-095 99 ml
HEPES ( 1M) GIBCO 15630-130 1 ml
3. HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
tetrodotoxin  Tocris 1078 2 µM
bicuculline Tocris 131 10 µM
D-AP-5 Tocris 105 50 µM
CNQX Tocris 1045 20 µM
LY341495 Tocris 1209 10 µM
5. Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl Sigma S9888 119 mM
KCl Sigma P9333 56 mM
MgSO4.7H Sigma M1880 1.3 mM
CaCl2 Sigma C1016 2.5 mM
NaH2PO4 Sigma S8282 1 mM
NaHCO3 Sigma S5761 26.2 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26, (2-3), 198-216 (1998).
  2. Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53, (4), 633-640 (2002).
  3. Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
  4. Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31, (12), 580-586 (2010).
  5. Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8, (12), e82719 (2013).
  6. McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269, (5231), 1692-1696 (1995).
  7. Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383, (6602), 713-716 (1996).
  8. Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74, (2), 348-359 (2008).
  9. Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161, (5), 1161-1171 (2010).
  10. Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6, (2), e16911 (2011).
  11. Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21, (20), 7993-8003 (2001).
  12. Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134, (1), 65-74 (2004).
  13. Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23, (37), 11554-11567 (2003).
  14. Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73, (1), 27-41 (2008).
  15. Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311, (1), 80-91 (2004).
  16. Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30, (9), 3518-3530 (2010).
  17. Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76, (6), 1860-1870 (2001).
  18. Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286, (36), 31241-31249 (2011).
  19. Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86, (8), 1063-1073 (2013).
  20. St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30, (6), 656-662 (2009).
  21. Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28, (37), 9111-9116 (2008).
  22. Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. CRC Press. New York. (1998).
  23. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12, (2), 363-375 (1992).
  24. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
  25. Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32, (43), 15148-15157 (2012).
  26. Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94, (4), 2549-2560 (2005).
  27. Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18, (4), 376-385 (2008).
Live avbildning av nikotin inducerad kalciumsignalering och frisättning av signalsubstans Längs Ventral Hippocampus Axoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).More

Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter