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Neuroscience

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52730

Introduction

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Modulazione colinergica circuito eccitabilità contribuisce ad aspetti fondamentali della cognizione, e modulazione colinergici alterato è una caratteristica di malattie neurodegenerative e neuropsichiatrici tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la schizofrenia e la dipendenza 1-4. Un meccanismo stabilito di facilitazione colinergici della trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale è attraverso l'attivazione diretta di nAChR localizzati nei siti pre-sinaptici. L'attivazione di questi recettori presinaptici porta ad un aumento intracellulare Ca 2+ ([Ca 2+] i) nei terminali presinaptici - sia direttamente, a causa della relativamente alta conduttanza di calcio di alcuni sottotipi di nAChR, e indirettamente, tramite intracellulari cascate di segnalazione 5, rafforzando in tal modo il rilascio di neurotrasmettitore. Infatti, l'attivazione del nAChR pre-sinaptici è stato collegato con i cambiamenti nel rilascio di un'ampia varietà di neurotrasmettitori compresi glutammato, GABA, ACh, unnd dopamina 6-10. Sebbene questo processo è stato studiato indirettamente utilizzando metodi elettrofisiologici a vari sinapsi, reporter ottiche di [Ca 2+] i e riciclo delle vescicole sinaptiche permettono misura più diretta e temporalmente precisa dei fenomeni pre-sinaptici.

Localizzazione pre-sinaptica dei nAChR è stata dimostrata in modo convincente con etichettatura immuno-oro diretto della nAChR al microscopio elettronico (EM) il livello 11,12. Diverse altre tecniche sono state utilizzate anche per affrontare la localizzazione nAChR indirettamente, anche rilevando posizioni di nAChRs subunit- fluorescenti chimere proteine ​​in neuroni in coltura 13,14, registrazione elettrofisiologica delle correnti nAChR nei terminali sinaptici 15,16, il monitoraggio nicotina indotto cambiamenti in [Ca 2 +] i in terminazioni nervose sinaptiche di immagini dal vivo delle cellule 17, e monitoraggio indiretto del rilascio di neurotrasmettitore al terminale sinaptico datecniche di imaging cellulare dal vivo con indicatori fluorescenti, tra cui esocitosi delle vescicole sinaptiche visti da stirilici coloranti anfipatiche FM (FM1-43 e FM4-64) e / o Synapto-pHluorin e da specifici neurotrasmettitori reporter fluorescenti, come CNiFERs per ACh e iGluSnFr per il glutammato 18-20. Nel complesso, questi approcci attuali per identificare la localizzazione pre-sinaptica di nAChR sono complicate e richiedono sistemi e tecniche speciali per permettere l'identificazione affidabile e monitoraggio fisiologico di attività pre-sinaptica.

Qui si descrive protocolli e attrezzature per un sistema di co-coltura in vitro di un ippocampo ventrale (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) circuito che fornisce accesso diretto a identificare e analizzare i due componenti pre e post-sinaptici della trasmissione sinaptica. Mostriamo esempi di localizzazione pre-sinaptica di nAChR e imaging cellulare dal vivo di nAChR mediata Ca 2+ di segnalazione e di rilascio dei neurotrasmettitori aloassoni ng vHipp. Una naturale estensione (e semplice) del protocollo presentato qui è la preparazione di contatti pre e post-sinaptiche composti da neuroni provenienti da diversi genotipi. In questo modo il contributo di un particolare prodotto genico al pre e / o meccanismi di post-sinaptici di modulazione può essere valutata direttamente.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH Publications No. 80-23, riveduta 2012) e gli studi sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Uso delle commissioni di ricerca alla Stony Brook University (# 1618 e # 1792).

1. vHipp-NACC sinaptiche co-culture

  1. Topi Sacrifice (postnatale giorno 0-3, da wild-type (WT) o nAChR α7 linea di topo transgenico) con emissioni di CO 2. Decapitare ogni cucciolo e salvare la coda in una provetta da 1,5 ml centrifugare per post facto genotipizzazione. Effettuare le seguenti operazioni in una cappa sterile.
  2. Togliere la parte superiore del cranio con le forbici e pinze per esporre tutto il cervello. Partendo dalla congiunzione dove le cortecce cerebrali parte una dall'altra caudalmente, ottenere una sezione coronale che contiene le cortecce posteriori che includono la vHipp 5,21 sotto un microscopio da dissezione.
  3. Sezionare vStrisce di tessuto Hipp contenenti regione CA1-subiculum secondo un atlante sviluppo cerebrale del mouse 22 (Figura 1A). Trasferimento a un piatto di coltura 35 millimetri contenente terreni di coltura freddo (4 ° C), tagliato a fettine sottili (circa 100 micron × 100 micron microslices).
  4. Pre-incubazione 12 millimetri poli-D-lisina / vetrini laminina rivestite all'interno di 24 pozzetti di coltura tissutale con terreni di coltura (~ 500 microlitri) per almeno 30 minuti in incubatrice a 37 ° C. Rimuovere i supporti prima di placcatura microslices.
  5. Piatto con una pipetta Pasteur lucidati a fuoco al centro del vetrino con minima quantità di supporti (~ 50 microlitri, contenente ~ 20 pezzi di microslices) per facilitare il fissaggio degli espianti. Piatto microslices vHipp provenienti da un singolo animale (sia il + / + o il - / - genotipo della linea α7 transgenica) su ogni vetrino.
  6. Dopo gli espianti depositano sul vetrino, aggiungere delicatamente multimediale aggiuntivo (~ 100 ml) di the parete in modo che il livello dei media è sufficientemente alto per coprire completamente le espianti sulla periferia, ma non quelli al centro del vetrino.
  7. Dopo un / N incubazione O a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, disperdere i neuroni NACC da giorni embrionali 18 di post-natale giorno 1 topi WT e aggiungere gli espianti.
    1. Sezionare tessuti NACC secondo un sviluppo atlante cervello di topo 20 (Figura 1B).
    2. Tagliare a piccoli pezzi (circa 500 micron × 500 micron microslices) e trasferimento in una provetta da 15 ml.
    3. Trattare con 0,25% tripsina (2 ml) per 15 min a 37 ° C. Lavare pezzi di tessuto tre volte con mezzi di lavaggio a freddo (5 ml, 4 ° C) seguito da un lavaggio in mezzi di coltura fredda (5 ml, 4 ° C). Lasciare riposare la sospensione per 5 minuti in ogni fase di lavaggio, e poi versare con cautela il surnatante.
    4. Separa celle di dolce triturazione in 2 ml di coltura con un leggermente incendio lucidato pipetta Pasteur.
    5. Transsospensione cellulare fer ad un'altra provetta da 15 ml e centrifugare a 2.000 x rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in coltura a 1 ml per 6 cuccioli. Disperdere le cellule pipettando delicatamente in mezzi più volte con un fuoco lucidato pipetta Pasteur.
    6. Aggiungere 0,25 ml di cellule NACC dispersi ad ogni vetrino con espianti vHipp.
    7. Mantenere le culture in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Mettere piastre di coltura su inumidite garze sterili per stabilizzare meccanicamente e mantenere l'umidità, favorendo la formazione di sinapsi.

2. Immunocitochimica

  1. Fissare culture (5-7 giorni in vitro) nel 4% paraformaldeide / 4% di saccarosio / PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 20 min, RT).
  2. Culture permeabilize con 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 5 min, RT).
  3. Culture di blocco con il 10% di siero asino normale in PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 30 min, RT) prima gli anticorpiy colorazione. Incubare con anticorpi primari O / N a 4 ° C. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: nAChRs anti- (α 4 -ECD 1: 500; anti-α 5 subunità, 1: 500), anti-vescicolare trasportatore del glutammato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
  4. Lavare anticorpi primari con PBS (3 volte / ~ 500 microlitri per vetrino, 5 min) e poi incubare culture anticorpi secondari coniugati Alexa 488 (~ 500 ml per vetrino, 1: 500) o Alexa 594 (~ 500 microlitri per coprioggetto , 1: 500) per 1 ora a 37 ° C.
  5. Incubare culture in αBgTx coniugati Alexa 594 (~ 500 ml per vetrino, 1: 1.000 in coltura) per 45 minuti a 37 ° C prima della fissazione per l'etichettatura superficie α7 * nAChR.
  6. Inserire e tenuta coprioggetto.
  7. Catturare le immagini con un microscopio a fluorescenza dotato di obiettivi Plan-Apocromatici (20X con 0,8 NA o 63X olio con 1.4 NA) e una fotocamera CCD.

3. FM1-43 Based vescicolare Fusion

  1. Mantenere culture (5-7 giorni in vitro) in un camera di imaging, montare la camera su disco rotante microscopio confocale. Continuously profumato (1 ml / min) con HBS cocktail RT.
  2. Smettere di culture di perfusione e di carico con 10 micron FM1-43 in 56 mm K + ACSF (~ 500 microlitri) per 90 secondi (colorazione), lavare tintura esterno via per 15 minuti con Ca2 + HBS gratuito contenente ADVASEP-7 (0,1 mm) per pulire FM1-43 legato alla membrana.
  3. Stimolare le culture con 56 mm K + ACSF (~ 500 microlitri) senza FM1-43 per 120 sec (decolorazione), ricaricare le culture con FM1-43 utilizzando le stesse condizioni, e lavare di nuovo con Ca2 + HBS gratuito contenente ADVASEP-7 per 15 min.
  4. Acquisire FM1-43 immagini a fluorescenza con disco rotante microscopio confocale equipaggiato con un obiettivo Plan-Apochromat (60X acqua con 1.4 NA, di eccitazione 488 nm, emissione 530 nm) e catturare immagini con una telecamera CCD.
  5. Raccogliere immagini FM1-43 fluorescenza di base (ogni 2 s per 1 min) Il controllo pre-nicotina; applicare nicotina (1 mM) di perfusione rapida (2 ml / min) per 1 min, e poi lavare la nicotina con HBS cocktail. Tenere time-lapse immagini cattura prima, durante e dopo l'applicazione di nicotina ogni 2 secondi per 5 min.
  6. Quantificare FM1-43 intensità di fluorescenza prima (F colorazione) e dopo (F decolorante) applicazione nicotina ad ogni bouton sinaptica.
  7. Calcola importo complessivo di rilasciabile fluorescenza FM1-43 lungo gli assoni vHipp quantificando la differenza di FM1-43 fluorescenza prima e dopo l'applicazione della nicotina (Af = F colorazione -F decolorazione). Analizzare frazione della diminuzione dell'intensità di fluorescenza dopo nicotina con la seguente equazione: diminuzione F% = Af / F colorazione.

4. Imaging di calcio

  1. Sciacquare culture (5-7 giorni in vitro) rapidamente con normale HBS, quindi caricare le culture con 5 Indicatore mM Fluo-4 Ca 2+ (AM estere) e 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) per 30 min a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. Lavare Fluo-4 soluzione HBS (3 volte / 5 min). Culture Ritorno a incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) per almeno 30 minuti.
  3. Mantenere le culture nella stessa camera di imaging e stesse condizioni descritte nella sezione FM1-43 fusione vescicolare base (vedi punto 3.1).
  4. Raccogliere le immagini Fluo-4 di fluorescenza di proiezioni assonale dai vHipp micro-fette con un obiettivo Plan-Apochromat (60X acqua con 1.4 NA, di eccitazione 488 nm, emissione 530 nm) e una fotocamera CCD.
  5. Raccogliere basali Fluo-4 fluorescenza (ogni 10 sec per 2 min) il controllo pre-nicotina, applicare nicotina (1 micron) di perfusione rapido (2 ml / min) per 1 min, e poi lavare la nicotina con HBS cocktail. Tenere time-lapse immagini cattura prima, durante e dopo l'applicazione di nicotina ogni 10 sec per 30 min.
  6. Salvare tutti i fotogrammi dei fluo-4 fluorescenza prime, l'esportazione come una serie diLe immagini in formato TIFF per ulteriori analisi.
  7. Raccogliere l'intensità integrata di fluo-4 fluorescenza lungo gli assoni vHipp prima e dopo l'applicazione di nicotina.
  8. Normalizzare intensità di fluorescenza integrato con la seguente equazione: Af / F 0 = (0 FF) / F 0, dove F 0 è il pre-nicotina intensità di fluorescenza integrato fondo corretto e F è l'intensità di fluorescenza integrato lungo gli assoni vHipp ad ogni tempo dopo l'applicazione di nicotina. Analizzare e tracciare normalizzato intensità di fluorescenza integrato.

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Representative Results

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La preparazione impiegato consiste gene chimerico co-colture di circuiti vHipp-NACC in vitro. Le proiezioni provenienti da microslices vHipp, come input assonale pre-sinaptica, possono prendere contatti sinaptici con obiettivi post-sinaptici, i neuroni dispersi da NACC. La nicotina ha indotto una sostenuta (≥ 30 min) la facilitazione della trasmissione glutammatergica dai neuroni NACC innervati dal vHipp assoni 21 e prolungata di calcio di segnalazione lungo gli assoni vHipp 5 via α7 pre-sinaptica * nAChR.

La Figura 1 mostra direttamente che le proiezioni delle vHipp micro-fette sono glutamatergico (vGluT1 positivo) e che i contatti sono realizzati con dispersi GABAergici neuroni spinosi medi da NACC (GAD positiva, Figura 1C, D). Sia α7 * e non α7 nAChR * (incluso α4 e α5 subunità) sono stati trovati lungo gli assoni vHipp (Figura 1E-G) e in particolare nei sitidove le proiezioni vHipp contattare neuroni NACC. Va osservato che i neuroni dispersi da NACC non esprimono nAChRs * α7 (figura 1H); vale a dire i cluster dei recettori a contatti sono rigorosamente presinaptica (Figura 1I), puoi anche consultare la Figura 1 in riferimento 5.

Una volta stabiliti i chimerici co-culture, l'imaging dal vivo di [Ca 2+] i e sinaptica vescicole fusione lungo gli assoni vHipp con e / o senza nicotina possono essere registrati fino a 30 minuti senza alcun danno apparente ai neuroni.

Immagini rappresentative, filmati time-lapse e quantificazioni di nicotina indotta fluo-4 [Ca 2+] i segnalazione lungo gli assoni vHipp sono illustrati nella Figura 2 e supplementare Movie 1 e 2. Abbiamo scoperto che l'attivazione di vHipp nAChR da nicotina induce sostenuto Ca 2+ afflusso in assoni pre-sinaptici (Figura 2A, D). La fase di prolungatadi nicotina indotto aumenti [Ca 2 +] i segnalamento lungo gli assoni vHipp è stata bloccata dal α7 specifica * nAChR antagonista αBgTx ma non dalla non α7 * nAChR antagonista DHβE (Figura 2A-C).

Visualizzazione diretta di attività-dipendente FM1-43 dye endocitosi e esocitosi è stato utilizzato per monitorare indirettamente presinaptica rilascio di neurotrasmettitore 23, 24. Qui, immagini rappresentative e la quantificazione di nicotina indotta fusione vescicolare lungo gli assoni vHipp visualizzati da FM1-43 sono illustrati nella Figura 3 (Figura 3A, C). La presenza di α7 pre-sinaptica * nAChR è richiesto per la massima nicotina indotta fusione della vescicola e neurotrasmettitore rilascio (Figura 3B, C).

Figura 1
Figura 1. Synaptic co-coltura di vHipp con NACC consente examination della localizzazione pre-sinaptica di nAChR. (AC) Schema del fumetto di circuiti specifici genotipo in vitro (C) preparati da placcatura separata ventrale ippocampo / subiculum (A).   fette da un individuo WT o α7 - / - i neuroni di topo e dispersi da WT nucleo accumbens (B). Aq, acquedotto (Silvio), DG, giro dentato, MM, mediale mammillary nucleo; OCMP, posteromediale amygdaloid nucleo corticale, rf, fessura rhinal, FMI, pinza minore del corpo calloso, LV, ventricolo laterale, Tu, tubercolo olfattivo; VP , pallidum ventrale. microslices (D) vHipp estendono vGluT1 positivo (rosso) proiezioni assonale che contattano GAD65 positivo (verde) neuroni NACC (frecce bianche sono esempi di questi siti di contatto). Scala bar: 10 micron (E.-G) Micrografie rappresentativi di assoni WT vHipp (colorazione con vGluT1, verde) sono indicati per α4 * nAChR (E), α5 * nAChR (F) e α7 superficie * nAChR (G) colorazione a grappoli rossi (frecce bianche). Scala bar:.. 5 micron (H) Non ci sono α7 superficie * cluster nAChR sui neuroni GABAergici dispersi (GAD 65 positivi) da solo NACC (I) rosse "gruppi" di α7 superficie * nAChR (frecce bianche) può essere visto in quelli neuroni dispersi co-coltura con microslices vHipp. Scala bar:. 5 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Synaptic co-coltura di vHipp con NACC consente l'esame di nicotina indotta segnale calcioing lungo gli assoni vHipp. (A) Rappresentante fluo-4 immagini di calcio legati fluo-4 nella scala a colori pseudo lungo un assone WT vHipp prima (in alto), 1 '(Centro), e 30' (in basso) dopo l'applicazione di nicotina. La fase sostenuta (30 ') del Ca 2+ risposta indotta dalla nicotina viene eliminata mediante aggiunta del α7 * nAChR antagonista selettivo αBgTx (100 nM) (B), ma non con l'aggiunta del non-α7 * nAChR antagonista selettivo DHβE (1 mM) (C). Scala bar: 5 micron (D) appezzamento Rappresentante normalizzato fluo-4 intensità di fluorescenza integrato da un live assone WT vHipp perfuso con nicotina (1 micron) per 1 min.. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Synaptic co-coltura di vHipp con NACC consente l'esame di nicotina indotto vescicolare rilascio di neurotrasmettitori (con FM1-43) lungo gli assoni vHipp. (A) Immagini rappresentative della assoni WT vHipp (carichi di FM1-43, verde) prima (in alto) e dopo (in basso) l'applicazione della nicotina. (B) Immagini rappresentative della assoni WT vHipp (carichi di FM1-43, pretrattati con α7 * nAChR antagonista selettivo αBgTx per 15 min) prima (in alto) e dopo (in basso) applicazione nicotina. Scala bar:. 5 micron (C) mostra la quantificazione delle variazioni assonale FM1-43 fluorescenza (diminuzione F) dopo il trattamento di nicotina in assenza (WT) o presenza (WT + αBgTx) del α7 * nAChR antagonista. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Spostare 1
Film Supplemento 1: Time-lapse immagini dal vivo di basale Fluo-4 / Ca 2+ fluorescenza lungo gli assoni vHipp.

Le immagini time-lapse di Fluo-4 / Ca 2+ fluorescenza lungo gli assoni vHipp state acquisite con una lente obiettivo 60x acqua ogni 10 sec per 30 minuti con un microscopio confocale disco rotante. Immagini acquisite sono stati indicati su scala pseudo colori e riprodotti come un film a 2 fotogrammi al s. Questo filmato mostra la linea di base di Fluo-4 / Ca 2+ attività fluorescenza lungo vivono WT vHipp assone perfuso con HBS cocktail.

Movie 2
Movie Supplemento 2: Time-lapse immagini dal vivo di nicotina indotta sostenuta Fluo-4 / Ca 2+ fluorescenza lungo gli assoni vHipp.

Le immagini time-lapse di Fluo-4 / Ca 2+ fluorescenza lungo gli assoni vHipp state acquisite con una lente obiettivo 60x acqua ogni 10 sec per 30 minuti con un microscopio confocale disco rotante. Immagini acquisite sono stati indicati su scala pseudo colori e riprodotti come un film a 2 fotogrammi al secondo. Questo filmato mostra nicotina (1 micron, perfusione in tempo al punto 43, lavato con HBS cocktail al punto momento 49) indotta Fluo-4 / Ca 2+ attività fluorescenza lungo vivono WT vHipp assone. Applicazione nicotina aumentato l'/ Ca intensità fluo-4 2+ fluorescenza lungo gli assoni vHipp.

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Discussion

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La preparazione co-coltura descritto ri-capitola ventrale circuiti dell'ippocampo-accumbens in vitro. Questo esame permette di preparazione relativamente semplice e affidabile dei profili spazio-temporali per cui l'attivazione di nAChR pre-sinaptici suscitare esaltata trasmissione glutamatergica 5, 21.

Co-colture sono definite come la crescita di diversi tipi cellulari specifici in un piatto che può fornire condizioni fisiologiche in vitro per dimostrare in vivo -come funzione. Neurone-neurone co-colture convenzionali sono stati introdotti per la ricerca delle neuroscienze per lo studio delle interazioni sinaptiche tra diversi tipi di cellule. Tuttavia, è difficile identificare il pre e post-siti di sinapsi in questi co-culture. Questo protocollo neuroni co-coltura microslice dissociati permette un facile riconoscimento degli assoni pre-sinaptici e obiettivi post-sinaptici. Uso microslices provenienti da diverse regioni del cervello of linea di topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti differenti, questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare le interazioni assone-assone.

La fase critica di questo neuroni microslice dissociati protocollo co-coltura è fornire un ambiente stabile per consentire il fissaggio degli espianti, la conseguenza delle proiezioni e la formazione di sinapsi. Placcatura i microslices in un volume minimo di supporto e mantenimento delle piastre di coltura su inumidite garze sterili sono i due passaggi chiave per il fissaggio microslice e formazione di sinapsi. Il limite principale di questo protocollo co-coltura è che i neuroni NACC non tutte disperse formano sinapsi funzionali con assoni vHipp.

Alterando il genotipo dei componenti pre e post-sinaptici, questa preparazione fornisce un approccio informativo per studiare i meccanismi di pre e post-sinaptici di plasticità sinaptica. Tre caratteristiche distinte di questa preparazione lo rendono ideale per questi studi. Cervello regioni che si collegano in vivo attraverso i percorsi delle fibre che non possono essere mantenute, o facilmente identificati in fettine acute, possono essere combinati in questa preparazione in vitro. Pre e post-sinaptici componenti provengono da diverse topi fanno permettendo alterazione indipendente né la pre- o genotipo post-sinaptico. Con placcatura componenti pre e post-sinaptici in tempi diversi, è possibile esprimere selettivamente geni esogeni né nel pre- o neuroni postsinaptici.

La nicotina ha indotto Ca 2 + transitori (in secondi o minuti gamma) per l'attivazione del nAChR sono stati riportati in neuroni in coltura, astrociti e in diverse linee di cellule che esprimono nAChRs 25-27. Tuttavia, la maggior parte di questi studi non ha rilevato gli effetti a lungo termine (oltre 10 min) di esposizione alla nicotina breve tempo in gran parte a causa dei danni foto durante l'imaging a lungo termine. Utilizzando il protocollo coltura descritto sopra e rapida filatura dischi raccolta di immagini confocale,nicotina indotta Ca 2+ segnalamento, delle vescicole sinaptiche fusion e il rilascio di glutammato possono essere registrati fino a 1 ora senza alcun danno apparente ai neuroni (Film supplementare 1, 2).

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture Media (50 ml)
Neurobasal  GIBCO 10888022 48 ml
B-27 Supplements GIBCO 0080085-SA 1 ml
Penicillin-Streptomycin GIBCO 10908-010 0.5 ml
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061 0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) GIBCO 15140-122 20 ng/ml
2. washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red  GIBCO 14175-095 99 ml
HEPES ( 1M) GIBCO 15630-130 1 ml
3. HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
tetrodotoxin  Tocris 1078 2 µM
bicuculline Tocris 131 10 µM
D-AP-5 Tocris 105 50 µM
CNQX Tocris 1045 20 µM
LY341495 Tocris 1209 10 µM
5. Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl Sigma S9888 119 mM
KCl Sigma P9333 56 mM
MgSO4.7H Sigma M1880 1.3 mM
CaCl2 Sigma C1016 2.5 mM
NaH2PO4 Sigma S8282 1 mM
NaHCO3 Sigma S5761 26.2 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM

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References

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Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni
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Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).More

Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).

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