Introduction
Cholinerg modulering af kredsløb excitabilitet bidrager til grundlæggende aspekter af kognition og ændret cholinerg modulation er en funktion af neurodegenerative og neuropsykiatriske lidelser, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, skizofreni og afhængighed 1-4. En etableret mekanisme af cholinerge lettelse af synaptisk transmission i CNS er via direkte aktivering af nAChR'er lokaliseret ved præsynaptiske steder. Aktivering af disse præ-synaptiske receptorer fører til øget intracellulær Ca2 + ([Ca2 +] i) i præ-synaptiske terminaler - både direkte, på grund af den relativt høje calcium konduktans af visse nAChR undertyper, og indirekte via intracellulære signalering kaskader 5, hvilket vil styrke neurotransmitterfrigivelse. Faktisk har aktiveringen af præsynaptiske nAChRs blevet forbundet med ændringer i frigivelse af en lang række forskellige neurotransmittere, herunder glutamat, GABA, ACh, ennd dopamin 6-10. Selv om denne proces er blevet undersøgt indirekte ved hjælp elektrofysiologiske metoder på forskellige synapser, optiske reportere i [Ca2 +] i og synaptisk vesikel genanvendelse tillade mere direkte og tidsligt præcis måling af præsynaptiske fænomener.
Præsynaptiske lokalisering af nAChR'er er blevet demonstreret overbevisende med direkte immuno-guld mærkning af nAChR'er ved elektronmikroskopiske (EM) niveau 11,12. Adskillige andre teknikker har også været anvendt til at behandle nAChR lokalisering indirekte, herunder påvisning placeringer af nAChRs subunit- fluorescerende proteinkimærer i dyrkede neuroner 13,14, elektrofysiologiske registrering af nAChR strømme i synaptiske terminaler 15,16, overvågning nikotin inducerede ændringer i [Ca 2 +] i i synaptiske nerveender ved levende celler 17, og indirekte overvågning af neurotransmitter frigørelse ved den synaptiske terminal vedlevende celle billeddannelsesteknikker med fluorescerende indikatorer, herunder exocytose af synaptiske vesikler ses af styryl amfipatiske FM farvestoffer (FM1-43 og FM4-64) og / eller synapto-pHluorin og ved specifikke fluorescerende neurotransmitter reportere, såsom CNiFERs for ACh og iGluSnFr for glutamat 18-20. Samlet set har disse nuværende tilgange til at identificere præ-synaptisk lokalisering af nAChRs er komplicerede, og kræver særlige systemer og teknikker til at tillade pålidelig identifikation og fysiologiske overvågning af præ-synaptisk aktivitet.
Her beskriver vi protokoller og udstyr til en in vitro co-kultur system i en ventral hippocampalt (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) kredsløb, der giver direkte adgang til at identificere og analysere både præ- og postsynaptiske komponenter af synaptisk transmission. Vi viser eksempler på præ-synaptisk lokalisering af nAChR'er og levende celler billeddannelse af nAChR medieret Ca2 + signalering og neurotransmitter release along vHipp axoner. En naturlig (og ligetil) forlængelse af protokollen præsenteres her er forberedelsen af præ- og post-synaptiske kontakter består af neuroner fra forskellige genotyper. På denne måde kan vurderes af bidraget fra en bestemt genprodukt til præ- og / eller post-synaptiske mekanismer af gradueringen direkte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH Publications No. 80-23, revideret 2012) og undersøgelser blev godkendt af Institutional Animal Care og brug for Forskning komitéer på Stony Brook University (# 1618 og # 1792).
1. vHipp-NACC Synaptiske Co-kulturer
- Sacrifice mus (postnatal dag 0 - 3, fra vildtype (WT) eller α7 nAChRs transgene mus linie) med CO2. Halshugge hver hvalp og gemme halen i et 1,5 ml centrifugerør for post facto genotypebestemmelse. Udfør følgende trin i en steriliseret hætte.
- Fjern det øverste af kraniet med saks og pincet for at blotlægge hele hjernen. Start ved tidspunkt, hvor de cerebrale cortex del fra hinanden kaudalt, få en koronalt sektion, der indeholder de bageste cortex herunder vHipp 5,21 under et dissektionsmikroskop.
- Dissekere vHipp vævsstrimler indeholdende CA1-subiculum region i henhold til en udvikling musehjerne atlas 22 (figur 1A). Overførsel til en 35 mm dyrkningsskål indeholdende koldt dyrkningsmedier (4 ° C), skåret i små tynde skiver (ca. 100 um × 100 um microslices).
- Præinkuberes 12 mm poly-D-lysin / laminin-overtrukne dækglas inde 24 brønds vævskulturplader med dyrkningsmedier (~ 500 pi) i mindst 30 minutter i inkubatoren ved 37 ° C. Fjern mediet, før plating microslices.
- Plade med en flammepoleret Pasteur pipette i midten af dækglasset med minimal mængde af medier (~ 50 ul, indeholdende ~ 20 stykker microslices) for at lette fastgørelsen af eksplantaterne. Plate vHipp microslices stammer fra et enkelt dyr (enten + / + eller - / - genotype af den transgene α7 linje) på hvert dækglas.
- Efter eksplantaterne rette på dækglasset, forsigtigt tilføje ekstra medier (~ 100 ul) ved the væg, således at niveauet af medierne er høj nok til helt at dække eksplantaterne i periferien, men ikke dem i midten af dækglasset.
- Efter en O / N inkubering i 37 ° C, 5% CO2 inkubator, dispergere NACC neuroner fra embryonale dage 18 til postnatal dag 1 WT-mus og tilføje til eksplantaterne.
- Dissekere ud NACC væv ifølge en udvikling musehjerne atlas 20 (figur 1B).
- Skåret i små stykker (ca. 500 um × 500 um microslices) og overføres til en 15 ml rør.
- Der behandles med 0,25% trypsin (2 ml) i 15 minutter ved 37 ° C. Vask væv bidder tre gange med kold vask medier (5 ml, 4 ° C) efterfulgt af en vask i koldt dyrkningsmedier (5 ml, 4 ° C). Tillader suspension til hvile i 5 minutter i hver vask trin, og derefter hæld supernatanten omhyggeligt.
- Dissociere celler ved forsigtig triturering i 2 ml dyrkningsmedium med en let flammepoleret Pasteur-pipette.
- Transfer cellesuspension til en anden 15 ml rør og centrifugeres ved 2.000 x rpm i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i dyrkningsmedium ved 1 ml pr 6 unger. Sprede celler ved forsigtigt at pipettere i medier flere gange med en brand-poleret Pasteur pipette.
- Tilsættes 0,25 ml dispergerede NACC celler til hver dækglas med vHipp eksplantater.
- Opretholde kulturerne i en befugtet 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Placere dyrkningsplader på dæmpede steril gaze puder til mekanisk at stabilisere og opretholde fugtighed, hvilket letter synapse formation.
2. Immuncytokemi
- Fix kulturer (5 - 7 dage i vitro) i 4% paraformaldehyd / 4% saccharose / PBS (~ 500 pi pr dækglas, 20 min, RT).
- Permeabilisere kulturer med 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 pi pr dækglas, 5 min, RT).
- Bloker kulturer med 10% normalt æsel serum i PBS (~ 500 pi pr dækglas, 30 min, RT) før Antibody-farvning. Inkuber med primære antistoffer O / N ved 4 ° C. Brug følgende primære antistoffer: anti nAChRs (α 4 -ECD 1: 500; anti-α 5 subunits, 1: 500), anti-vesikulær glutamat transportøren 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
- Vask primære antistoffer ud med PBS (3 gange / ~ 500 pi pr dækglas, 5 min), og derefter inkuberes kulturer i sekundære antistoffer konjugeret til Alexa 488 (~ 500 pi pr dækglas, 1: 500) eller Alexa 594 (~ 500 pi pr dækglas , 1: 500) i 1 time ved 37 ° C.
- Inkuber kulturer i αBgTx konjugeret til Alexa 594 (~ 500 pi pr dækglas, 1: 1.000 i dyrkningsmedier) i 45 minutter ved 37 ° C før fiksering til mærkning overflade α7 * nAChRs.
- Mount og sæl dækglas.
- Tage billeder med et fluorescensmikroskop udstyret med Plan-Apochromat målsætninger (20X med 0,8 NA eller 63X olie med 1,4 NA) og et CCD-kamera.
3. FM1-43 Based vesikulær Fusion
- Oprethold kulturer (5-7 dage in vitro) i et imaging kammer, montere kammeret på spinning disk konfokal mikroskop. Kontinuerligt perfundere (1 ml / min) med HBS cocktail ved stuetemperatur.
- Stop perfusion og belastning kulturer med 10 pM FM1-43 i 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) i 90 sekunder (farvning), vask ekstern farvestof væk i 15 min med Ca 2+ gratis HBS indeholder ADVASEP-7 (0,1 mM) til at fjerne membranbundet FM1-43.
- Stimulere kulturerne med 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) uden FM1-43 for 120 sek (affarvning), genindlæse kulturer med FM1-43 med de samme betingelser, og vask igen med Ca2 + gratis HBS indeholder ADVASEP-7 for 15 min.
- Anskaf FM1-43 fluorescens billeder med spinning disk konfokal mikroskop udstyret med en Plan-Apochromat målsætning (60X vand med 1,4 NA, excitation 488 nm, emission 530 nm), og tage billeder med et CCD-kamera.
- Saml baseline FM1-43 fluorescens billeder (hver 2 s for 1 min) Som præ-nikotin kontrol; anvende nikotin (1 uM) ved hurtig perfusion (2 ml / min) i 1 min, og derefter vaske nikotin med HBS cocktail. Hold capture time-lapse billeder før, under og efter nikotin ansøgning hver 2 sek i 5 min.
- Kvantificere FM1-43 fluorescensintensitet før (F farvning) og efter (F affarvning) nikotin ansøgning på hvert synaptiske bouton.
- Beregn samlede udløselig FM1-43 fluorescens langs vHipp axoner ved at kvantificere forskellen i FM1-43 fluorescensintensitet før og efter nikotin ansøgning (bf = F farvning -F affarvning). Analyser brøkdel af fluorescensintensitet fald efter nikotin med følgende ligning: F fald% = bf / F-farvning.
4. Calcium Imaging
- Skyl kulturer (5-7 dage in vitro) hurtigt med normal HBS, derefter indlæse kulturer med 5 pM Fluo-4 Ca 2+ indikator (AM ester) og 0,02% Pluronic F-127 i HBS (2 ml) i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skyl Fluo-4 løsning med HBS (3 gange / 5 min). Retur kulturer inkubator (37 ° C / 5% CO2) i mindst 30 min.
- Opretholde kulturer i samme imaging kammer og samme betingelser som beskrevet i FM1-43 baseret vesikulær fusion sektion (se trin 3.1).
- Saml Fluo-4 fluorescens billeder af axonale fremskrivninger fra vHipp mikro-skiver med en Plan-Apochromat målsætning (60X vand med 1,4 NA, excitation 488 nm, emission 530 nm) og en CCD-kamera.
- Indsamle baseline Fluo-4 fluorescensbilleder (hver 10 sek i 2 min) som præ-nikotin kontrol, anvende nikotin (1 uM) ved hurtig perfusion (2 ml / min) i 1 min, og derefter vaske nikotin med HBS cocktail. Hold capture time-lapse billeder før, under og efter nikotin ansøgning hver 10 sek i 30 min.
- Gemme alle rammer af de rå fluo-4 fluorescensbilleder, eksport som en serie afTIFF format billeder til yderligere analyse.
- Saml den integrerede intensitet fluo-4 fluorescens langs vHipp axoner før og efter nikotin ansøgning.
- Normalisere integrerede fluorescensintensitet med følgende ligning: bf / F 0 = (FF 0) / F 0, hvor F 0 er baggrunden korrigeret før nikotin integrerede fluorescensintensitet og F er den integrerede fluorescensintensitet langs vHipp axoner på hvert tidspunkt efter nikotin ansøgning. Analysere og plot normaliseret integreret fluorescensintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den anvendte præparat består af gen kimære co-kulturer af vHipp-NACC kredsløb i vitro. Fremskrivninger stammer fra vHipp microslices, som præ-synaptisk axonal input, kan gøre synaptiske kontakter med postsynaptiske mål, de spredte neuroner fra NACC. Nikotin inducerede en vedvarende (≥ 30 min) lettelse af glutamaterg transmission fra NACC neuroner innerveres af vHipp axoner 21 og forlænget calcium signalering ad vHipp axoner 5 via præ-synaptisk α7 * nAChRs.
Figur 1 viser direkte, at fremskrivningerne fra vHipp mikro-skiver er glutamaterge (vGluT1 positiv), og at kontakterne er lavet med spredte GABAerge medium spiny neuroner fra NACC (GAD positiv, figur 1C, D). Både α7 * og ikke-α7 * nAChRs (herunder α4 og α5 underenheder) blev fundet langs vHipp axoner (Figur 1E-G) og specifikt på stederhvor vHipp fremskrivninger kontakte NACC neuroner. Det skal bemærkes, at dispergerede neuroner fra NACC ikke udtrykker α7 * nAChRs (figur 1H); dvs. receptor klynger på kontakterne er strengt præsynaptiske (figur 1 i), se også figur 1 i Referenceeksempel 5.
Når der er etableret de kimære co-kulturer, live billeder af [Ca2 +] i og synaptiske vesikler fusion sammen vHipp axoner med og / eller uden nikotin kan optages for op til 30 min uden synlige skader på neuroner.
Repræsentative billeder, time-lapse film og kvantificering for nikotin-fremkaldt fluo-4 [Ca2 +] i signalering langs vHipp axoner er vist i figur 2 og supplerende Movie 1 og 2. Vi fandt, at aktivering af vHipp nAChR'er af nikotin inducerer vedvarende Ca 2+ indstrømning i præsynaptiske axoner (figur 2A, D). Den vedvarende faseaf nikotin inducerede stigninger i [Ca2 +] i signalering langs vHipp axoner blev blokeret af den specifikke α7 * nAChR antagonist αBgTx men ikke af ikke-α7 * nAChR antagonist DHβE (figur 2A-C).
Direkte visualisering af aktivitet-afhængig FM1-43 farvestof endocytose og exocytose er blevet anvendt til at overvåge indirekte præsynaptiske neurotransmitter-frigivelse 23, 24. Her er repræsentative billeder og kvantificering af nikotin-fremkaldt vesikulær fusion langs vHipp axoner visualiseret ved FM1-43 vist i figur 3 (figur 3A, C). Tilstedeværelsen af præ-synaptisk α7 * nAChRs er påkrævet for maksimal nicotin-induceret vesikelfusion og neurotransmitterfrigivelse (figur 3B, C).
Figur 1. Synaptic co-kultur af vHipp med NACC tillader examination af præ-synaptisk lokalisering af nAChR'er. (AC) Skematisk tegning af genotype-specifik in vitro kredsløb (C) fremstillet ved separat udpladning af ventral hippocampus / subiculum (A). skiver fra et individ WT eller α7 - / - mus og spredte neuroner fra WT nucleus accumbens (B). Aq, akvædukt (Sylvius) GD, tandede gyrus, MM, mediale mammillary kerne, PMCo, posteromedial kortikal amygdaloidkompleks kerne, rf, rhinal sprække, FMI, pincet mindre af corpus callosum, LV, lateral ventrikel, Tu, olfaktoriske tuberkel; VP , ventral pallidum. (D) vHipp microslices udvide vGluT1 positive (rød) axonale fremskrivninger, kontakt GAD65 positive (grøn) NACC neuroner (hvide pile er eksempler på disse kontaktpersoner sites). Målestok: 10 um (E.-G) Repræsentative mikrografier af WT vHipp axoner (farvning med vGluT1, grøn) er vist for α4 * nAChR (E), α5 * nAChR (F) og overflade α7 * nAChR (G) farvning i rød klynger (hvide pile). Målestok:.. 5 um (H) Der er ingen overflade α7 * nAChR klynger på spredte GABAerge neuroner (GAD65 positiv) fra NACC alene (I) Røde "klynger" af overfladen α7 * nAChR (hvide pile) kan ses i dem spredte neuroner co-dyrket med vHipp microslices. Målestok:. 5 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Synaptic co-kultur af vHipp med NACC tillader undersøgelse af nikotin fremkaldte calcium signaling langs vHipp axoner. (A) Repræsentative fluo-4 billeder af calcium bundet fluo-4 i pseudo farveskala langs en WT vHipp Axon før (top), 1 '(Middle), og 30' (nederst) efter nikotin ansøgning. Den vedvarende fase (30 ') af nicotin-induceret Ca2 + respons elimineres ved tilsætning af α7 * nAChR selektiv antagonist αBgTx (100 nM) (B), men ikke ved tilsætning af det ikke-α7 * nAChR selektiv antagonist DHβE (1 uM) (C). Målestok: 5 um (D) Repræsentant plot af normaliseret fluo-4 integrerede fluorescensintensitet fra en live WT vHipp axon perfunderet med nikotin (1 uM) i 1 min.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Synaptic co-kultur af vHipp med NACC tillader undersøgelse af nikotin induceret vesikulær neurotransmitter frigivelse (med FM1-43) langs vHipp axoner. (A) Repræsentative billeder af WT vHipp axoner (lastet med FM1-43, grøn) før (øverst) og efter (nederst) nicotin ansøgning. (B) Repræsentative billeder af WT vHipp axoner (lastet med FM1-43, forbehandlet med α7 * nAChR selektiv antagonist αBgTx i 15 minutter) før (øverst) og efter (nederst) nicotin ansøgning. Målestok:. 5 um (C) viser kvantificering af ændringerne i axonal FM1-43 fluorescens (F fald) efter nikotin behandling i fravær (WT) eller tilstedeværelse (WT + αBgTx) i α7 * nAChR-antagonist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: Time-lapse levende billeder af basal Fluo-4 / Ca2 + fluorescens langs vHipp axoner.
De time-lapse billeder af Fluo-4 / Ca2 + fluorescens langs vHipp axoner er erhvervet med en 60x objektiv vand linse hver 10 sek i 30 minutter med en roterende disk konfokal mikroskop. Erhvervede billeder blev angivet på pseudo farveskala og afspilles som en film på 2 billeder pr s. Denne film viser baseline af Fluo-4 / Ca2 + fluorescens aktivitet sammen lever WT vHipp axon perfunderet med HBS cocktail.
Supplerende Movie 2: Time-lapse levende billeder af nikotin induceret vedvarende Fluo-4 / Ca2 + fluorescens ad vHipp axoner.
De time-lapse billeder af Fluo-4 / Ca2 + fluorescens langs vHipp axoner er erhvervet med en 60x objektiv vand linse hver 10 sek i 30 minutter med en roterende disk konfokal mikroskop. Erhvervede billeder blev angivet på pseudo farveskala og afspilles som en film på 2 billeder pr sekund. Denne film viser nikotin (1 uM, perfunderet ind på tidspunkt 43, udvasket med HBS cocktail tidspunkt 49) inducerede Fluo-4 / Ca2 + fluorescens aktivitet sammen lever WT vHipp axon. Nikotin ansøgning øgede fluo-4 / Ca2 + fluorescensintensitet langs vHipp axoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forberedelse co-kultur beskrevet re-kapitulerer ventrale hippocampus-accumbens kredsløb i vitro. Denne forberedelse tillader forholdsvis enkel og pålidelig undersøgelse af de rumlige og tidsmæssige profiler, hvorved aktivering af præsynaptiske nAChRs fremkalder forbedrede glutamaterg transmission 5, 21.
Co-kulturer er defineret som væksten af forskellige specifikke celletyper i en skål, som kan give fysiologiske betingelser in vitro til at påvise in vivo-lignende funktion. Konventionelle neuron-neuron co-kulturer er blevet introduceret til neurovidenskabelig forskning til undersøgelse af synaptiske vekselvirkninger mellem forskellige celletyper. Det er imidlertid svært at identificere præ- og post-lokaliteter af synapser i disse co-kulturer. Denne microslice-dissocierede neuron co-kultur-protokollen tillader nem anerkendelse af præsynaptiske axoner og post-synaptiske mål. Brug af microslices fra forskellige hjerneområder of transgene mus, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner, kan denne protokol også anvendes til at undersøge Axon-Axon interaktioner.
Den kritiske trin i denne microslice-dissocierede neuroner co-kultur-protokollen er at tilvejebringe et stabilt miljø for at muliggøre fastgørelsen af eksplantater udvækst af fremspringene og dannelsen af synapser. Plating de microslices i et minimalt volumen af medier og opretholdelse dyrkningspladerne på dæmpede sterile gaze puder er de to vigtige skridt til microslice udlæg og synapse formation. Den væsentligste begrænsning af denne co-kultur-protokollen er, at ikke alle spredte NACC neuroner danner funktionelle synapser med vHipp axoner.
Ved at ændre genotypen af de før og efter synaptiske komponenter, dette præparat giver en informativ tilgang til at studere de præ- og post-synaptiske mekanismer synaptisk plasticitet. Tre forskellige funktioner i denne forberedelse gør den ideel til disse undersøgelser. Brain regioner, der normalt er forbundet in vivo via fiber stier, der ikke kan opretholdes, eller let identificeres i akutte skiver, kan kombineres i denne in vitro præparat. Præ- og post-synaptiske komponenter kommer fra forskellige mus gør tillader uafhængig ændring af enten før eller efter synaptisk genotype. Ved udpladning præ- og postsynaptiske komponenter på forskellige tidspunkter, er det muligt selektivt at udtrykke exogene gener i enten præ- eller post-synaptiske neuroner.
Nikotin induceret Ca2 + transienter (i sekunder til minutter interval) ved aktivering af nAChR'er er blevet rapporteret i dyrkede neuroner, astrocytter og i flere cellelinier, som udtrykker nAChRs 25-27. Men de fleste af disse undersøgelser ikke registrere de langsigtede virkninger (over 10 min) i kort tid nikotin eksponering i høj grad skyldes foto skader under langvarig billeddannelse. Ved at bruge kulturen ovenfor beskrevne protokol og hurtig spinning-disk konfokal billedsamling,nikotin induceret Ca2 + signalering, synaptisk vesikel fusion og glutamat frigivelse kan optages for op til 1 time uden nogen synlige skader på neuronerne (Supplemental Movie 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
