Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52730
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

Introduction

אפנון כולינרגית של רגישות מעגל תורם להיבטים בסיסיים של הכרה, ואפנון כולינרגית שינה הוא תכונה של הפרעות ניווניות ונוירו-פסיכיאטריים, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סכיזופרניה והתמכרות 1-4. מנגנון שנקבע בהנחיית כולינרגית של שידור הסינפטי במערכת העצבים המרכזית הוא באמצעות הפעלה ישירה של nAChRs המקומי באתרים מראש הסינפטי. הפעלה של קולטנים מראש הסינפטי אלה מובילה לעליית 2 + (i [Ca 2 +]) במסופים מראש הסינפטי Ca תאיים - הן במישרין, בשל מוליכות סידן גבוהות יחסית של תת מסוימים nAChR, ובעקיפין, באמצעות מפלי איתות תאיות 5, ובכך משפרים את שחרור הנוירוטרנסמיטר. למעשה, ההפעלה של nAChRs מראש הסינפטי נקשרה עם שינויים בשחרור של מגוון רחב של נוירוטרנסמיטורים כוללים גלוטמט, GABA, ACH,דופמין ND 6-10. למרות שתהליך זה נחקר באופן עקיף באמצעות שיטות אלקטרו בהסינפסות שונות, כתבים אופטיים של [Ca 2 +] i ומחזור שלפוחית ​​סינפטית לאפשר מדידה ישירה ובזמן מדויק יותר של תופעות קדם-סינפטי.

לוקליזציה טרום הסינפטי של nAChRs הודגמה באופן משכנע עם תיוג חיסוני זהב ישיר של nAChRs במיקרוסקופי אלקטרונים (EM) רמת 11,12. כמה טכניקות אחרות יש גם שימשו לטיפול בלוקליזציה nAChR בעקיפין, לרבות מיקומים של מפלצות חלבון פלואורסצנטי subunit- nAChRs גילוי בנוירונים בתרבית 13,14, הקלטת אלקטרו של זרמי nAChR במסופים הסינפטי 15,16, מעקב אחר שינויי ניקוטין מושרה ב[ Ca 2 +] i במסוף עצב הסינפטי על ידי הדמיה לחיות תא 17, וניטור עקיף של שחרור הנוירוטרנסמיטר במסוף הסינפטי על ידיטכניקות הדמיה תא חיות עם אינדיקטורים ניאון, כולל exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית שנצפה על ידי צבעי styryl amphipathic FM (FM1-43 וFM4-64) ו / או synapto-pHluorin ועל ידי כתבים ספציפיים ניאון עצבי, כגון CNiFERs לאח וiGluSnFr לגלוטמט 18-20. בסך הכל, גישות הנוכחיות אלה לזיהוי לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs הן מסובכות, ודורשות מערכות וטכניקות מיוחדות כדי לאפשר זיהוי אמין וניטור פיסיולוגי של פעילות טרום-סינפטי.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד למערכת שיתוף תרבות במבחנה של היפוקמפוס הגחון (vHipp) - גרעין נסמך (nAcc) מעגל המספק גישה ישירה לזהות ולנתח את שני מרכיבים של לפני ואחרי-סינפטי של העברת הסינפטית. אנחנו מראים דוגמאות של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs והדמית התא החי של nAChR תיווך Ca 2 + ALO איתות ושחרור הנוירוטרנסמיטרהאקסונים ng vHipp. המשך טבעי (וברור) של הפרוטוקול המובא כאן הוא ההכנה של אנשי קשר לפני ואחרי-סינפטי המורכב מתאי עצב מגנוטיפים שונים. באופן זה את התרומה של מוצר גן מסוים למראש ו / או פוסט-סינפטי מנגנונים של אפנון ניתן להעריך באופן ישיר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH פרסומי מס '80-23, מתוקן 2012) ולימודים אושרו על ידי מוסדי טיפול בבעלי חיים והשתמשו לועדות מחקר בסטוני אוניברסיטה ברוק (# -1618 ו# 1792).

1. vHipp-nAcc Synaptic שיתוף תרבויות

  1. עכברי קורבן (יום לידה 0 - 3, מwild-type (WT) או nAChRs α7 קו עכבר מהונדס) עם CO 2. לערוף כל גור ולשמור את הזנב בצינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגות לgenotyping בדיעבד. בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע מעוקר.
  2. הסר את החלק העליון של הגולגולת עם מספריים ומלקחיים כדי לחשוף את המוח כולו. החל בצומת שבו הקורטקס המוחי חלק מcaudally אחר, להשיג סעיף עטרה המכיל את קליפת המוח האחורי כולל vHipp 5,21 תחת מיקרוסקופ לנתח.
  3. לנתח נ 'רצועות באוקטובר יהוה רקמה המכילות את אזור CA1-subiculum לפי אטלס מוח עכבר 22 (איור 1 א) פיתוח. העברה לצלחת תרבות 35 מ"מ המכילה תקשורת הקרה תרבות (4 מעלות צלזיוס), לחתוך לפרוסות דקות קטנות (סביב 100 מיקרומטר × 100 מיקרומטר microslices).
  4. טרום דגירה פולי-D ליזין / coverslips זכוכית מצופה laminin 12 מ"מ בתוך 24 צלחות תרבית רקמה טובות עם תקשורת ותרבות (~ 500 μl) לפחות 30 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס. הסר תקשורת לפני ציפוי microslices.
  5. צלחת עם פיפטה פסטר אש מלוטשת במרכז coverslip עם כמות מינימאלית של תקשורת (~ 50 μl, המכילה ~ 20 חתיכות של microslices) כדי להקל על התקשרות של explants. microslices vHipp צלחת שמקורם בבעלי חיים בודדים (או + / + או - / - גנוטיפ של קו α7 המהונדס) על כל coverslip.
  6. לאחר explants להתיישב על coverslip, בעדינות להוסיף מדיה נוספת (~ 100 μl) על ידי הקיר דואר, כך שרמת התקשורת גבוהה מספיק כדי לכסות את explants בפריפריה לחלוטין, אבל לא אלה שבמרכז coverslip.
  7. לאחר דגירה O / N 37 ° C, 5% CO 2 באינקובטור, לפזר נוירונים nAcc מימים עובריים 18 לעכברי WT יום 1 לאחר לידה ולהוסיף לexplants.
    1. לנתח את רקמות nAcc לפי אטלס פיתוח מוח עכבר 20 (איור 1).
    2. לחתוך לחתיכות קטנות (כ -500 מיקרומטר × 500 מיקרומטר microslices) ולהעביר צינור 15 מיליליטר.
    3. פנק עם טריפסין 0.25% (2 מיליליטר) במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לשטוף נתחי רקמות שלוש פעמים עם תקשורת כביסה קרה (5 מיליליטר, 4 ° C) ואחריו לשטוף אחד בתקשורת והתרבות הקרה (5 מיליליטר, 4 ° C). לאפשר השעיה לנוח במשך 5 דקות בכל שלב לשטוף, ואז לשפוך את supernatant בזהירות.
    4. לנתק את התאים על ידי טחינה דקה עדינה ב 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות עם פיפטה פסטר קל אש מלוטשת.
    5. Transהשעיה תא FER לעוד צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 סל"ד x למשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים בתקשורת והתרבות ב1 מיליליטר לכל 6 גורים. לפזר תאים על ידי pipetting בעדינות בתקשורת כמה פעמים עם פיפטה פסטר אש מלוטשת.
    6. להוסיף 0.25 מיליליטר של תאי nAcc התפזרו לכל coverslip עם explants vHipp.
    7. לשמור על התרבויות ב37 ° C humidified, 5% CO 2 באינקובטור. הנח צלחות תרבות על פדה גזת סטרילי לחה כדי לייצב מכאני ולשמור על לחות, להקל היווצרות סינפסה.

2. Immunocytochemistry

  1. תקן תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) ב -4% סוכרוז paraformaldehyde / 4% / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 20 דקות, RT).
  2. תרבויות Permeabilize עם 0.25% Triton X-100 / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות, RT).
  3. תרבויות בלוק עם 10% חמורים בדם נורמלי בPBS (~ 500 μl לכל coverslip, 30 דקות, RT) לפני antibodצביעת y. דגירה עם נוגדנים עיקריים O / N ב 4 ° C. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: nAChRs אנטי (α 4 -ECD 1: 500; אנטי-α 5 יחידות משנה, 1: 500), טרנספורטר גלוטמט אנטי-לפוחי 1 (1: 250), אנטי-GAD65 (1: 100).
  4. לשטוף נוגדנים ראשוניים עם PBS (3 פעמים / ~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות) ולאחר מכן דגירה תרבויות בנוגדנים משני מצומדת לAlexa 488 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 500) או Alexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip , 1: 500) לשעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. דגירה התרבויות בαBgTx מצומדת לAlexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 1,000 בתקשורת והתרבות) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני הקיבוע לα7 משטח תיוג * nAChRs.
  6. coverslips הר והחותם.
  7. צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצוידים ביעדי התכנית-Apochromat (20X עם 0.8 NA או שמן 63X עם 1.4 NA) ומצלמת CCD.

3. FM1-43 מבוסס לפוחי Fusion

  1. לשמור על תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) בחדר הדמיה, הר קאמרי על ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק. ברציפות perfuse (1 מיליליטר / דקה) עם קוקטייל HBS ב RT.
  2. תפסיק תרבויות זלוף ועומס עם 10 מיקרומטר FM1-43 ב -56 מ"מ K + ACSF (~ μl 500) למשך 90 שניות (צביעה), לשטוף צבע חיצוני משם במשך 15 דקות עם Ca 2 + HBS החופשי המכיל ADVASEP-7 (0.1 מ"מ) כדי לחפש FM1-43 קרום הנכנס.
  3. לעורר את התרבויות עם 56 מ"מ K + ACSF (~ 500 μl) ללא FM1-43 עבור 120 שניות (destaining), טען תרבויות עם FM1-43 באמצעות אותם התנאים, ולשטוף שוב עם Ca 2 + HBS חופשי המכיל ADVASEP-7 ל 15 דקות.
  4. לרכוש FM1-43 תמונות הקרינה עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב מצוידים במטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטת 530 ננומטר) וללכוד תמונות עם מצלמת CCD.
  5. לאסוף תמונות הקרינה FM1-43 בסיס (כל 2 של דקות 1) כשליטה מראש ניקוטין; תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 2 שניות למשך 5 דקות.
  6. לכמת את עוצמת הקרינה לפני FM1-43 (צביעת F) ואחרי (destaining F) יישום ניקוטין בכל אוטון הסינפטי.
  7. חישוב סכום כולל של הקרינה FM1-43 releasable לאורך האקסונים vHipp ידי כימות ההבדל של עוצמת הקרינה FM1-43 לפני ואחרי יישום ניקוטין (ΔF = destaining -F צביעת F). לנתח כל חלק של ירידת עוצמת הקרינה לאחר ניקוטין עם המשוואה הבאה:% מכתים = ΔF / F F ירידה.

הדמיה 4. סידן

  1. יש לשטוף תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) במהירות עם HBS הנורמלי, לאחר מכן טען תרבויות עם 5 מחוון מיקרומטר Fluo-4 Ca 2 + (אסתר בבוקר) ושל 0.02% pluronic F-127 בHBS (2 מיליליטר) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. לשטוף את פתרון Fluo-4 עם HBS (3 פעמים / 5 דקות). חזור תרבויות לחממה (37 CO / 5% מעלות צלזיוס 2) לפחות 30 דקות.
  3. לשמור על תרבויות באותו תא ההדמיה ואותם תנאים כפי שתואר בסעיף FM1-43 היתוך לפוחי מבוסס (ראה שלב 3.1).
  4. לאסוף תמונות Fluo-4 הקרינה של תחזיות axonal ממייקרו-פרוסות vHipp עם מטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטה 530 ננומטר) ומצלמת CCD.
  5. לאסוף תמונות הקרינה Fluo-4 בסיס (כל 10 שניות למשך 2 דקות) כשליטה מראש ניקוטין, תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 10 שניות למשך 30 דקות.
  6. את כל המסגרות של התמונות גולמי fluo-4 הקרינה, יצוא כסדרה שלתמונות בפורמט TIFF לניתוח נוסף.
  7. לאסוף את עוצמת המשולבת של fluo-4 הקרינה לאורך האקסונים vHipp לפני ואחרי יישום ניקוטין.
  8. לנרמל עוצמת הקרינה משולבת עם המשוואה הבאה: ΔF / F 0 = (FF 0) / 0 F, כאשר F 0 הוא עוצמת הקרינה משולבת מראש ניקוטין מתוקן רקע וF הוא עוצמת הקרינה המשולבת לאורך האקסונים vHipp בכל נקודת זמן לאחר יישום ניקוטין. לנתח ולתכנן עוצמת הקרינה משולבת מנורמלת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההכנה המועסקות מורכבת משיתוף תרבויות גן chimeric של מעגלי vHipp-nAcc במבחנה. תחזיות נובעות מmicroslices vHipp, כקלט axonal מראש הסינפטי, יכולות ליצור קשרים סינפטיים עם מטרות פוסט-סינפטי, תאי העצב המפוזרים מnAcc. ניקוטין מושרה סיוע מתמשך (≥ 30 דקות) של שידור glutamatergic מהנוירונים nAcc מעוצבבים על ידי vHipp האקסונים 21 וממושך סידן איתות לאורך האקסונים vHipp 5 באמצעות α7 מראש הסינפטי * nAChRs.

איור 1 מדגים ישירות שהתחזיות ממייקרו-פרוסות vHipp הן glutamatergic (vGluT1 חיובי) ושקשר נעשים עם נוירונים קוצניים מפוזרים GABAergic בינוניים מnAcc (GAD חיובי, איור 1 ג, ד). nAChRs שני * α7 ולא α7 * (כולל תת-יחידות α4 וα5) נמצא לאורך האקסונים vHipp (איור 1E-G) ובמיוחד באתריםהיכן השלכות vHipp קשר עם הנוירונים nAcc. יש לציין כי תאי עצב מפוזרים מnAcc לא להביע nAChRs α7 * (איור 1H); כלומר אשכולות קולט באנשי קשר הם בהחלט presynaptic (איור 1 ט), גם ראה איור 1 בהפניה 5.

ברגע ששיתוף תרבויות chimeric הוקמו, הדמיה חיה של [Ca 2 +] i והסינפטי שלפוחיות היתוך לאורך האקסונים vHipp עם ו / או בלי ניקוטין ניתן להקליט עד 30 דקות ללא כל נזק נראה לעין לתאים העצב.

נציג תמונות, סרטי הזמן לשגות וquantifications למושרה ניקוטין fluo-4 [Ca 2 +] אני איתות לאורך האקסונים vHipp מוצגות באיור 2 ומשלימת סרט 1 ו -2. מצאנו כי ההפעלה של vHipp nAChRs ידי גורם ניקוטין ספגה Ca 2 + הזרם לתוך האקסונים מראש הסינפטי (איור 2 א, ד). השלב המתמשךעליות ניקוטין מושרה ב[ Ca 2 +] אני איתות לאורך האקסונים vHipp נחסם על ידי α7 הספציפיים * nAChR אנטגוניסט αBgTx אבל לא על ידי nAChR אנטגוניסט DHβE (2A-C איור) * שאינו α7.

הדמיה ישירה של אנדוציטוזה FM1-43 צבע פעילות תלויה וexocytosis נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר שחרור בעקיפין presynaptic הנוירוטרנסמיטר 23, 24. הנה, תמונות נציג וכימות להיתוך לפוחי מושרה ניקוטין לאורך האקסונים vHipp דמיינו ידי FM1-43 מוצגות באיור 3 (איור 3 א, ג). הנוכחות של α7 מראש הסינפטי * nAChRs נדרשת להיתוך מקסימאלי ניקוטין מושרה שלפוחית ​​ושחרור הנוירוטרנסמיטר (איור 3, C).

איור 1
איור שיתוף תרבות 1. Synaptic של vHipp עם nAcc מאפשרת examination של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs. (AC) קריקטורה סכמטי של במבחנה מעגלי גנוטיפ הספציפי (ג) שהוכנו על ידי ציפוי נפרד של ההיפוקמפוס / subiculum הגחון ().   פרוסות מWT או α7 בודדים - / - נוירונים עכבר ומפוזרים מגרעין נסמך WT (B). Aq, אמת מים (סילביוס); DG, gyrus המשונן; MM, גרעין הפיטמתיים המדיאלי; PMCo, גרעין posteromedial קליפת המוח אמיגדלה; RF, סדק rhinal, FMI, מלקחיים קטנים של הכפיס המוח; LV, חדר לרוחב; ט"ו, גבשושית חוש הריח; סמנכ"ל ,. Microslices (ד) vHipp pallidum הגחון להאריך תחזיות vGluT1 חיוביות (אדום) axonal שקשר עם GAD65 חיובי (ירוק) נוירונים nAcc (חיצים לבנים הם דוגמאות לאתרים אלה מגע). בר סולם: 10 מיקרומטר (E.-G) Micrographs נציג של אקסונים WT vHipp (צביעה עם vGluT1, ירוק) מוצג לα4 * nAChR (E), α5 * nAChR (F) וα7 משטח * nAChR (צביעת G) באשכולות אדומים (חצים לבנים). בר סולם:.. 5 מיקרומטר (H) אין α7 משטח * אשכולות nAChR על נוירונים GABAergic מפוזרים (GAD65 חיובי) מnAcc לבד "אשכולות" (אני) אדום של α7 משטח * nAChR (חיצים לבנים) שניתן לראות באלה נוירונים התפזרו שיתוף תרבותי עם microslices vHipp. בר סולם:. 5 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור שיתוף תרבות 2. Synaptic של vHipp עם nAcc מאפשרת בדיקה של אות סידן ניקוטין מושרהing לאורך האקסונים vHipp. () Fluo-4 נציג תמונות של סידן קשור fluo-4 בסולם צבעים פסאודו לאורך האקסון WT vHipp לפני (למעלה), 1 '(תיכון), ו -30' (תחתונה) לאחר יישום ניקוטין. השלב המתמשך (30 ') של 2 + התגובה מושרה ניקוטין Ca מתבטל על ידי תוספת של α7 * אנטגוניסט סלקטיבי nAChR αBgTx (100 ננומטר) (ב), אך לא על ידי התוספת של היריב שאינו α7 * nAChR סלקטיבית DHβE (1 מיקרומטר) (ג). בר סולם: 5 מיקרומטר עלילת נציג (D) של עוצמת הקרינה מנורמלת fluo-4 משולבת מהאקסון WT vHipp חי perfused עם ניקוטין (1 מיקרומטר) 1 דקות.. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור שיתוף תרבות 3. Synaptic של vHipp עם nAcc מאפשרת בחינה של שחרור ניקוטין מושרה לפוחי מוליך עצבי (עם FM1-43) לאורך האקסונים vHipp. (א) נציג תמונות של אקסונים WT vHipp (עמוסות FM1-43, ירוק) לפני (למעלה) ואחרי יישום ניקוטין (תחתון). (ב) נציג תמונות של אקסונים WT vHipp (עמוסות FM1-43, קודם לכן בα7 * אנטגוניסט nAChR סלקטיבית αBgTx במשך 15 דקות) לפני (ואחרי (יישום עליון) למטה) ניקוטין. בר סולם:. 5 מיקרומטר (C) מראה כימות של השינויים בקרינת FM1-43 axonal (ירידת F) לאחר טיפול ניקוטין בהעדר (WT) או נוכחות (WT + αBgTx) של α7 * אנטגוניסט nAChR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הזז 1
סרט נוסף 1: הדמיה חיה זמן לשגות של Fluo-4 הקרינה / Ca 2 + בסיס לאורך האקסונים vHipp.

התמונות של Fluo-4 הקרינה / Ca 2 + לאורך האקסונים vHipp הזמן לשגות נרכשו עם עדשת מים אובייקטיבית 60x כל 10 שניות למשך 30 דקות עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. תמונות שנרכשו היו מצויינים בקנה מידת צבע פסאודו ושיחקו בחזרה כסרט ב 2 מסגרות לים. סרט זה מציג את הבסיס של Fluo-4 / Ca 2 + פעילות הקרינה לאורך האקסון לחיות WT vHipp perfused עם קוקטייל HBS.

סרט 2
סרט נוסף 2: ההדמיה חיה זמן לשגות של הניקוטין המושרה ספגה Fluo-4 / Ca 2 + הקרינה לאורך האקסונים vHipp.

התמונות של Fluo-4 הקרינה / Ca 2 + לאורך האקסונים vHipp הזמן לשגות נרכשו עם עדשת מים אובייקטיבית 60x כל 10 שניות למשך 30 דקות עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. תמונות שנרכשו היו מצויינים בקנה מידת צבע פסאודו ושיחקו בחזרה כסרט ב 2 מסגרות לשנייה. סרט זה מראה ניקוטין (1 מיקרומטר, perfused בשלב 43 זמן, נשטף החוצה עם קוקטייל HBS בנקודת זמן 49) מושרה Fluo-4 / Ca 2 + פעילות הקרינה לאורך האקסון לחיות WT vHipp. יישום ניקוטין מוגבר fluo-4 / Ca 2 + עוצמת הקרינה לאורך האקסונים vHipp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנת שיתוף התרבות מתוארת מחדש נכנע מעגלים בהיפוקמפוס-נסמכים הגחון במבחנה. בחינת היתרי הכנה פשוטה יחסית ואמינה זה של פרופילי מרחב ובזמן שבו הפעלה של nAChRs מראש הסינפטי לעורר משופרת שידור glutamatergic 5, 21.

שיתוף תרבויות מוגדרות כצמיחת סוגי תאים ספציפיים שונים של במנה אחת שיכול לספק תנאים פיסיולוגיים במבחנה להפגין in vivo דמוי פונקציה. שיתוף תרבויות נוירון נוירון קונבנציונליים הוכנסו למחקר במדעי מוח לחקר האינטראקציות הסינפטי בין סוגי תאים שונים. עם זאת, קשה לזהות לפני ואחרי אתרים של סינפסות בשיתוף תרבויות אלה. פרוטוקול שיתוף תרבות נוירון ניתק microslice זה מאפשר זיהוי קל של אקסונים מראש הסינפטי ומטרות פוסט-סינפטי. microslices שימוש מאזורי המוח שונים oקו עכבר מהונדס F להביע חלבוני ניאון שונים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד אינטראקציות האקסון האקסון.

השלב הקריטי של פרוטוקול שיתוף תרבות נוירונים ניתק microslice זה מספק סביבה יציבה, כדי לאפשר את הקובץ המצורף של explants, תולדה של התחזיות והיווצרות של סינפסות. ציפוי microslices בנפח מינימאלי של תקשורת ושמירה על תרבות הצלחות על פדה גזת סטרילי לחה הן שני השלבים העיקריים לקובץ מצורף microslice והיווצרות סינפסה. המגבלה העיקרית של פרוטוקול שיתוף תרבות זו היא שנוירונים nAcc לא כל מפוזרים יוצרים סינפסות פונקציונליות עם אקסונים vHipp.

על ידי שינוי גנוטיפ של הרכיבים סינפטיים לפני ואחרי, הכנה זו מספקת גישה אינפורמטיבי ללמוד את המנגנונים לפני ואחרי-סינפטי של פלסטיות הסינפטית. שלוש תכונות ייחודיות של הכנה זו להפוך אותו אידיאלית ללימודים אלה. r המוחegions שבדרך כלל קשורים בvivo באמצעות נתיבי סיבים שלא יכול להישמר, או מזוהה בקלות בפרוסות חריפות, יכול להיות משולב במבחנת הכנה זו. לפני ורכיבי פוסט-סינפטי מגיעים מעכברים שונים הופכים מאפשרים שינוי עצמאי של כל אחד לפני או גנוטיפ פוסט-סינפטי. על ידי ציפוי רכיבים לפני ואחרי-סינפטי בזמנים שונים, שאפשר לבטא גנים אקסוגניים באו מראש או נוירונים פוסט-סינפטי באופן סלקטיבי.

ניקוטין מושרה Ca 2 + ארעיים (בשניות למגוון דקות) על ידי הפעלה של nAChRs דווח בנוירונים בתרבית, האסטרוציטים ובכמה שורות תאים המבטאים nAChRs 25-27. עם זאת, רוב המחקרים הללו לא לזהות את ההשפעות ארוכת הטווח (מעל 10 דקות) של חשיפה לניקוטין זמן קצר בעיקר בשל נזק תמונה במהלך הדמיה לטווח ארוך. על ידי שימוש בפרוטוקול התרבות שתואר לעיל ואוסף תמונת confocal ספינינג-דיסק מהיר,איתות ניקוטין מושרה Ca 2 +, איחוי שלפוחית ​​הסינפטית ושחרור גלוטמט ניתן להקליט במשך שעה עד 1 ללא כל נזק נראה לעין לתאי העצב (סרט נוסף 1, 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture Media (50 ml)
Neurobasal  GIBCO 10888022 48 ml
B-27 Supplements GIBCO 0080085-SA 1 ml
Penicillin-Streptomycin GIBCO 10908-010 0.5 ml
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061 0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) GIBCO 15140-122 20 ng/ml
2. washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red  GIBCO 14175-095 99 ml
HEPES ( 1M) GIBCO 15630-130 1 ml
3. HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
tetrodotoxin  Tocris 1078 2 µM
bicuculline Tocris 131 10 µM
D-AP-5 Tocris 105 50 µM
CNQX Tocris 1045 20 µM
LY341495 Tocris 1209 10 µM
5. Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl Sigma S9888 119 mM
KCl Sigma P9333 56 mM
MgSO4.7H Sigma M1880 1.3 mM
CaCl2 Sigma C1016 2.5 mM
NaH2PO4 Sigma S8282 1 mM
NaHCO3 Sigma S5761 26.2 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
  2. Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
  3. Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
  4. Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
  5. Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
  6. McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
  7. Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
  8. Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
  9. Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
  10. Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
  11. Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
  12. Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
  13. Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
  14. Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  15. Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
  16. Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
  17. Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
  18. Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  19. Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
  20. St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
  21. Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
  22. Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
  23. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  24. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
  25. Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
  26. Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
  27. Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).

Tags

Neuroscience גיליון 100 ניקוטין קולטן האצטילכולין ניקוטינית סידן הדמיה האקסונים presynaptic שחרור הנוירוטרנסמיטר שידור סינפטי
הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L.… More

Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter