Introduction
Kolinerge modulering av kretsen oppstemthet bidrar til grunnleggende aspekter av kognisjon, og endret kolinerge modulasjon er en funksjon av nevrodegenerative og nevropsykiatriske lidelser inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, schizofreni og avhengighet 1-4. En etablert mekanisme av kolinerge tilrettelegging av synaptisk transmisjon i CNS er via direkte aktivering av nAChR lokaliserte på presynaptiske nettsteder. Aktivering av disse pre-synaptiske reseptorer fører til økt intracellulær Ca 2 + ([Ca2 +] i) i presynaptiske terminaler - både direkte, på grunn av det relativt høye kalsium konduktansen av visse nAChR undertyper, og indirekte, via intracellulære signalkaskader 5, og dermed forbedre neurotransmitterfrigjørelse. Faktisk har aktiveringen av pre-synaptiske nAChR vært knyttet til endringer i frigjøring av en rekke neurotransmittere, inkludert glutamat, GABA, ACh, ennd dopamin 6-10. Selv om denne prosessen har vært undersøkt ved hjelp av indirekte metoder på forskjellige elektrofysiologiske synapser, optiske meldere av [Ca2 +] og gjenvinning av synaptiske vesikler tillate mer direkte og timelig nøyaktig måling av presynaptiske fenomener.
Pre-synaptisk lokalisering av nAChR-er er blitt vist overbevisende med direkte immuno-gull merking av nAChR-er ved elektronmikroskopi (EM) nivå 11,12. Flere andre teknikker har også blitt brukt til å adressere nAChR lokalisering indirekte, herunder å detektere plasseringen av nAChR-subunit- fluorescerende protein-kimeras i dyrkede nerveceller 13,14, elektro opptak av nAChR strømmer i synaptiske terminaler 15,16, overvåking nikotin induserte endringer i [Ca 2+] i som synaptiske nerveterminaler av levende celle bildebehandling 17, og indirekte overvåking av neurotransmitterfrigivning på den synaptiske terminalen vedlevende celle imaging teknikker med fluorescerende indikatorer, inkludert eksocytose av synaptiske vesikler så etter styryl amphipathic FM fargestoffer (FM1-43 og FM4-64) og / eller synapto-pHluorin og ved spesifikke fluorescerende neurotransmitter reportere, som CNiFERs for ACH og iGluSnFr for glutamat 18-20. Samlet disse nåværende fremgangsmåter for identifisering av pre-synaptisk lokalisering av nAChR-er kompliserte, og krever spesielle systemer og teknikker for å tillate pålitelig identifisering og overvåkning av fysiologiske pre-synaptisk aktivitet.
Her beskriver vi protokoller og utstyr for en in vitro co-kultur system av en ventral hippocampus (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) krets som gir direkte tilgang til å identifisere og analysere både pre- og postsynaptiske komponenter av synaptisk overføring. Vi viser eksempler på presynaptisk lokalisering av nAChR og live cell imaging av nAChR mediert Ca 2+ signal- og neurotransmitterfrigivning along vHipp aksoner. En naturlig (og grei) forlengelse av protokollen som presenteres her er utarbeidelsen av pre- og postsynaptiske kontakter består av nerveceller fra ulike genotyper. På denne måte bidrag av et spesielt genprodukt til pre- og / eller post-synaptiske mekanismer for modulering kan måles direkte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH publikasjoner nr 80-23, revidert 2012) og studier ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk for forskningsutvalget ved Stony Brook University (# 1618 og # 1792).
1. vHipp-NACC Synaptic Co-kulturer
- Offer mus (postnatal dag 0 - 3, fra villtype (WT) eller α7 nAChR transgen muse linje) med CO 2. Halshogge hver valp og lagre halen i en 1,5 ml sentrifugerør for post facto genotyping. Utfør følgende trinn i en sterilisert panseret.
- Fjern toppen av skallen med saks og pinsett for å avsløre hele hjernen. Starter på tidspunktet hvor cerebral cortex del fra hverandre caudally, få en koronale delen som inneholder de bakre cortices inkludert vHipp 5,21 under et dissekere mikroskop.
- Dissekere vHipp vev strimler inneholdende CA1-subiculum region i henhold til en utvikling av musehjerneatlas 22 (figur 1A). Overføring til en 35 mm kultur tallerken med kaldt kultur media (4 ° C), kuttet i små tynne skiver (rundt 100 mikrometer × 100 mikrometer microslices).
- Pre-inkuberes 12 mm poly-D-lysin / laminin-belagte dekkglass på innsiden 24 brønners vevskulturplater med kulturmedium (~ 500 ul) i minst 30 minutter i inkubator ved 37 ° C. Fjern media før plating microslices.
- Plate med en flammebehandlet Pasteur pipette i sentrum av dekkglass med minimal mengde medium (~ 50 ul, inneholdende ~ 20 stykker av microslices) for å forenkle feste av eksplantater. Plate vHipp microslices som stammer fra et enkelt dyr (enten + / + eller - / - genotype av den transgene linje α7) på hver dekkglass.
- Etter explants bosette på dekkglass, legge til ekstra media (~ 100 mL) forsiktig av the vegg slik at nivået av mediene er høy nok til fullstendig å dekke de eksplantater i periferien, men ikke de på midten av dekkglass.
- Etter en O / N inkubasjon i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator, spre NACC nevroner fra embryonale dager 18 til postnatal dag en WT mus og legge til explants.
- Dissekere ut NACC vev i henhold til et utviklings mus hjernen atlas 20 (figur 1B).
- Skjær i små biter (rundt 500 mikrometer × 500 mikrometer microslices) og overføring til en 15 ml tube.
- Behandl med 0,25% trypsin (2 ml) i 15 min ved 37 ° C. Vask vev biter tre ganger med kald vaskemedier (5 ml, 4 ° C), etterfulgt av en vask i kaldt kulturmedium (5 ml, 4 ° C). Tillat suspensjon hvile i 5 minutter i hvert vasketrinn, og deretter helle av supernatanten forsiktig.
- Distansere celler ved milde gniing i 2 ml dyrkningsmedier med en lett brann-polert Pasteur pipette.
- Transfer cellesuspensjon til en annen 15 ml rør og sentrifuger ved 2000 x rpm i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellene i kultur media på 1 ml per seks valper. Spre celler ved forsiktig pipettering i media flere ganger med en brann-polert Pasteur pipette.
- Legg 0,25 ml spredt NACC celler til hver dekkglass med vHipp eksplantater.
- Opprettholde kulturene i en fuktet 37 ° C, 5% CO 2 inkubator. Plasser kultur plater på fuktet sterilt gasbind pads til mekanisk stabilisere og vedlikeholde fuktighet, tilrettelegging synapse formasjon.
2. Immunocytochemistry
- Fix kulturer (5-7 dager in vitro) i 4% paraformaldehyde / 4% sukrose / PBS (~ 500 mL per dekkglass, 20 min, RT).
- Permeabilize kulturer med 0,25% Triton X-100 / PBS (500 ul pr ~ dekkglass, 5 min, RT).
- Block kulturer med 10% normal esel serum i PBS (~ 500 mL per dekkglass, 30 min, RT) før antibody farging. Inkuber med primære antistoffer O / N ved 4 ° C. Bruke følgende primære antistoffer: anti-nAChR-er (α 4 -ECD 1: 500, anti-α 5-subenheter, 1: 500), anti-vesikulært glutamat transportør 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
- Vask primære antistoffer ut med PBS (3 ganger / ~ 500 mL per dekkglass, 5 min) og deretter inkuberes kulturer i sekundære antistoffer konjugert til Alexa 488 (~ 500 mL per dekkglass, 1: 500) eller Alexa 594 (~ 500 mL per dekk , 1: 500) i 1 time ved 37 ° C.
- Inkuber kulturer i αBgTx konjugert med Alexa 594 (~ 500 ul pr dekkglass, 1: 1000 i kulturmedium) i 45 minutter ved 37 ° C før fiksering for merking av overflate α7 * nAChR-er.
- Mount og sel Dekk.
- Ta bilder med en fluorescens mikroskop utstyrt med Plan-Apochromat mål (20X med 0,8 NA eller 63X olje med 1,4 NA) og en CCD-kamera.
3. FM1-43 Basert Vesicular Fusion
- Opprettholde kulturer (5-7 dager in vitro) i en avbildningskammeret, montere kammer på spinner disken konfokalmikroskop. Kontinuerlig perfuse (1 ml / min) med HBS cocktail ved RT.
- Stopp perfusjon og last kulturer med 10 mm FM1-43 i 56 mM K + ACSF (~ 500 mL) for 90 sek (flekker), vaske ekstern fargestoff bort i 15 min med Ca 2+ gratis HBS inneholder ADVASEP-7 (0,1 mm) å skattemembranbundne FM1-43.
- Stimulere kulturer med 56 mM K + ACSF (~ 500 mL) uten FM1-43 for 120 sek (avfarging), laste kulturer med FM1-43 med de samme forholdene, og vaske igjen med Ca 2+ gratis HBS inneholder ADVASEP-7 for 15 min.
- Tilegne FM1-43 fluorescens bilder med spinnende disk confocal mikroskop utstyrt med en Plan-Apochromat objektiv (60x vann med 1,4 NA, eksitasjon 488 nm, emisjon 530 nm) og ta bilder med en CCD-kamera.
- Samle baseline FM1-43 fluorescens bilder (hver 2 s for 1 min) Som pre-nikotin-kontroll; anvende nikotin (1 mM) ved hurtig perfusjon (2 ml / min) i 1 min, og deretter vaske nikotin med HBS cocktail. Hold fange tids-lapse bilder før, under og etter nikotin søknad hvert 2 sek i 5 min.
- Kvantifisere FM1-43 fluorescensintensitet før (F farging) og etter (F avfarging) nikotin anvendelse ved hver synaptiske Bouton.
- Beregne total mengde frigjør FM1-43 fluorescens sammen vHipp axoner ved å kvantifisere forskjellen på FM1-43 fluorescens intensitet før og etter nikotin program (AF = F farging -F avfarging). Analyser brøkdel av fluorescens-intensiteten avta etter nikotin med følgende ligning: F =% reduksjon AF / F farging.
4. Kalsium Imaging
- Skyll kulturer (5-7 dager in vitro) raskt med normal HBS, deretter laste kulturer med fem mikrometer Fluo-4 Ca 2+ indikatoren (AM ester) og 0,02% Pluronic F-127 i HBS (2 ml) i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skyll Fluo-4 løsning med HBS (3 ganger / 5 min). Gå tilbake til kulturer inkubator (37 ° C / 5% CO2) i minst 30 min.
- Opprett kulturer i samme avbildning kammeret og samme betingelser som beskrevet i FM1-43 basert vesikulære fusjons seksjonen (se trinn 3.1).
- Samle Fluo-4 fluorescens bilder av aksonale anslag fra de vHipp mikro skiver med en Plan-Apochromat objektiv (60x vann med 1,4 NA, eksitasjon 488 nm, emisjon 530 nm) og en CCD-kamera.
- Samle baseline Fluo-4 fluorescens bilder (hver 10 sek i 2 min) som forhånds nikotin kontroll, gjelder nikotin (1 mM) ved hurtig perfusjon (2 ml / min) i 1 min, og deretter vaske nikotin med HBS cocktail. Hold fange tids-lapse bilder før, under og etter nikotin program hver 10 sek i 30 min.
- Lagre alle rammene av den rå fluo-4 fluorescens bilder, eksport som en serieTIFF format bilder for videre analyse.
- Samle den integrerte intensiteten av fluo-4 fluorescens sammen vHipp axoner før og etter nikotin søknad.
- Normaliser integrert fluorescensintensitet med følgende ligning: AF / F 0 = (FF 0) / 0 F, hvor F er 0 bakgrunnskorrigerte pre-nikotin integrert fluorescensintensitet og F er den integrerte fluorescensintensiteten langs vHipp aksoner på hvert tidspunkt etter nikotin søknad. Analysere og plotte normalisert integrert fluorescens intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utarbeidelse ansatt består av genet kimerisk co-kulturer av vHipp-NACC kretser in vitro. Anslag kommer fra vHipp microslices, som presynaptiske axonal innspill, kan gjøre synaptiske kontakter med postsynaptiske mål, de spredte nerveceller fra NACC. Nikotin induserte en vedvarende (≥ 30 min) tilrettelegging av glutamatergic overføring fra NACC nevroner innerverte av vHipp axoner 21 og langvarig kalsium signale sammen vHipp axoner 5 via presynaptiske α7 * nAChR.
Figur 1 viser direkte at anslagene fra vHipp mikro skivene er glutamatergic (vGluT1 positiv), og at kontaktene er laget med spredte gabaergic mellom spiny nevroner fra NACC (GAD positive, figur 1C, D). Både α7 * og ikke-α7 * nAChR (inkludert α4 og α5 subenheter) ble funnet langs vHipp axoner (figur 1E-G) og spesielt på stederhvor vHipp anslag kontakt NACC nevroner. Det bør bemerkes at dispergerte nerveceller fra NACC ikke uttrykker α7 * nAChR-er (figur 1 H); dvs. reseptoren klynger på kontaktene er strengt presynaptisk (Figur 1I), se også figur 1 i Reference 5.
Når kimære co-kulturer har blitt etablert, live avbildning av [Ca 2+] i og synaptisk blemmer fusjon sammen vHipp axoner med og / eller uten nikotin kan registreres i opptil 30 minutter uten noen åpenbar skade på nerveceller.
Representative bilder, tids lapse filmer og quantifications for nikotin-indusert fluo-4 [Ca 2+] i signale sammen vHipp aksoner er vist i figur 2 og Opplysning Movie 1 og 2. Vi fant at aktivering av vHipp nAChR av nikotin induserer vedvarende Ca 2+ innstrømning i presynaptiske aksoner (figur 2A, D). Den vedvarende faseav nikotin indusert økning i [Ca 2+] i signalanlegg langs vHipp axoner ble blokkert av den spesifikke α7 * nAChR antagonist αBgTx men ikke av den ikke-α7 * nAChR antagonist DHβE (Figur 2A-C).
Direkte visualisering av aktivitetsavhengig FM1-43 fargestoff endocytose og exocytose har blitt brukt til å overvåke indirekte presynaptisk neurotransmitterfrigjørelse 23, 24. Her er representative bilder og kvantifisering for nikotin-induserte vesikulære fusjons langs vHipp aksoner visualisert ved FM1-43 vist i figur 3 (figur 3A, C). Tilstedeværelsen av presynaptiske α7 * nAChR-er nødvendig for maksimal nikotin indusert vesikkelfusjon og nevrotransmitter-frigjøring (figur 3B, C).
Figur 1. Synaptic co-kultur vHipp med NACC tillater examinatioN av presynaptisk lokalisering av nAChR-er. (AC) Skjematisk karikatur av genotype-spesifikke in vitro-kretser (C) fremstilt ved separat plettering av ventral hippocampus / subiculum (A). skiver fra en individuell WT eller α7 - / - mus og spredt nerveceller fra WT nucleus accumbens (B). Aq, akvedukten (Sylvius), DG, dentate gyrus, MM, medial mammillary kjernen; PMCO, posteromediale kortikal amygdaloid kjernen; rf, rhinal sprekken, FMI, tang mindre av corpus callosum, LV, lateral ventrikkel, Tu, olfactory tuberkel, VP , ventral pallidum. (D) vHipp microslices forlenge vGluT1 positive (røde) aksonale anslag som kontakter GAD65 positive (grønn) NACC nevroner (hvite piler er eksempler på slike kontaktsider). Skala: 10 mikrometer (E.-G) Representative mikrofotografier av WT vHipp aksoner (farving med vGluT1, grønn) er vist for α4 nAChR * (E), α5 * nAChR (F) og overflate α7 * nAChR (G) i røde flekker klynger (hvite piler). Skala:.. 5 um (H) Det er ingen overflate α7 * nAChR klynger på dispergerte GABAergiske nevroner (GAD65 positiv) fra NACC alene (I) Red "klaser" av overflate α7 * nAChR (hvite piler) kan sees i disse spredt nevroner co-kultivert med vHipp microslices. Skala:. 5 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Synaptic co-kultur vHipp med NACC tillater undersøkelse av nikotin indusert kalsium signaling sammen vHipp aksoner. (A) Representative fluo-fire bilder av kalsium bundet fluo-4 i pseudo fargeskala langs en WT vHipp axon før (øverst), 1 '(midten), og 30' (Bottom) etter nikotin søknad. Den vedvarende fase (30 ') av den nikotin-induserte Ca2 + responsen elimineres ved tilsetning av α7 * nAChR selektiv antagonist αBgTx (100 nM) (B), men ikke ved tilsetning av de ikke-α7 * nAChR selektiv antagonist DHβE (1 pM) (C). Skala: 5 mikrometer (D) Representant tomt på normalisert fluo-fire integrerte fluorescens intensitet fra en live WT vHipp axon dynket med nikotin (1 mm) i 1 min.. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Synaptic co-kultur vHipp med NACC tillater undersøkelse av nikotin indusert vesicular neurotransmitterfrigivning (med FM1-43) sammen vHipp aksoner. (A) Representative bilder av WT vHipp axoner (lastet med FM1-43, grønn) før (øverst) og etter (nederst) nikotin søknad. (B) Representative bilder av WT vHipp axoner (lastet med FM1-43, forbehandlet med α7 * nAChR selektiv antagonist αBgTx i 15 minutter) før (øverst) og etter (nederst) nikotin søknad. Skala:. 5 mikrometer (C) viser kvantifisering av endringene i aksonal FM1-43 fluorescens (F reduksjon) etter nikotin behandling i fravær (WT) eller tilstedeværelse (WT + αBgTx) av α7 * nAChR antagonist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Opplysning Movie 1: Time-lapse levende avbildning av basal Fluo-4 / Ca 2+ fluorescens sammen vHipp aksoner.
Time-lapse bilder av Fluo-4 / Ca 2+ fluorescens sammen vHipp axoner ble kjøpt med et 60x objektiv vann linser hver 10 sek i 30 min med en spinnende disk confocal mikroskop. Ervervet bildene ble vist på pseudo fargeskala og spilles av som en film på to bilder per s. Denne filmen viser baseline av Fluo-4 / Ca 2+ fluorescens aktivitet langs leve WT vHipp axon dynket med HBS cocktail.
Opplysning Movie 2: Time-lapse levende avbildning av nikotin indusert vedvarende Fluo-4 / Ca 2+ fluorescens sammen vHipp aksoner.
Time-lapse bilder av Fluo-4 / Ca 2+ fluorescens sammen vHipp axoner ble kjøpt med et 60x objektiv vann linser hver 10 sek i 30 min med en spinnende disk confocal mikroskop. Ervervet bildene ble vist på pseudo fargeskala og spilles av som en film på to bilder per sekund. Denne filmen viser nikotin (1 mikrometer, dynket i på tidspunkt 43, vasket ut med HBS cocktail på tidspunkt 49) indusert Fluo-4 / Ca 2+ fluorescens aktivitet langs leve WT vHipp axon. Nikotin søknad økte fluo-4 / Ca 2+ fluorescensintensitet langs vHipp aksoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utarbeidelse co-kultur beskrevet re-kapitulerer ventral hippocampus-accumbens kretser in vitro. Dette preparatet tillatelser relativt enkel og pålitelig undersøkelse av romlige og tidsmessige profiler der aktivering av presynaptiske nAChR framprovosere forbedrede glutamaterg girkasse 5, 21.
Ko-kulturer er definert som veksten av forskjellige spesifikke celletyper i en skål som kan gi fysiologiske betingelser in vitro for å demonstrere in vivo-lignende funksjon. Konvensjonelle nevron-nevroner co-kulturer har blitt introdusert til nevrovitenskap forskning for å studere synaptiske interaksjoner mellom ulike celletyper. Det er imidlertid vanskelig å identifisere pre- og post områder av synapser i disse co-kulturer. Dette microslice-dissosiert nevron co-kultur-protokollen gir enkel anerkjennelse av de presynaptiske axoner og postsynaptiske mål. Bruke microslices fra ulike områder av hjernen of transgen muselinje som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner, kan denne protokollen også brukes til å studere axon-axon interaksjoner.
Det kritiske trinnet i denne microslice-neuroner dissosiert ko-kultur-protokollen er å gi et stabilt miljø for å tillate feste av eksplantater, utvekst av fremspringene og dannelsen av synapser. Plating de microslices i et minimalt volum av media og vedlikehold av kulturplater på fuktet sterilt gasbind pads er de to viktigste trinnene for microslice vedlegg og synapse formasjon. Den største begrensningen av denne co-kultur-protokollen er at ikke alle spredt NACC nevroner danner funksjonelle synapser med vHipp aksoner.
Ved å endre genotypen av pre- og post-synaptiske komponenter, gir dette preparat en informativ måte å studere pre- og post-synaptiske mekanismer for synaptisk plastisitet. Tre forskjellige funksjonene i dette preparatet gjør det ideelt for disse studiene. Brain regions som er normalt koblet i vivo via fiberbaner som ikke kan opprettholdes, eller kan lett identifiseres i akutte skiver, kan kombineres i denne in vitro-preparatet. Pre- og postsynaptiske komponentene kommer fra forskjellige mus gjør at uavhengig endring av enten før eller etter synaptisk genotype. Ved utsåing av pre- og post-synaptiske komponenter til forskjellige tider, er det mulig selektivt å uttrykke eksogene gener i enten pre- eller post-synaptiske neuroner.
Nikotin indusert Ca 2 + transienter (i sekunder til minutter range) ved aktivering av nAChR er rapportert i dyrkede nerveceller, astrocytter og i flere cellelinjer som uttrykker nAChR 25-27. Men de fleste av disse studiene ble det ikke konstatert langtidseffekter (over 10 min) for kort tid nikotin eksponering i stor grad på grunn av bildet skade under langsiktig bildebehandling. Ved hjelp av kulturen protokollen beskrevet ovenfor og konfokalt bilde samling hurtig roterende-skive,Nikotin indusert Ca 2+ signalering, synaptisk vesikkelfusjon og glutamat utgivelsen kan registreres i inntil 1 time uten noen åpenbar skade på nervecellene (Opplysning Movie 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
